Capitolo 2 - Omero

CAPITOLO 2STUDIO DELLA STRUTTURAPRIMARIA DELLEPROTEINE

‣ Analisi della composizioneamminoacidica delle proteineLa determinazione della composizioneamminoacidica di una proteina permettedi sapere da quanti e qualiamminoacidi è formata quella proteina.Gli attuali metodi a disposizione perquesto tipo di analisi comportano trepassaggi fondamentali: idrolisi della proteina conliberazione degli amminoacidi che lacostituiscono; separazione degli amminoacidi presentinell'idrolizzato; quantificazione dei diversiamminoacidi.

‣ Separazione e quantificazione degliamminoacidi presenti nell'idrolizzato:Per questo tipo di analisi si utilizzanoapparecchi completamente automatizzati cheeseguono sia la separazione cromatograficadegli amminoacidi sia la loroquantificazione. Gli amminoacidi liberi presentinell'idrolizzato devono essere derivatizzaticon reagenti opportuni che ne permettano ilriconoscimento. La derivatizzazione puòessere effettuata sia prima che dopo lacolonna cromatografica.

Derivatizzazione post-colonna: gli amminoacidi presentinell'idrolizzato vengono separati su una colonna ascambio ionico. I tipi di resina solitamente utilizzatisono scambiatori cationici forti costituiti dapolistireni solfonati. Gli amminoacidi vengonosolubilizzati in un tampone a pH 2 e la colonnacromatografica viene equilibrata con un tampone allostesso pH, in modo che tutti gli amminoacidi si trovinoad un valore di pH inferiore al loro punto isoelettrico esiano quindi carichi positivamente. In queste condizionitutti gli amminoacidi si legano alla resina. L'eluizioneviene condotta in gradiente aumentando sia la forzaionica che il pH. In questo modo vengono eluiti prima gliamminoacidi acidi, quindi gli amminoacidi neutri edinfine quelli basici. Gli amminoacidi eluiti dallacolonna passano in un coil di reazione in cui vengonomiscelati a 100°C con la ninidrina che reagisce sia con igruppi amminici primari che quelli secondari. Si formanodue diversi tipi di cromofori, che possono essererilevati rispettivamente a 570 nm (amminoacidi; coloreblu-porpora) e 440 nm (imminoacidi; colore gialloarancio). L'assorbanza di ciascun picco è proporzionalealla concentrazione dell'amminoacido.

Un altro reattivo che può essere utilizzato perquesto tipo di analisi è l’o-ftalaldeide (OPA), laquale in presenza di -mercaptoetanolo, a pH 9,reagisce con i gruppi amminici primari formandodei derivati fluorescenti. Prolina ed idrossiprolinanon sono in grado di reagire con l'OPA. Anche lacisteina reagisce debolmente con l'OPA, mentre ilsuo prodotto di ossidazione (l'acido cisteico) dàun composto fortemente fluorescente. I vantaggidi questo rispetto alla ninidrina sonorappresentati dall'elevata sensibilità (10-100pmoli) e dal fatto che il prodotto fluorescente siforma a temperatura ambiente in breve tempo (2min).

Cromatogafia a scambio cationicoEluizione in gradiente di pH

‣ Derivatizzazione pre-colonna : in questo caso,dopo aver idrolizzato la proteina, gli amminoacidivengono derivatizzati con un reagente opportuno,quindi vengono separati in HPLC con una colonna infase inversa.‣ I reagenti che possono essere utilizzati sono: dansil cloruro; dabsil cloruro; OPA; 9-fluorenilmetilcloroformiato (FMOC-Cl); fenilisotiocianato (PITC).La derivatizzazione con l'OPA può essere associataalla derivatizzazione con il FMOC. I derivati possonoessere rilevati a due diverse utilizzando un diodearraycome sistema di rivelazione.Esistono apparecchi che permettono la completaautomatizzazione di tutta la procedura.

Separazione in RP HPLC di amminoacidi derivatizzati con OPA

La determinazione del contenuto in amminoacididi una proteina è importante per gli studiriguardanti le relazioni tra struttura e funzionedelle proteine, tuttavia anche il dosaggioqualitativo e quantitativo degli amminoacidipresenti nei liquidi fisiologici riveste una notevoleimportanza sia dal punto di vista biochimico checlinico, in quanto può essere di aiuto nelladiagnosi di alcune patologie (fenilchetonuria,cistinuria).

