Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero

Impieghi della PCR• Strategie di clonaggio molecolare;• Analisi dell’espressione genica (RT-PCR);• Analisi di medicina legale quando si isolanominuscoli capioni di DNA dalla scena di uncrimine;• Test diagnostici di malattie genetiche;• Diagnosi di infezioni virali o batterriche (HIV,Epatite C, Mycobacterium tubercolosis).

TemperaturePCR100Melting94 o C500T i m e3’5’5’3’

TemperaturePCR100Melting94 o C500T i m e3’5’Heat5’3’

TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C0T i m e3’5’5’5’5’3’

TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x0T i m e3’5’Heat5’5’Heat5’5’3’

TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’3’Heat5’5’Heat5’

TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’5’3’5’5’5’5’5’5’

TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’5’3’Fragments ofdefined length5’5’5’5’5’5’

Dopo n cicli il miscuglio di reazione contiene un numero massimoteorico di molecole di DNA a doppia elica pari a 2n. (Crescitaesponenziale)

Vantaggi dalla Taq PolimerasiMiscela di reazione‣Tampone‣Eccesso dei 4 nucleotidi precursori(dNTP)‣2 primers di circa 20 basi‣DNA a doppio filamento contenente lasequenza da amplificare‣Taq Polimerasi1) L’enzima può essere aggiunto una sola volta all’inizio della reazione erimane attivo per 30-40 cicli di PCR.2) E’ possibile automatizzare la PCR utilizzando apparecchi termostaticiciclici.3) La Taq polimerasi (da Thermophylus Aquaticus) aumenta la specificità ela sensibilità della PCR; è in grado di lavorare entro un ampio range ditemperature (da 37°C a 95°C).Tuttavia… non possiede un sistema di “correzione di bozze” e puòincorporare un nucleotide errato ogni 2 X 10 4 nucleotidi.

Fasi della PCR Denaturazione (melting): a 94°C (1’ – 2’); Appaiamento (annealing): > 50°C, < 70°C (1’ –2’); la temperatura di appaiamento dipende dallacomposizione in basi dei primers,4 (G + C) + 2(A +T) = T appaiamento Estensione: 72°C (1’ – 2’); i tempi dipendono dallalunghezza dello stampo.

Vantaggi della PCR1. E’ più veloce rispetto al clonaggio tramite vettori2. E’ sufficiente una piccola quantità di DNA3. E’ una tecnica altamente selettiva e sensibile (DNA non purificato)Svantaggi della PCR1. Per sintetizzare i primers bisogna conoscere le sequenze alle estremitàdel frammento di interesse2. Si può impiegare solo per amplificare frammenti corti (noproofreading)*3. Problema dei falsi positivi (mismatch dei primers e contaminazioni diDNA)§Polimerasi “Hot start” e “nested” PCR

• * Si possono usare al posto della Taq polimerasi altrepolimerasi, come la polimerasi Pfu da Pyrococcus furiosus. Inquesto caso le inserzioni sbagliate che si verificano di radodurante la polimerizzazione, sono rapidamente escissedall’attività esonucleasica 3’ 5’ di quest’enzima.• § E’ importante la selezione dei primers, che possibilmentedevono avere le seguenti caratteristiche:1. Dimensioni > od = ai 18 – 20 nucleotidi per avere altaspecificità;2. Evitare l’utilizzo di primers con sequenze polipuriniche opolimirimidiniche;3. Evitare la complementarietà tra i 2 primers;4. Evitare primers che possono formare strutture secondarie;5. Le sequenze dei primers possono anche includere regioni utiliper le applicazioni susccessive; es. siti di restrizione.

Nested PCRLa nested PCR è una variante della tecnica di PCR che consiste nell’utilizzo di duecoppie di primers, una esterna che genera un normale prodotto di PCR ed una coppiadi primers all’interno del prodotto amplificato: se il prodotto di amplificazione fosseaspecifico la seconda PCR non andrebbe a buon fine.5’ 3’5’ Primer 1Primer 2 5’3’ 5’Primo prodotto di amplificazione5’ 3’3’5’5’ -3’5’ Primer 3Primer 4 5’3’5’5’3’3’ Secondo prodotto di amplificazione5’

Nested PCR

Hot Start PCR• Un problema comune con la PCR è la formazione di prodotti nonspecifici,specialmente di dimeri dei primers. Questi prodottiindesiderati non solo interferiscono con la generazione degli ampliconidesiderati, ma oscurano anche le analisi che fanno seguito alla reazione.• I metodi di hot start PCR forniscono una soluzione a questa mancanza dispecificità riducendo od eliminando la formazione di prodotti nonspecifici prima del ciclo ad alta temperatura.• I metodi attuali di hot start PCR hanno come bersaglio la polimerasiattraverso il silenziamento della sua attività prima del passaggio inizialedi denaturazione, usando più comunimente od anticorpi bloccanti o lamodificazione chimica. Altrimenti sono state sviluppate metodichechiamate di sequestro dei primers in cui una proteina ricombinante silega ai primers a basse temperature rendendoli non disponibili perl’estensione da parte della polimerasi. Ad alte temperature la proteina èdanturata e quindi si dissocia dai primers.

