La dispensa - CusMiBio

Approfondimento. Il sequenziamento del DNA
Fino a oggi è stato sequenziato il genoma di molti organismi (incluso l’uomo). Questa importante
conquista non sarebbe stata possibile senza lo sviluppo di efficienti metodi di sequenziamento,
potenziati su larga scala dall’automazione.
Alla fine degli anni ’70 la messa a punto del metodo enzimatico, o del dideossi-DNA, ha permesso di
sequenziare in modo semplice e veloce qualunque frammento di DNA purificato. Questo metodo si
basa sull’uso dei dideossiribonucleosidi trifosfati, cioè di ribonucleosidi che non possiedono il gruppo
ossidrile 3’ (Fig. 1).
Deoxyribonucleoside triphosphate
Deossiribonucleotide trifosfato
Fig.1
Dideoxyribonucleoside triphosphate
Dideossiribonucleotide trifosfato
P
P
P
5’
O CH2
O
Base
P
P
P
O
5’
CH2
O
Base
3’
3’
OH
Allows strand extension
Permette l’allungamento del
filamento
at 3’ end
all’estremità 3’
Impedisce l’allungamento
Prevents strand
del filamento all’estremità 3’
extension at 3’ end
Singoli filamenti della molecola di DNA che deve essere sequenziata (Fig. 2, in grigio) sono posti in
provetta in presenza di DNA polimerasi, di un breve primer (a quadretti) in grado di attivare la DNA
polimerasi per iniziare la sintesi del DNA e dei quattro deossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dCTP,
dGTP e dTTP: A, C, G e T).
Nella miscela di nucleotidi è però presente anche un dideossiribonucleotide analogo a uno di questi
(ddATP, in grassetto) che può essere quindi incorporato nella catena di DNA in formazione. Ma a
questa catena, che non ha un gruppo 3’ OH alla sua estremità, non possono essere aggiunti ulteriori
nucleotidi. Così la catena del DNA si arresta a questo punto. Nell’esempio illustrato nella Fig. 2, nella
miscela nucleotidica è stata aggiunta una piccola quantità di dideossiATP (ddATP), simbolizzato da
una A più grande. Il ddATP compete con il deossiATP normale in eccesso (dATP, simbolizzato con
una A), così che il ddATP è incorporato solo occasionalmente e a caso nel filamento di DNA in
formazione. Alla fine questa miscela di reazione produrrà una serie di molecole di DNA di differenti
lunghezze, tutte complementari al DNA stampo che deve essere sequenziato e tutte con un’estremità
terminale A. L’esatta lunghezza dei prodotti della sintesi del DNA può quindi essere utilizzata per
determinare la posizione di ciascuna A nella catena in crescita.
Per determinare la sequenza completa del frammento di DNA, il filamento a doppia elica è dapprima
separato nei suoi filamenti singoli e uno di questi è usato come stampo per il sequenziamento.
26