‣ Determinazione della struttura primaria di unaproteina La struttura primaria delle proteine può esseredeterminata utilizzando la degradazione di Edman.Questa tecnica permette di rimuovere ed identificareun residuo amminoacidico alla volta a partiredall'estremità N-terminale della proteina. Il metodo di degradazione di Edman comporta iltrattamento del polipeptide con fenilisotiocianato(PITC), che reagisce con l'estremità N-terminalelibera della catena polipeptidica formando unfeniltiocarbammilderivato o PTC-derivato. La reazioneavviene in condizioni di pH basico (circa pH 9).Quando il PTC-derivato viene trattato con un acidoanidro, quale l'acido trifluoroacetico, il legamepeptidico tra l'amminoacido N-terminale e il secondoamminoacido viene scisso liberando il derivato 2-anilino 5-tiazolinonico del residuo N-terminale e unpolipeptide con un amminoacido in meno. Il derivato tiazolinonico, chimicamente instabile,viene separato dal polipeptide e convertito, mediantetrattamento con un acido diluito, in un derivato piùstabile: il feniltioidantoin-derivato (PTHaminoacido),che viene identificato in RP-HPLC. La rimanente catena polipeptidica, più corta di unresiduo, viene nuovamente sottoposta ad un altrociclo di degradazione di Edman.

Questa serie di reazioni viene eseguita automaticamentein apparecchi specifici, che prendono il nome di"sequenziatori automatici di proteine", in cui èpossibile ottimizzare le condizioni delle singole fasidel processo degradativo e quindi riuscire adidentificare più di 60 residui della porzione N-terminale della proteina. L'identificazione degliamminoacidi rilasciati nei cicli successivi diventaproblematica, a causa degli effetti cumulativi direazioni incomplete e di reazioni secondarie delprocesso di degradazione. Questi apparecchi permettonodi poter lavorare con quantità molto basse di proteina,nell'ordine di decine di pmoli.Questi sequenziatori sono collegati on line con un HPLCdotato di una colonna in fase inversa, su cui vengonoiniettati automaticamente i PTH ottenuti ad ogni ciclodi degradazione. Il riconoscimento a 269 nm e l'analisiquantitativa di ogni PTH avviene per confronto con PTHstandard. E'chiaro che il riconoscimento può avveniresenza problemi solo se è presente un solo PTH per ogniciclo di degradazione di Edman.Per poter determinare la struttura primaria di unaproteina è quindi necessario che la proteina sia puraalmeno per il 90%. Nel caso in cui la proteina siacostituita da subunità differenti è necessario, inoltre,separare le subunità e operare su ogni singola subunità.

Grafico di eluizione di PTH standard.

‣ Prima di sottoporre una proteina alladegradazione di Edman, solitamente, questaviene ridotta e carbossimetilata.‣ Questo trattamento permette di avere unaproteina denaturata, in cui il residuo N-terminale è ben esposto, e di trasformare iresidui di cisteina (che durante ladegradazione di Edman vengono distrutti) incomposti stabili e rilevabili come PTHderivati.‣ Quando si vuole determinare la strutturaprimaria completa di una proteina solitamenteviene seguito il seguente protocollo: analisi sequenziale della porzione N-terminale della proteina carbossimetilata; scissione della proteina in peptidi, medianteproteolisi chimiche o enzimatiche; separazione dei peptidi ottenuti; analisi degli amminoacidi di ciascun peptide; analisi sequenziale di ciascun peptide; allineamento dei peptidi.

‣ Analisi sequenziale della porzione N-terminaledella proteina carbossimetilata: sottoponendo laproteina completa alla degradazione di Edman si puòottenere la sequenza dei primi 60-70 residuiamminoacidici. Tuttavia, da questo tipo di analisinon si ottiene nessun risultato nel caso diproteine con l'N-terminale bloccato. Molte proteinehanno, infatti, come amminoacido N-terminale unresiduo di acido piroglutammico (derivante dallaciclizzazione di un residuo di acido glutammico odi glutammina) o un amminoacido acetilato oformilato che non sono in grado di reagire con ilfenilisotiocianato. Nel primo caso, la proteina può essere trattata conun enzima: la piroglutammato ammino peptidasi,capace di scindere il legame peptidico tra ilpiroglutammato e il successivo amminoacido, vienequindi rilasciata una catena polipeptidica cheinizia con il secondo amminoacido e che può esseresequenziata. Nel caso di amminoacidi acetilati, invece, occorreprima frammentare la proteina, riconoscere ilpeptide corrispondente alla porzione N-terminale etrattarlo a caldo con un acido diluito.