Hot Start PCR

RT- PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)Il DNA da amplificare deriva dalla retrotrascrizione dell’mRNARICHIEDE:1. Un tampone2. Una RT DNA polimerasi (di origine retrovirale)3. Miscela di mRNA contenente la sequenza da amplificare4. Primer oligo dT o oligomeri random cDNA I 4 dNTP 2 primers Una DNA polimerasi termoresistente

Sintesi del cDNA

Analisi post-PCR• Eventuale purificazione dei prodotti della PCR;• Separazione mediante elettroforesi dei prodotti dellaPCR e visualizzazione;• Clonaggio dei prodotti della PCR;• Rilevazioni di mutazioni puntiformi negli amplificati;• Sequenziamento dei prodotti della PCR.

• L’elettroforesi su gel dei prodotti della PCR è il metodostandard per analizzarre la qualità e l’efficacia della reazione. Iprodotti della PCR arrivano ad un massimo di lunghezza di 10kb, ma la maggior parte delle amplificazioni sono nel range di1 kb od al di sotto. Per prodotti di 400 – 1000 basil’elettroforesi su gel di agarosio è certamente indicata.L’elettroforesi rivela la dimensione della banda del prodotto,che è confrontata con il risultato presunto. L’elettroforesimostra anche quanto di questa banda è stata prodotta, e rivelala presenza o l’assenza di prodotti di amplificazione nondesiderati.• Idealmente, l’elettroforesi produce un’intensa banda singola didimensione corretta, come viene determinato dal confrontocon markers di dimensione che sono stati corsi nello stessogel.

Campioni biologici per PCR• Sangue• Saliva• Urine• Sperma• Striscio vaginale• Capelli• Cellule ammniotiche• Villi coriali• Fibroblasi di bipsie• Osteoclasti

IMPIEGHI DELLA PCRDiagnosi infezioni batteriche e viraliDiagnosi HIV, Diagnosi della TubercolosiDiagnosi cliniche di malattie causate da mutazioniControllo efficacia terapie anti-cancroDeterminazione del sessoMedicina legale Ricerca di base•Frammenti da inserire in un vettore•Sonde per screening di librerie genomiche o di cDNA

PCR-RFLPThe polymorphism results from a single nucleotide differencethat provides a recognition site for a restriction enzyme in oneallelic form and not the other. A polymorphism of this type canbe rapidly detected by (1) amplifying the region around thepolymorphic site from each sample, (2) subjecting the amplifiedmaterial to the appropriate restriction enzyme for a brief periodof digestion, and (3) distinguishing the undigested PCR productfrom the smaller digested fragments by gel electrophoresis. Bychoosing primers that are relatively equidistant to andsufficiently far from the polymorphic site, one can easily resolveallelic forms on agarose or polyacrylamide gels.

Test geneticoAmplificazionemediante PCRper la ricerca didelezione omozigotedei geni SMN(atrofia muscolarespinale autosomicarecessiva)

PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)• La metodica identifica sostituzioni nucleotidiche, piccoledelezioni od inserzioni.• La tecnica consiste nell’amplificazione del DNA mediantePCR utilizzando oligonucleotidi complementari alla sequenzanormale ed a quella mutata. Si eseguono, quindi, dueamplificazioni per ogni campione, una con i primers normali el’altra con i primers mutati. In presenza di un omozigote per lamutazione l’amplificazione avverrà solo con i primers mutatie viceversa. Nei soggetti eterozigoti per la mutazione, il loroDNA sarà amplificato con entrambi i primers.• La tecnica può rilevare una singola copia dell’allele mutato inpresenza di 40 copie dell’allele normale.

PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)

PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)• Una variante della tecnica è rappresentata dalla “ARMS multipla”che utilizza più primers mutati in un’unica reazione.• Questa tecnica consente di studiare un soggetto per più mutazioni edè utilizzata correntemente per l’analisi molecolare della -talassemiae della fibrosi cistica.• “Tetra-primer PCR-ARMS” adotta i principi del metodo della PCRcon 4 primers.

PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)

PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)

PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Questa tecnica può rilevare mutazioni singole nei geni, comeconseguenza dell’alterata mobilità conformazionale dei singolifilamenti di DNA (entro un gel di elettroforesi) che hanno lamutazione rispetto ai singoli filamenti “wild-type” che nonhanno la mutazione.• Sono preparati dei primers per amplificare mediante PCR lasequenza del gene coinvolto in una patologia. Si amplifica laregione mutata e la stessa regione “wild-type”. I due filamentidel prodotto della PCR del “wild-type” migrerannodifferentemente rispetto ai due filamenti del prodotto dellaPCR del mutante in un gel di poliacrilammide in condizioninon denaturanti.

PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Il cambiamento di una singola base può causare uncambiamento conformazionale nella molecola di DNA asingolo filamento che può essere facilmente rivelata mediantel’elettroforesi.• Procedura: amplificazione mediante PCR della regioned’interesse (“wild-type” e mutato) denaturazione concalore e formammide dei prodotti della PCR, seguita da unrapido raffreddamento per prevenire il ri-appaiamento deifilamenti elettroforesi su gel di poliacrilammide incondizioni non denaturanti.

PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Visualizzazione delle bande: a) uso di una molecola intercalante(bromuro di etidio o SYBR green II); b) colorazione con nitratod’argento; c) mediante autoradiografia se durante la PCR gliampliconi sono stati radiomarcati utilizzando o primers radiomarcatio dNTP radiomarcati; d) medinate fluorescenza se i primers sonomarcati con fluorofori.• Gli individui che sono omozigoti “wild-type” per il locus genicoche viene analizzato mostreranno due bande distinte nel gel, cosìcome gli individui che sono omozigoti mutanti. Tuttavia, comeconseguenza del cambiamento nucleotidico, i prodotti di PCR deimutanti migreranno con una diversa mobilità. Gli individui chesono eterozigoti mostreranno un “pattern” di quattro bande.

PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)

PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)

PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• L’analisi PCR-SSCP è tecnicamente facile e può essere usataper fare lo “screening” di un grande numero di campioni.• Diversi parametri influenzano la sensibilità dell’analisi PCR-SSCP, e tra questi: a) il tipo di mutazione; b) la dimensione delframmento di DNA; c) il contenuto di G e C del frammento; d)la percentuale di poliacrilammide del gel; e) la dimensione delgel e la differenza di potenziale applicata; f) la temperatura delgel durante l’elettroforesi; g) la concentrazione del DAN; h) iltempo di corsa dell’elettroforesi; i) la composizione deltampone, includendo la forza ionica ed il pH; l) la presena dialtre sostanza, come glicerolo o saccarosio, nel tampone.

PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)• Il metodo è basato sulla formazione di eteroduplex dopo avermiscolato DNA “wild-type” e mutato aplificati mediante PCR.Il frammento di DNA in esame è soggetto a denaturazioneseguita da rinaturazione.• Se una mutazione è presente in uno dei due alleli, siformeranno 4 specie distinte di DNA a doppio filamento: a)omoduplex di DNA “wild-type” (wt/wt); b) omoduplex diDNA mutato (mt/mt) e due diversi eteroduplex (wt/mt).• Gli omoduplex migrano più velocemente degli eteroduplex nelgel.• La formazionedegli eteroduplex e la loro stabilità dipende daltipo di mutazione nel frammento di DNA.

PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)• Grandi inserzioni o delezioni (> 3bp)producono eteroduplex molto stabili.• Al contrario, eteroduplex che coinvolgono lasostituzione di una singola base sono menostabili e più sensibili alle variazioni dellecondizioni ambientali.• Tuttavia, l’analisi eteroduplex permette unarapida rilevazione di mutazioni singole, ed èstata usata con successo nella diagnosi dianemia a cellule falciforme, della fibrosi

PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)

PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)

PCR-DGGE (Denaturation Gradient GelElectrophoresis)• La metodica è basata sul principio che una singola sostituzionenucleotidica può far variare la temperatura di denaturazione diun segmento di DNA.• Il DNA amplificato “wild-type” e mutante è separato su di ungel di poliacrilammide che contiene concentrazioni crescenti diun agente denaturante (formammide ed urea).• Quando i due filamenti del DNA iniziano a dissociarsi si hauna riduzione della velocità di migrazione rispetto allamolecola di dsDNA. Come detto sopra, la presenza dimutazioni modifica le proprietà di “melting” del DNA rispettoal DNA “wild-type”. Pertanto, i due tipi di molecole sidissociano in punti diversi del gradiente denaturante, e sarannodistinguibili in base alla diversa mobilità elettroforetica.

PCR-DGGE (Denaturation Gradient GelElectrophoresis)• L’analisi PCR-DGGE è estremamente rapida,ha un’efficienza del 100% , non necessita diradioattività ed è adatta ad analisi diagnostichequando basti analizzare frammenti di DNA di500-600 bp.• Per visualizzare le bande nel gel si usa unagente intercalante (bromuro di etidio oSYBR green).

