Case report - Blood Transfusion

Case report
An unusual case of Rhesus system
materno-foetal alloimmunisation
Mauro Waldner, Gina Rossetti, Paola Boccagni, Massimo Ripamonti
Servizio Immunoematologia e Trasfusione, Ospedale Santa Chiara, Trento, Italia
Introduction
After the antigens of the ABO system, those of
the Rhesus (Rh) system constitute the most common
cause of materno-foetal alloimmunisation and,
together with the antigens of the Kell system, are the
most frequent factors responsible for haemolytic
disease of the newborn (HDN) 1 which, until 50 years
ago, led to the death of 150 neonates in every 100,000 2 .
The introduction of anti-D serum prophylaxis for
Rh negative women at risk of alloimmunisation, the
decrease in the number of repeated pregnancies in the
female population and the resources of modern
transfusion medicine, in particular efficient
immunohaematological diagnosis, have drastically
reduced the incidence of these tragic events.
Nevertheless, there are still occasional situations
which are not easily interpreted. We describe an
unusual case of apparent materno-foetal
alloimmunisation.
Materials and methods
Blood group system antigens, Rh phenotypes and
antiglobulin tests (both direct and indirect) were
performed using a "BioVue®" micro-column
agglutination system (Ortho-Clinical Diagnostics,
Raritan, NJ, USA). Antibodies were identified with
Received: 26 April 2005 - Accepted 28 May 2005
Correspondence:
Dott. Massimo Ripamonti
Servizio Immunoematologia e Trasfusione, Ospedale Santa Chiara
Largo Medaglie d'Oro 2
38100 Trento, Italia
E-mail: massimo.ripamonti@apss.tn.it
Introduzione
Dopo gli antigeni del sistema ABO, quelli del
sistema Rh costituiscono la più comune causa di
alloimmunizzazione materno-fetale e sono, con gli
antigeni del sistema Kell, i più frequenti
corresponsabili della malattia emolitica del neonato
(MEN) 1 che, fino a 50 anni fa, era la causa di morte di
150 nati su 100.000 2 .
L'introduzione della sieroprofilassi anti-D nelle
puerpere Rh negative a rischio di alloimmunizzazione,
la diminuzione del numero delle ripetute gravidanze
nella popolazione femminile, le risorse della moderna
medicina trasfusionale, in particolare una
efficace diagnostica immunoematologica, hanno
drasticamente ridotto l'incidenza di questi infausti
eventi.
Tuttavia capita ancora, occasionalmente, di
osservare situazioni insolite che non si prestano ad
una semplice interpretazione. Nel seguente articolo
descriviamo l'evoluzione di un'apparente
alloimmunizzazione materno-fetale che ci è apparsa
alquanto insolita.
Materiali e metodi
Per la determinazione dei gruppi sanguigni, dei
fenotipi Rh e dei test all'antiglobulina (sia diretti che
indiretti) è stato utilizzato il sistema su microcolonna
(CAT) "BioVue®" (Ortho-Clinical Diagnostics,
Raritan, NJ, USA). Le identificazioni anticorpali sono
state eseguite con pannelli eritrocitari normali e ficinati
Ortho e Immucor (Gamma Biologicals Inc, Houston,
TX, USA). Le procedure di adsorbimento ed eluizione
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the aid of Ortho and Immucor normal and ficin-treated
red cell panels (Gamma Biologicals Inc, Houston, TX,
USA). The adsorption and elution procedures (Elu
Kit II, Gamma Biologicals Inc), antibody titration,
and reactivity enhancement were carried out according
to the indications in the Technical Manual of the
AABB 3 and the instructions provided by the
companies producing the diagnostic materials.
Case report
In March 1999, at the start of her first pregnancy,
the 24-year old patient, FE, underwent blood group
typing at our Transfusion Service. She was found to
be group A, RhD negative, with a ccdee phenotype.
Antibody screening carried out contemporaneously
by an indirect antiglobulin test (IAT) was negative. A
second test during the 20 th week of pregnancy
confirmed the absence of irregular antibodies. In
September (in the 36 th week of pregnancy), an anti-E
antibody was identified; this antibody reacted only
with undiluted serum.
Since the woman's husband was group B, RhD
positive, with a ccDEE phenotype, the patient was
monitored frequently in order to intervene quickly,
should the antibody titre increase significantly. In
October, as the woman reached term, a second
antibody with anti-D specificity at a titre of 1:4 was
identified in the absence of passive
immunoprophylaxis and, therefore, presumed to be
due to early materno-foetal alloimmunisation. A few
days later the woman delivered a neonate, FO, with
group O RhD positive, ccDEe phenotype. The neonate
had a negative direct antiglobulin test (DAT) and no
clinical complications.
Given the alloimmunisation, anti-D
immunoprophylaxis was not administered, but the
woman was advised to undergo an
immunohaematological control six months later,
which confirmed the presence of only the anti-D
antibody at a titre of 1:2.