‣ Scissione della proteina in peptidi, medianteproteolisi chimiche o enzimatiche: dalla sempliceanalisi sequenziale della porzione N-terminale diuna proteina, non è possibile determinarne lastruttura completa, poiché solitamente le proteinehanno dimensioni maggiori di 60 amminoacidi.Occorre quindi frammentarle in peptidi più piccolie completamente sequenziabili. Questa proceduraprevede la scissione dei legami peptidici in puntispecifici utilizzando sia metodi chimici cheenzimatici.Metodi enzimatici: la scissione proteolitica di unaproteina la si può ottenere incubando la proteinacon un enzima proteolitico in un tampone opportuno.Il tempo, la temperatura della reazione e ilrapporto enzima/proteina possono essere variati aseconda dell'enzima utilizzato e del pattern diframmentazione desiderato. La reazione proteoliticaviene poi bloccata acidificando il tampone direazione o congelando la miscela di reazione oancora aggiungendo degli inibitori delle proteasi.

Tripsina: è uno degli enzimi proteoliticimaggiormente impiegati. E' molto specifica, scinde ilegami peptidici all'estemità COOH terminale deiresidui di Arginina e di Lisina; non è in grado divolgere la propria attività catalitica nel caso incui l'amminoacido che segue i residui di Arg o Lyssia una Prolina. Se si prolunga il tempo di reazionetra tripsina e la proteina, si possono avere anchescissioni anomale soprattutto all'estremità COOHterminale dei residui di Tirosina o di altriamminoacidi idrofobici. Queste scissioni sonoattribuibili alla presenza di una attivitàchimotriptica contaminante. Proprio per evitarequesto tipo di reazioni solitamente si utilizzatripsina trattata con TPCK (tosil-L-fenialalaninaclorometil chetone). Il gruppo reattivo del TPCK è ilclorometil chetone che alchila uno degli atomi di Ndell'anello dell'His 57 , che fa parte del sito attivodella chimotripsina, ed inibisce quindi l'attivitàcatalitica di questo enzima.

Chimotripsina: non è estremamente specifica, scindei legami peptidici in corrispondenza dell'estremitàCOOH terminale dei residui idrofobici, soprattutto:Phe, Trp, Tyr e Leu.Proteasi Arg-specifica: è un enzima isolato dallaghiandola sottomascellare di topo, scinde i legamipeptidici in corrispondenza dell'estremità COOHterminale dei residui di Arginina.Proteasi Lys-specifica: scinde i legami peptidiciin corrispondenza dell'estremità COOH terminale deiresidui di Lisina.Proteasi da Staphylococcus aureus (V8 proteasi): intampone ammonio carbonato, pH 8 , questo enzimascinde solo i legami Glu-X. La specificitàdell'enzima può essere estesa anche ai residui diAsp, facendo avvenire la reazione proteolitica intampone fosfato, pH 7.8.Esistono anche altre proteasi, che sono menospecifiche di quelle appena descritte. Un esempio èla pepsina. La sensibilità dei legami peptidiciall'azione di questo enzima varia da proteina aproteina. Presenta una maggiore specificità per ilegami in cui intervengono dei residui di Phe eLeu, sebbene sia capace di idrolizzare anche moltialtri legami. Agisce a pH acido.