PCR-DGGE (Denaturation Gradient GelElectrophoresis)Immagine negativa di un gel DGGE colorato con bromuro d’etidio

Resa della PCRResa teorica: 2 n P = (2) n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmentecon il numero di cicli di PCR (n).Il prodotto di PCR dipende anche da T, ovvero il numero di copie ditemplate di partenza.Log [DNA]n. cicli termici

Resa della PCRResa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, essoè limitato da:Quantità dei primersAttività della Taq polimerasiReannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento neiprodotti

PCR productIl plateau non dipende da TAnche se la quantità iniziale di template è la medesima, il plateau è raggiuntoin tempi diversi ed in cicli diversi.25201510500 10 20 30 40Cycle

Soluzioni per PCR quantitativa Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale ilprodotto di PCR è proporzionale al template iniziale Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di unafluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, puòessere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo maanche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue las t e s s a c i n e t i c a d e l l a r e a z i o n e di P C R

RT-PCR convenzionaleReversetrascriptionReal-time RT-PCRReversetrascriptionPCRreactionNested PCRreactionGelelectrophoresisDNA sequencingSouthern blotManual or automatedanalysisPCR reactionQuantitative results

Perché Real-Time?• Misura l'amplificazione in tempo realedurante la fase esponenziale della PCR,quando cioè l'efficienza di amplificazione èinfluenzata minimamente dalle variabili direazione, permettendo di ottenere risultatimolto più accurati rispetto alla PCRtradizionale "end point“.

RT-PCR quantitativa• Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione• Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio• Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerIncremento difluorescenzaCicli di PCR

Analisi tramite software

Chimiche fluorescenti per PCR Real-TimeLa fluorescenza si genera durante la PCR pereffetto di diverse possibili reazioni chimiche.Le chimiche principali sono basate sia sul legamedi coloranti fluorescenti che si intercalano nelladoppia elica di DNA, come il SYBR Green, siasull'ibridazione di sonde specifiche.

SYBR greenUtilizzauna molecola fluorescente non specifica chesi lega al solco minore del DNA.

SYBR green All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazionecontiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente

SYBR green Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecolefluorescenti alla doppia elica.

SYBR green Durante l’elongazione si verifica un aumento difluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero dicopie dell’amplicone.

SYBR green Metodica semplicePossono essere utilizzati primers in uso in qualitativa. Non costosa Non-specifica– La molecola fluorescente si lega random a tuttele doppie eliche, includendo i dimeri di primers.– È necessario ottimizzare la metodica per evitarela formazione di prodotti aspecifici.

La Real-Time PCR si può realizzare mediantel’impiego di: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si leganoin maniera aspecifica a tutto il DNA. sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento diinteresse, marcate con molecole fluorescenti. Esistono diversi tipi di sonde:Dual-labeledlabeled (come le sonde TaqMan)Molecular beaconsScorpionSonde FRET (Fluorescence Resonance EnergyTransfer)

Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come iprimers della PCR, viene disegnato per esserecomplementare alla sequenza bersaglio da amplificare.3’5’5’Primer3’RQ5’ 3’Primer3’5’5’3’La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’internodel frammento amplificato nella reazione di PCR

Dimensioni dell’amplicone

ForwardProbeReverse

Sonda TaqMan Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” edall’estremità 3’ una molecola “Quencher”.

Reporter-QuencherDyeQuencher5,6 FAM BHQ-1/TAMRAHEX/JOEBHQ-2Texas Red/ROXBHQ-2Cy5/Quasar670 BHQ-2 o (-3)6-carbossifluoresceina6-carbossitetrametilrodamina

Reporter-Quencher5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emettefluorescenza3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia chespegne la fluorescenza del reporterSe R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di Rperchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

Real-Time PCR:attività 5’>3’ esonucleasica3’5’3’RQ5’RQ5’3’ 5’RQ5’3’ 5’

L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamenteproporzionale al numero di ampliconi generatiForward primerProbeReverse primer

Real-time PCR: reagenti COMPONENTI DELLA REAZIONE:1) DNA target2) DNA polimerasi3) Due oligonucleotidi4) dNTPs5) Probe fluorescente

Run Real-Time thermal cycle3 min95°C15 s50 cycles50°CActivatesAmplitaq Gold55°C65°C1 min2 min30 sActivatesUNG (Uracile N-Glicosilasi)

Curve di amplificazioneFluorescenzaCicli di amplificazionePer ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cuiC T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità ditemplate iniziale

Plot di amplificazioneLinea soglia sceltadall’operatoreIn maniera da intersecare lecurve di tutti i campioni nellafase esponenzialeIndica il valoreal di sopra delquale inizial’accumulo diun amplificatoE’ il ciclo della reazione diamplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione èmaggiore rispetto a quello dellaThreshold

QuantificazioneASSOLUTA i campioni sono quantificati in modoassoluto Necessita di “standard” di cui si conosce la concentrazioneassoluta (utilizzo di una “standard curve”) Per tutti gli “unknowns” devono essere saggiate identichequantità di campioniRELATIVA la quantificazione viene effettuataparagonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una“standard curve”) Gli “unknowns” vengono “quantificati” paragonando il loroC T con quello del controllo endogeno (-actina, GAPDH).