From October 2001, in a series of frequent controls
during her second pregnancy the patient showed,
unlike during the first pregnancy, both anti-D and anti-
E antibodies at low titres, which could only be detected
with red cells pretreated with proteolytic enzymes;
the anti-E antibody disappeared in the 35 th week,
leaving just the anti-D antibody which reacted only
with enzyme pretreatment, with a 2+ score.
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(Elu Kit II, Gamma Biologicals Inc), di titolazioni
anticorpali, di potenziamento delle reattività sono state
condotte secondo le indicazioni del Technical Manual
dell'AABB 3 e delle ditte produttrici dei materiali
diagnostici.
Descrizione del caso
Nel marzo 1999, all'inizio della sua prima
gravidanza, la paziente FE di 24 anni, effettuò presso
il nostro Servizio Trasfusionale la determinazione del
gruppo sanguigno (A Rh, D negativo, fenotipo ccdee)
e lo screening anticorpale (effettuato con test indiretto
all'antiglobulina, TIA), risultato negativo. Un secondo
controllo alla ventesima settimana di gestazione
confermò l'assenza di anticorpi irregolari; nel mese
di settembre (alla 36 a settimana di gestazione) venne
identificato un anticorpo con specificità anti-E,
reattivo solo con siero indiluito.
Essendo il coniuge di gruppo B Rh, D positivo,
fenotipo ccDEE, si eseguirono controlli ravvicinati
per intervenire tempestivamente nell'eventualità di un
incremento significativo del titolo anticorpale. Nel
successivo mese di ottobre, in prossimità del parto,
fu evidenziato un secondo anticorpo con specificità
anti-D, a titolo 1:4, in assenza di immunoprofilassi
passiva e, quindi, presumibilmente imputabile a
un'iniziale alloimmunizzazione materno-fetale.
Pochi giorni dopo la donna partorì un neonato, FO,
di gruppo O RhD positivo, fenotipo ccDEe, con test
diretto all'antiglobulina (TDA) negativo e nessuna
complicanza clinica.
Vista l'alloimmunizzazione, non fu eseguita
l'immunoprofilassi anti-D, ma venne consigliato un
controllo immunoematologico a distanza di sei mesi,
che confermò la presenza del solo anticorpo anti-D a
titolo 1:2.
Dall'ottobre 2001, durante il decorso della sua
seconda gravidanza e diversamente dalla prima
gestazione, la paziente FE presentò, in una serie di
controlli ravvicinati, l'associazione degli anticorpi
anti-D ed anti-E a basso titolo, rilevabili
esclusivamente con emazie pretrattate con enzimi
proteolitici; l'anticorpo anti-E scomparve alla 35 a
settimana, permanendo il solo anticorpo anti-D
reattivo in enzimi, con score 2+.
Anche il secondo figlio di FE, di gruppo A Rh D
positivo, fenotipo ccDEe, presentò alla nascita un
TDA negativo e nessun sintomo di MEN.
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Unusual case of Rh alloimmunisation
The patient's second child, group A, RhD positive,
ccDEe phenotype, had a negative DAT at birth and
no symptoms of HDN.
Finally, during the patient's third pregnancy, which
began in April 2004, the serum was found to contain
only an anti-D antibody, weakly reactive in the
antiglobulin test until the 25 th week of the pregnancy,
and subsequently reactive only in the tests carried out
with enzyme pretreatment. This third child, group AB,
RhD positive, ccDEe phenotype, also had a negative
DAT at birth and no symptoms of HDN.
After having isolated the specific maternal
antibody by absorption and elution from the natural
ABO isoagglutinins, further investigations excluded
anti-LW specificity and demonstrated that the
antibody reacted with both the husband's red cells
(R 2
R 2
, score 4+) and those of the third child (R 2
r, score
1+).
The anti-D specificity was subsequently confirmed
with a 16-cell identification panel.
The antibody class was ascertained with
monospecific anti-IgG serum, excluding components
of the IgM class. The reaction gave optimum results
at a temperature of 37 °C.
Conclusions
It is not easy to draw conclusions from the case
presented. Certainly, the prolonged period of
observation over three successive Rh incompatible
pregnancies, allows no doubt about the repeatedly
confirmed antibody specificity. Since there is no
evidence of unknown biological mechanisms able to
inhibit the evolution of active alloimmunisation
against the antigens of the Rh system during repeated
Rh incompatible pregnancies, we cannot exclude that,
in reality, there was actually no active immunisation
and that the weak anti-D and anti-E antibodies could
be explained by the improbable, but possible, presence
of natural antibodies of unknown origin. This
hypothesis is supported by the early onset of the anti-
E antibody, which strangely preceded that of the anti-
D antibody, during the first pregnancy, when the D
antigen is widely recognised to be much more
immunogenic than the E antigen. The subsequent
unexplained disappearance of the anti-E antibody
would also support this theory.