‣ Metodi chimici: Bromuro di cianogeno (CNBr): il metodo che prevede iltrattamento della proteina con CNBr è uno dei metodichimici che dà i migliori risultati ed è quindi unodei più utilizzati. Questo reattivo permette discindere la catena polipeptidica specificamente incorrispondenza dell'estremità COOH terminale deiresidui di metionina. Normalmente una proteinacontiene un numero molto limitato di residui diMetionina, quindi con il CNBr si ottengono di solitopochi frammenti, di dimensioni anche elevate. Ipeptidi che si ottengono presentano come amminoacidoC-terminale un residuo di omoserina o di omoserinalattone. I legami Met-Ser e Met-Thr vengono scissisolo parzialmente. Scissione ai residui di Triptofano: Vi sono diversireattivi che possono scindere una proteina incorrispondenza del lato carbossilico dei residui diTrp, tuttavia molti di essi determinano anchemodificazioni a carico di diversi amminoacidi,determinando quindi la formazione di prodotti che nonsono poi riconoscibili durante l'analisi sequenziale.Uno dei reattivi migliori sembra essere l'acido o-iodosobenzoico, che tuttavia può scindere la proteinain corrispondenza anche di alcuni residui diTirosina.

Scissione dei legami Asp-X: Questo tipo discissione consiste in una idrolisi acida blandadella proteina. Il materiale proteico vieneripreso in HCl 13 mM, all'interno di una fialache viene chiusa sotto vuoto e messa in stufa a108°C per 2 ore. Questo metodo può essereutilizzato in alternativa alla V8 proteasi,soprattutto per proteine poco solubili.L'efficienza della scissione varia in funzionedell'amminoacido che segue l'Asp. Ad esempio illegame Asp/Pro è senz'altro quello maggiormentesensibile a questo tipo di scissione. Piùstabili a questo tipo di trattamento sembranoessere invece i legami peptidici in cuiintervengono residui idrofobici come Leu o Val.Con questo trattamento si ha lo svantaggio delladeammidazione di residui di Asn e Gln quandoquesti rappresentano l'amminoacido C-terminaledella proteina, inoltre i residui di Trp possonoessere danneggiati. Scissione dei legami Asn-Gly: questi dueamminoacidi quando si trovano vicini, ciclizzanofacilmente formando una succinimide sostituitache risulta particolarmente sensibileall'attacco nucleofilo dell'idrossilamina.

‣ Separazione dei peptidi ottenuti: la scelta delmetodo di separazione dei peptidi, ottenutidalla scissione di una proteina, dipende dalnumero e dalle dimensioni dei peptidi. Si puòscegliere una separazione cromatografica oelettroforetica. I peptidi possono essereseparati in HPLC o FPLC utilizzando un qualsiasitipo di cromatografia, scelta i base allecaratteristiche chimico-fisiche dei peptidi:fase inversa, scambio ionico, gel filtrazioneetc. Nel caso si sia ottenuto un numero limitato dipeptidi con dimensioni abbastanza elevate (inseguito ad esempio ad una digestione chimica ouna digestione enzimatica controllata), questipossono essere separati anche medianteelettroforesi in SDS su gel di poliacrilammide.I peptidi separati possono essere poi recuperatimediante elettroeluizione o elettroblotting. Isequenziatori automatici sono infatti in gradodi sequenziare anche un peptide trasferito suuna membrana di nylon o di PVDF.

Grafico di separazione in RP HPLC di unamiscela di peptidi triptici

‣ Analisi degli amminoacidi di ciascun peptide: unaaliquota di ciascun peptide separato in cromatografiao in elettroforesi viene sottoposta ad analisi degliamminoacidi. Questo passaggio non è indispensabile,può fornire comunque alcuni dati molto utili: valutazione del grado di purezza del peptide: se unpeptide non è puro non può essere sottopostoall'analisi sequenziale, ma deve essere ulteriormentepurificato;valutazione del numero e del tipo di amminoacidipresenti nel peptide.‣ Analisi sequenziale di ciascun peptide: la sequenzadi ciascun peptide purificato viene quindideterminata con il metodo di Edman.‣ Allineamento dei peptidi: a questo punto si conoscela sequenza dei singoli peptidi della proteina, manon il loro ordine. Le ulteriori informazioni siottengono dall'allineamento dei peptidi. Si deve cioèsottoporre la proteina ad una digestione diversa ingrado di produrre peptidi di dimensioni più elevate,che contengano nella loro sequenza più peptidioriginati dalla prima digestione. Questi peptidiottenuti dalla seconda digestione vengono anch'essisequenziati e dovrebbero permettere di stabilirel'ordine di sequenza dei primi peptidi e quindil'intera struttura della proteina.