Ct35Quantitativa assoluta10 110 225unknown sample10 310 410 510 6153500 copies10 712 3 4 5 6 7log 10 quantityIl valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un genee s p r e s s o c o s t i t u t i v a m e n t e ( - a c t i n a , G A P D H , e c c . )

Quantificazione relativaPlot di amplificazioneControlSampleNumero di cicliC TNumero di cicli

Quantificazione relativa: analisi dei dati‣ Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)espresso costitutivamente (C T )‣ Comparare ciascun C T così ottenuto con il C T di untrattamento di controllo anche detto “calibratore” (cb)(C T )2 - (CT,r- CT,cb) = 2- CT‣ Il valore così ottenuto permette di determinare laconcentrazione relativa del target

Sonde FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer) Simili alle sonde TaqMan perché si legano alDNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sonoperò due sonde ognuna marcata con un solofluorocromo (accettore e donatore). Quando le sonde non sono legate alle sequenzetarget il segnale fluorescente provenientedall'accettore non è rilevato.donatoreaccettore Durante lo step di annealing della PCR,entrambe le sonde FRET ibridizzano allesequenze target: ciò avvicina il fluoroforodonatore all'accettore permettendo iltrasferimento di energia tra i due fluorofori e laproduzione di un segnale fluorescente da partedell'accettore che viene rilevato.

Molecular Beacons I "molecular beacons" contengono un fluoroforo e un quencher nonfluorescente alle estremità opposte di un oligonucleotide, che sonodisegnate in modo da essere complementari tra loro formando unastruttura stem-loop.La vicinanza del quencheral reporter fluorescenteimpedisce l’emissione difluorescenzafluoroforoquencher• Il loop è complementare ad una sequenza all'interno del prodottoamplificato.

Molecular Beacons Durante lo step di annealing dellaPCR, la sonda ibridizza alla suasequenza target: ciò separa ilcolorante fluorescente dal reporter,producendo un segnalefluorescente.EXCITATIONEFRET La quantità di fluorescenza prodottaad ogni ciclo, o dopo la PCR, dipendedalla quantità di prodotto specificoin quel dato momento.ANNEALINGAmpliconA differenza delle sonde TaqMan, le molecular beacons nonvengono distrutte durante la reazione di amplificazione percui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclo

Laprogettazionedellescorpion probes è simile aquelladellemolecularprobes, con la differenzache al 3’ terminale delprobe vi è una sequenza,PCR primer, che èspecifica per l’estensionedel target.Probes : ScorpionsQuesta sequenza è legataal 5’ terminale di unprimer per mezzo di un“blocker” blocker”..

Probes : ScorpionsStep 1Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNAScorpions primerProbeTarget di DNA

Step 2Probes : ScorpionsDurante il processo di denaturazione si verifical’allontanamento del quencherdal reporter e del primer diinnesco dal DNA targetQPrimer di innescoRDNA target

Step 3Probes : ScorpionsRaffreddandosi lo Scorpion esteso subisce un riarrangiamento internoed emette fluorescenza in maniera target specifica. Un primer nonesteso viene quenciato.

Riassumendo:Metodi di rilevamento della fluorescenzaSYBR GreenTaqManMolecularBeaconsScorpionprobe

Real-Time PCR: applicazioni‣ Quantificazione virale• Quantificazione dell’espressione genica• Efficacia della terapia farmacologica• Misura dei danni al DNA• Controllo di qualità e validazione dei saggi• Detenzione dei patogeni• Controllo degli OGM• Genotyping• MRD

MRD (MinimalResidualDisease): Quota residua di cellule neoplastiche noneradicate dalla terapia di induzione dellaremissione o dalle successive misureterapeutiche. Tali elementi neoplastici, presenti ad unlivello inferiore alla capacità di rilevazione dellemetodiche convenzionali, sono in grado diespandersi e dare origine alla recidiva.

Analisi della sequenzanucleotidica del DNA

• Uno dei metodi più comunemente usati per questaanalisi è quello di Sanger, detto anche metodo dellaterminazione della catena o deididesossiribonucleotidi (ddNTP).• Si tratta di una metodica elegante e relativamentesemplice che consiste nel far sintetizzare frammenti dicatena polinucelotidica di lunghezza diversa sullostampo del DNA che si vuole sequenziare. Ciò siottiene facendo avvenire la sintesi della nuova catenautilizzando oltre ai 4 dNTP anche uno dei 4 ddNTP. Inpresenza di DNA polimerasi un ddNTP può essereincorporato all’estremità 3’ di una catena nucleotidicain accrescimento su uno stampo di DNA, ma non puòpoi legare un altro nucleotide perchè non èdisponibile l’OH in 3’.

ddNTP

Il principio del procedimento può esserebrevemente riassunto: si prepara una miscela direazione contenete• - il frammento di DNA da sequenziare,denaturato, quindi a singolo filamento;• - un primer, cioè una breve sequenza nucleotidicacon le estremità 3’ e 5’ libere;• - una DNA polimerasi con elevata processività ebassa attività esonucleasica (sia in direzione 5’-3’,sia in direzione 3’-5’; as es. Sequenasi delcommercio);• - i 4 dNTP;• - un dNTP marcato con 32 P o con 35 S (incorporatoin una base modificata).