It is, however, more difficult to accept the
hypothesis that also the anti-D antibody could be
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Infine, nel corso della terza gravidanza, iniziata
nell'aprile 2004, si rilevò la presenza nel siero del solo
anticorpo anti-D debolmente reattivo con test
dell'antiglobulina fino alla 25 a settimana, e
successivamente reattivo soltanto nei test eseguiti con
enzimi.
Anche il terzo figlio di FE di gruppo AB Rh, D
positivo, fenotipo ccDEe, presentava alla nascita un
TDA negativo e nessun sintomo di MEN.
Dopo aver isolato la specificità anticorpale materna
mediante adsorbimento ed eluizione dalle
isoagglutinine naturali ABO, ulteriori accertamenti
esclusero la specificità anti-LW ed evidenziarono la
reattività dell'anticorpo sia con gli eritrociti del
coniuge (R 2
R 2
, score 4+) che con quelli del terzogenito
(R 2
r, score 1+).
La specificità anti-D venne confermata di seguito
con un pannello di identificazione a 16 cellule.
La classe anticorpale venne accertata con sieri
monospecifici anti-IgG, escludendo componenti di
classe IgM. L'optimun termico di reazione risultò
essere a 37 °C.
Conclusioni
Non è semplice trarre delle conclusioni nel caso
proposto. Peraltro, il prolungato periodo di
osservazione nel corso di tre successive gravidanze
Rh incompatibili non lascia dubbi relativi alle
specificità anticorpali ripetutamente confermate.
Ora, non essendovi alcuna evidenza relativa a
ignoti meccanismi biologici in grado di inibire
l'evoluzione di un'alloimmunizzazione attiva contro
gli antigeni del sistema Rh nel corso di ripetute
gravidanze Rh incompatibili, non possiamo escludere
che, in realtà, non si sia verificata alcuna
immunizzazione attiva e che i deboli anticorpi anti-D
ed anti-E si possano spiegare con l'improbabile, ma
possibile, presenza di anticorpi naturali di origine
misconosciuta.
A favore di questa possibilità sussiste l'insorgenza
precoce dell'anticorpo anti-E, che ha stranamente
preceduto quella dell'anticorpo anti-D, nel corso della
prima gravidanza, quando notoriamente l'antigene D
è molto più immunogeno dell'antigene E. Anche la
successiva immotivata scomparsa dell'anti-E potrebbe
avvalorare questa tesi.
Più difficile è accettare l'ipotesi che anche
l'anticorpo anti-D possa essere naturale e non immune.
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M Waldner et al.
naturally occurring and not an immune response.
However, there are published reports of rare cases of
D- negative males, not immunised by transfusions,
with anti-D serum alloantibodies 4,5 .
In any case, after having excluded what seemed
probable and obvious, we can do nothing but accept
the improbable and use Issitt's words related to the
complex, still unresolved problems of the Rh system,
"we can only add Amen" 6 .
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Giorgio Assali for his
precious advice and help with this manuscript and all
the Staff of the Immunohaematology Laboratory of
our Transfusion Service for their valuable work.
Tuttavia l'esistenza di rari soggetti D- negativi di sesso
maschile, non immunizzati da trasfusioni, che presentano
nel siero alloanticorpi anti-D è riferita in letteratura 4,5 . In
ogni caso, dopo aver escluso ciò che appariva probabile
ed evidente, non possiamo che accettare ciò che appare
improbabile, facendo nostre le parole di Issitt relative
alle complesse problematiche ancora irrisolte del sistema
Rh, "we can only add Amen" 6 .
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare il Dott. Giorgio Assali per
i suoi preziosi consigli e l'aiuto nella stesura del
manoscritto e tutto lo Staff del laboratorio di
Immunoematologia del nostro Servizio Trasfusionale
per il prezioso lavoro svolto.
References
1) Scott ML. Monoclonal anti-D for immunoprophylaxis. Vox
Sang 2001; 81: 213-8.
2) Bowman JM. RhD haemolytic disease of the newborn. N
Engl J Med 1998; 339: 1775-7.
3) Brecher ME (Editor in Chief). Technical Manual. 14th
ed., Bethseda, MD, AABB; 2003.
4) Contreras M, De Silva M, Teesdale P, Mollison PL. The effect
of naturally occurring Rh antibodies on the survival of
serologically incompatible red cells. Br J Haematol 1987;
65: 475-8.
5) Algora M, Barbolla L, Contreras M. Naturally occurring anti-
D, anti-K, anti-Fy a and anti-Le ab . Vox Sang 1991; 61: 141.
6) Issit PD. Applied Blood Group Serology, 3 rd ed, Montgomery
Scientific Publications, Miami, FL;198
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