Informazioni fornite dalla sequenza degli amminoacidi di unaproteinaLa sequenza di una proteina può fornire diverse informazioni:1. La struttura primaria di una proteina può essere paragonataalle altre sequenze conosciute per individuare eventualiomologie di struttura (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Unaricerca di questo tipo richiede solo pochi minuti con l'uso diun computer collegato tramite Internet alle diverse banche datidi struttura primaria. Da questa ricerca è possibileidentificare la proteina, verificare a quale famiglia diproteine appartiene individuare particolari sequenze importantiper lo svolgimento della funzione biologica.2. Il confronto fra le strutture della stessa proteina ottenutada specie diverse fornisce molte informazioni sulle vie seguitedall'evoluzione. E' possibile dedurre relazioni genealogiche fraspecie diverse sulla base delle differenze presenti nellastruttura primaria delle proteine di queste specie e anchestimare il tempo di divergenza di due linee evolutive in basealla regolarità della frequenza delle mutazioni casuali. Peresempio, un confronto tra le strutture primarie dell'albuminaisolata da diversi primati ha permesso di concludere che gliesseri umani e le scimmie africane si sono separati solo 5milioni di anni fa e non 30 come si pensava in precedenza.

3. Si possono individuare sequenze ripetute all'internodella struttura primaria di una proteina. La presenza diqueste sequenze è dovuta probabilmente al fatto che molteproteine derivano dalla duplicazione di un geneprimordiale seguita da una diversificazione. Per esempiola calmodulina, una proteina capace di legare il calcio,contiene quattro unità simili ripetute che derivano dalladuplicazione genica. Anche le immunoglobuline sonocostituite da serie di domini simili.4. Dall'analisi della struttura primaria di una proteinaè possibile individuare sequenze che contengono segnaliimportanti per determinare la localizzazione cellulare diquella particolare proteina o per determinare eventualimodificazioni post traduzionali. Ad esempio molteproteine destinate ad essere secrete dalla cellula o alocalizzarsi nella membrana contengono una sequenzasegnale nella porzione N-terminale corrispondente a circa20 amminoacidi con prevalente carattere idrofobico. Lesequenze Asn-X-Ser e Asn-X-Thr corrispondono a potenzialisiti di glicosilazione della proteina. Le coppie diresidui basici, come Arg-Arg, sono siti potenziali peruna scissione proteolitica che puòcomportarel'attivazione della proteina.5. La conoscenza della struttura primaria è importanteper la determinazione dei successivi livelli diorganizzazione strutturale della proteina: strutturasecondaria e terziaria.

6. Dalla determinazione della struttura primaria di una proteina èpossibile individuare eventuali mutazioni importanti nel modificare lafunzione biologica di una proteina. Molte patologie sono dovute amutazioni anche di un singolo amminoacido di una proteina.7. Conoscendo la sequenza amminoacidica anche parziale di una proteina èpossibile sintetizzare una sonda oligonucleotidica che può essereutilizzata per identificare all'interno di una banca genomica il geneche codifica per quella determinata proteina.La determinazione della struttura primaria di una proteina costituita daqualche centinaio di amminoacidi è tuttavia abbastanza difficoltosa. Perquesto motivo, ormai la sequenza di proteine molto grandi vienedeterminata utilizzando le tecniche di biologia molecolare per ilsequenziamento del DNA; la sequenza della proteina viene quindi dedottadalla sequenza del gene o del cDNA che codifica per quella specificaproteina. Queste sequenze non rivelano tuttavia le modificazioni posttraduzionaliche la proteina ha subito. Per chiarire la natura di questemodificazioni, importanti per l'attività biologica di molte proteine, ènecessaria l'analisi chimica delle proteine stesse. Quindi le tecnicheper il sequenziamento del DNA e quelle per il sequenziamento delleproteine rappresentano due approcci complementari al chiarimento dellebasi strutturali della funzione delle proteine.Un'altra tecnica complementare alla degradazione di Edman per ladeterminazione della struttura primaria delle proteine è laspettrometria di massa. Questa tecnica permette di superare alcunelimitazioni della degradazione di Edman. Può infatti essere utilizzataper sequenziare peptidi che presentano l'estremità N-terminale bloccata,o identificare eventuli modificazioni post-traduzionali, come lapresenza di zuccheri o amminoacidi fosforilati etc.