• Si suddivide quindi la miscela in 4 frazioni (A, T, G, C), aciascuna delle quali si aggiunge un diverso ddNTP, cioèddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP e si incuba per un tempoopportuno.• Poichè l’incorporazione del ddNTP nella catena inaccrescimento è del tutto casuale, durante l’incubazionesi formano in ciascuna frazione frammenti polinucleotidicidi lunghezza diversa, aventi tutti come sequenza inizialequella del primer, sequenza successiva in direzione 5’ 3’complementare al segmento duplicato del DNA stampo, etutti terminanti con il ddNTP presente in quella frazione.• Dopo incubazione le quattro frazioni vengono denaturateal calore, per separare le catene nucleotidiche appaiate, esottoposte ad elettroforesi in un unico gel dipoliacrilammide.

Terminazione della catena

ddCTPddCTPddCTPPRIMERDNA Polimerasi5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’+ ddNTP ( per es. ddCTP)STOP5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza di ogni ddCTPddCTPddCTPddCTP

Schema di sequenziamento a terminazione di catenaDNA stampo asingola elica3’-GGCTAAC5’ 3’3’-GGCTAAC+[ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +DNA PolimerasiIbridazione conIl primerddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP-CCG ddA-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC-ddC-CddCA C G TSequenza: 5’-CCGATTG-CC ddG-CCGATT ddGGTTAGCCDirezione dilettura-CCGA ddT-CCGAT ddT

• Le diverse catene polinucleotidicheneosintetizzate migreranno nel gel verso l’anodoin funzione della loro lunghezza e possono esserefacilmente localizzate, poichè radioattive, perautoradiografia. Si possono così evidenziarecentinaia di bande e separare catene chedifferiscono di un solo nucleotide.• Nelle 4 corsie del gel le bande si disporranno inordine di lunghezza dal fondo verso la zona dideposizione.• Dalla successione di tutte le bande presenti nelle4 corsie del gel si può risalire alla sequenza delframmento di DNA usato come stampo.

Metodo di sequenziamentodel DNA “dideossi” diSanger

Metodo di sequenziamentodel DNA “dideossi” diSanger

• Alla rilevazione per autoradiografia si può sostituire unarilevazione con marcatori fluorescenti di quattro coloridiversi legati all’estremità 5’ del primer. Si incuba il primerdi colore diverso per ciascuna delle quattro frazioni. Altermine dell’incubazione si mescolano le quattro frazioni esi fanno correre in un unico pozzetto. Si otterranno sultracciato bande fluorescenti di colori diversi, cheidentificano la base con cui termina ciascun frammento.Questa modalità ha consentito di mettere a punto metodidi sequenziamento automatizzato del DNA, nei quali sieffettua una scansione del gel con un raggio laser cheeccita i fluorofori e si rilevano e registrano le diversecolorazioni delle singole bande.• Ciò consente di esaminare in un unico gel più campioni,ognuno in una diversa corsia, di identificare per ognicampione la sequenza di diverse centinaia di basi, diparagonare tra loro diversi campioni.

Sequenziamento automatizzato con marcatorifluorescentiConiugando a ciascunddNTPun diverso marcatorefluorescente, èpossibile effettuare lequattro reazioni disequenziamento in ununico tubo da saggioe caricare il tutto insolo pozzetto di gelddAddTddCddG

Detection of FluorescentlyTagged DNADNA FragmentsSeparated byElectrophoresisOpticalDetection SystemOutput to ComputerScanning LaserExcitesFluorescent Dyes

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colorediverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.elettroferogramma

Fluorescent DNA Sequencing Data

Metodo di Sequenziamento di Maxame Gilbert« Marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento« Denaturazione e separazione dei due filamenti« Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognunodei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una odue delle 4 basi del DNA.G = DMS + piperidinaG + A = DMS + piperidina + acido formicoC + T = idrazina + piperidinaC = idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M« Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazioneparziale: statisticamente tutte le possibili basi saranno degradateproducendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalladistanza tra l’estremità marcata e il sito di taglio« Separazione dei frammenti marcati mediante gel elettroforesi e« Visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia

Metodo diSequenziamentochimico secondoMaxam e Gilbert

Un altro metodo per la determinazionedella sequenza, attualmente di largadiffusione, è quello definitoPyrosequencing od anche sequenziamentoper sintesi. La prima denominazione che èun termine brevettato deriva dal fatto chel’analisi sfrutta la liberazione di pirofosfatoche si ha quando la DNA polimerasireagisce con un nucleoside trifosfato e legaun nucleotide ad una catenapolinucleotidica in accrescimento.Come nel metodo di Sanger, si opera su unsegmento di DNA a singolo filamento cheagisce come template per la sintesi di una

Le tappe del pyrosequencing possono essere riassuntecome segue: il DNA di cui si vuole determinare la sequenza vieneridotto in frammenti di un centinaio di paia di basi edenaturato così da formare DNA a singolo filamento chesarà il template; al frammento di ssDNA viene aggiunto un primer equindi un cocktail di enzimi e di substrati DNApolimerasi, ATP solforilasi, apirasi, luciferasi,adenosinfosfosolfato (APS) e luciferina; si da quindi inizio alla reazione di sintesi aggiungendo insuccessione , separatemente, uno dei 4 dNTP.Reazione catalizzata della ATP solforilasi:ATP + H 2 SO 4 APS + PPi

• Step 1A sequencing primer is hybridized to a single-stranded PCRamplicon that serves as a template, and incubated withthe enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase,and apyrase as well as the substrates, adenosine 5'phosphosulfate (APS), and luciferin.

• Step 2The first deoxribonucleotide triphosphate (dNTP) is addedto the reaction. DNA polymerase catalyzes theincorporation of the dNTP into the DNA strand, if it iscomplementary to the base in the template strand. Eachincorporation event is accompanied by release ofpyrophosphate (PPi) in a quantity equimolar to theamount of incorporated nucleotide.

• Step 3ATP sulfurylase converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5'phosphosulfate (APS). This ATP drives the luciferase-mediatedconversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light inamounts that are proportional to the amount of ATP. The lightproduced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a chargecoupled device (CCD) chip and seen as a peak in the raw data output(Pyrogram). The height of each peak (light signal) is proportional tothe number of nucleotides incorporated.

• Step 4Apyrase, a nucleotide-degrading enzyme, continuouslydegrades unincorporated nucleotides and ATP. Whendegradation is complete, another nucleotide is added.

• Step 5Addition of dNTPs is performed sequentially. It should be noted thatdeoxyadenosine -thio triphosphate (dATP·S) is used as a substitutefor the natural deoxyadenosine triphosphate (dATP) since it isefficiently used by the DNA polymerase, but not recognized by theluciferase. As the process continues, the complementary DNA strandis built up and the nucleotide sequence is determined from the signalpeaks in the Pyrogram trace.

• Il pyrosequencing ha notevoli vantaggi perchè non necessital’utilizzo di dNTP marcati, ne di ddNTs, e non è necessaria laseparazione elettroforetica dei frammenti.• Il metodo è stato automatizzato e sono stati messi a puntosequenziatori che effettuano le determinazioni su molticampioni in parallelo, utilizzando DNA chip; in pratica in ciascunpozzetto è fissato un frammento di ssDNA. Il succedersi dellereazioni che avvengono contemporaneamentein tutti i pozzetti,il rilevamento, l’analisi e l’elaborazione dei risultati è gestito daun software dedicato, che riporta I dati in pirogrammi od intabulati riferiti a ciascun campione.• Con queste strumentazioni è possibile determinare in pocheore sequenze geniche di milioni di paia di basi.• E’ anche possibile anche effetuare contemporaneamenteun’analisi comparativa di DNA di origine diversa, e rilevare confacilità mutazioni di singole basi.

What is Next-Generation Sequencing?One can sequence hundreds of millions of short sequences(35bp-100bp) in a single run• Illumina/Solexa GA II / HiSeq 2000• Life Technologies/AppliedBiosystems SOLiD• Roche/454 FLX, Titanium• Helicos

Illumina was founded in April 1998• Illumina sells a number of very high-throughput DNAsequencing systems, DNA sequencers, based on technologydeveloped by Solexa. The technology features bridgeamplification to generate clusters and reversible terminatorsfor sequence determination. The technology behind thesesequencing systems involves ligation of fragmented DNA to achip, followed by primer addition and sequential fluorescentdNTP incorporation and detection.

Illumina sequencing technology• Library preparation: il DNA è frammentato, adenilato,oligonucleotidi adattatori sono legati a ciascuna estremità; iframmenti sono selezionati in base alle dimensioni e purificati.• Cluster amplification: i frammenti di DNA a singolo filamento sonoisotermicamente amplificate in celle di flusso per prepararle alsequenziamento. Le celle di flusso hanno degli oligonucleotidilegati, che si ibridizzano agli adattatori dei frammenti di DNA.Amplificazione del DNA: produzione di copie di DNAcovalentemente legate alle celle. Ogni copia della libreria èamplificata attraverso una serie di estensioni e di amplificazioniisotermiche a ponte. I filamenti “reverse” vengono tagliati edeliminati mediante lavaggio. Le estremità libere dei singolifilamenti di DNA nelle celle vengono bloccati.

