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Fig. 3 5’ GCATATGTCAGTCCAGG 3’ 3’ 5’ CGTATACAGTCAGGTC DNA a doppio filamento 5’ GCAT 3’ 3’ 5’ CGTATACAGTCAGGTC + ddATP +DNA polimerasi + ddTTP +DNA polimerasi + eccesso di dATP dTTP dCTP dGTP + ddCTP +DNA polimerasi + ddGTP +DNA polimerasi GCAT A GCAT AT GCAT ATGTC GCAT ATG GCAT ATGTCA GCAT ATGT GCAT ATGTCAGTC GCAT ATGTCAG GCAT ATGTCAGTCCA GCAT ATGTCAGT GCAT ATGTCAGTCC GCAT ATGTCAGTCCAG La sequenza di DNA letta direttamente dal basso verso l’alto è: ATGTCAGTCCAG 1 12 A T C G 28
6.2 Analisi dei dati di sequenza La predizione degli effetti di una mutazione missense a livello della struttura della proteina è un processo complesso, in cui bisogna tenere conto di tutte le caratteristiche degli amminoacidi della catena proteica e delle loro reciproche interazioni. Attualmente sono disponibili alcuni programmi (come SwissPdbViewer, scaricabile gratuitamente alla pagina http://www.expasy.org/spdbv/text/download.htm), in grado di elaborare tutti questi dati e fornire una previsione di come la mutazione influenzerà la struttura tridimensionale della proteina. Il sequenziatore automatico fornisce dei file di dati che possono essere visualizzati sotto forma di elettroferogrammi (Fig. 6.2) grazie a programmi specifici come MT-Navigator (Applied Biosystems). La successione dei picchi che compongono l’elettroferogramma è il risultato della rilevazione della fluorescenza emessa dai fluorocromi legati ai quattro ddNTPs utilizzati nelle reazioni di sequenza. Ad ogni fluorocromo, e quindi a ciascun nucleotide, è convenzionalmente associato un colore diverso (A=verde, T=rosso, C=blu, G=nero), facilitando così la lettura della sequenza. Le sequenze di riferimento per il confronto possono essere ottenute dalla banca dati del National Center for Biotechnology Information (NCBI, sito internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Fig. 6.2. Esempio di elettroferogramma. Le singole mutazioni sono riconoscibili in base a pattern di picchi diversi. Le sostituzioni di un singolo nucleotide o più nucleotidi si riconoscono perché il campione presenta in quello specifico punto picchi di colore diverso corrispondenti alle basi sostituite. Come si vede nella figura 6.3 a), nel probando il picco della C è stato sostituito da quello di una G. In questo caso si tratta di un individuo omozigote per questa mutazione, infatti è presente un solo picco. In eterozigosi una sostituzione si presenta come nella figura 6.3 b), con due picchi sovrapposti corrispondenti ai due alleli, mutato e wild-type. 29
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