Illumina Genome Analyzer 1 “flow cell” = 8 “lanes” 1 lane = ~10-30 million “reads” ~5-20 million “mapped reads” 36bp, 50bp, 75bp, 100bp Single-end (SE) or Paired-ends (PE) 1 lane: $800-$2000 Multiplexing

Illumina:Sequencing-bysynthesis

Illumina:Sequencing-bysynthesis

Illumina sequencing technology• Sequencing: appaiamento dei primers aiframmenti DNA. Estensione dei primersusando i 4 dNPT con legati 4 fluorofori. Lafluorescenza è rilevabile mediantel’eccitazione con un raggio laser. Rimozionedel blocco reversibile al 3’ OH, così che puòvenir legato un nuovo nucleotide fluorescente.• I quattro nucleotidi fluorescenti competonoper il legame.

ABI SOLiD (Seq by Oligo Ligation/Detection)• Clonal bead library via emulsion PCR.• The actual base detection is no longer done by the polymerasedrivenincorporation of labeled dideoxy terminators.• SOLiD uses a mixture of labeled oligonucleotides and queriesthe input strand with ligase.• Each base is interrogated twice:– built-in error checking capability that distinguishes betweenmeasurement errors and true polymorphisms;– detection of more complicated variations.

Overview of ABI SOLiD SequencingChemistry• Library Preparation Prepare one of the twotypes of libraries for SOLiD Systemsequencing-fragment or mate-paired. Yourchoice of library depends on the applicationyou're performing and the information youdesire from your experiments.

Emulsion PCR/Bead EnrichmentPrepare clonal bead populations in microreactors containingtemplate, PCR reaction components, beads, and primers.After PCR, denature the templates and perform bead enrichment toseparate beads with extended templates from undesired beads. Thetemplate on the selected beads undergoes a 3’ modification toallow covalent attachment to the slide.

Bead DepositionDeposit 3’ modified beads onto a glass slide. During beadloading, deposition chambers enable you to segment a slide intoone, four, or eight sections. A key advantage of the system is theability to accommodate increasing densities of beads per slide,resulting in a higher level of throughput from the same system.

Sequencing by LigationPrimers hybridize to the P1 adapter sequence on the templatedbeads .A set of four fluorescently labeled di-base probes compete forligation to the sequencing primer. Specificity of the di-base probeis achieved by interrogating every 1st and 2nd base in eachligation reaction.Multiple cycles of ligation, detection and cleavage are performedwith the number of cycles determining the eventual read length.Following a series of ligation cycles, the extension product isremoved and the template is reset with a primer complementaryto the n-1 position for a second round of ligation cycles.

SOLiD TechnologyLigation-basedchemistry with dibaselabelled probesOligos:– Positions 1-2 (from 3’ side): one of 16 dinucleotides– Positions 3-5: degenerate (Ns)– Positions 6-5’: degenerate and holds one of four fluorescent dyes• 5-7 ligation reactions are followed by a reset cycle• Next a new initial primer is used that is N-1 in length

Primer ResetFive rounds of primer reset are completed for each sequencetag . Through the primer reset process, virtually every base isinterrogated in two independent ligation reactions by twodifferent primers.For example, the base at read position 5 is assayed by primernumber 2 in ligation cycle 2 and by primer number 3 inligation cycle 1. This dual interrogation is fundamental to theunmatched accuracy characterized by the SOLiD System.

Exact Call ChemistryUp to 99.99% accuracy is achieved with the Exact CallChemistry Module by sequencing with an additionalprimer using a multi-base encoding scheme.

Working in “Colorspace”

Latest Platforms:Illumina HiSeq:• ~1 billion clusters• 30x coverage of two human genomesin a single run• ~10K per sample?• 1 x 35bp: ~1.5 days, ~30Gb• 2 x 50bp: ~4 days, 75-100Gb• 2 x 100bp: ~8 days, 150-200GbSOLiD 5500xl:• With microbeads or nanobeads• 20-45 Gb/day• 12 lanes• Similar run times as HiSeq• Up to 180-300Gb per run

Rapid Decrease in Cost•The Human GenomeProject: 13 years and $3billion.• Sequencing of the WatsonGenome by 454 in 2007:$2 million• Illumina: eight days at acost of about $10,000.• ~104 reduction in 5 yrs• Claims: a genome in 15minutes for $1000?

Campi di applicazione delle piattaforme NGS• Sequenziamento de novo e risequenziamentodi genomi completi.• Identificazione di siti polimorfici e mutazioni.• Analisi su larga scala del trascrittoma.• Mappaggio su scala genomica di siti diinterazione tra DNA (RNA) e proteine edanalisi epigenetiche dell’intero genoma.• Caratterizzazione del metiloma e studiodell’editing.