Dipartimento del Farmaco - Ministero della Salute

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CAPITOLO 4 Metodologia Isto-immuno-chimica Nell’ambito delle indagini isto-immuno-chimiche risultano fondamentali, oltre alle metodiche di colorazione classica ematossilina-eosina, tricromica di Heidenhain per il tessuto connettivo, Weigert Van Gieson per le fibre elastiche e collagene ed Alcian Pas per i mucopolisaccaridi. Le indagini immuno-istochimiche sono impiegate nel sospetto di miocardite e/o altra cardiopatia infiammatoria, per la caratterizzazione dell’infiltrato flogistico (CD45 antigene leucocitario comune, CD45RO e CD43 linfociti T, CD20 linfociti B, CD68 e MAC macrofagi) (2,15, 39). Lo studio del tessuto di conduzione, in caso di tracciato ECG positivo per blocco (seno-atriale, atrio-ventricolare, o branche) o preeccitazione ventricolare richiede una particolare competenza per il prelievo dei blocchi del nodo del seno e del nodo atrioventricolare-fascio di His, nonché degli anelli atrioventricolari laterali, in caso di sospette vie anomale di conduzione. Il taglio seriato al microtomo risulta obbligatorio per la perfezione dello studio. Tutte le sezioni istologiche, spessore 7-10 micron, vanno raccolte su nastro e due, ogni 10-15, vengono montate con colla non proteica su vetrino e colorate, alternativamente, con ematossilina-eosina e tricromica di Heidenhain. Le fettine intermedie vanno conservate per successive colorazioni fino al termine dello studio (16). Inoltre, per lo studio specifico del sistema nervoso, sezioni istologiche seriate vengono colorate, alternativamente, con ematossilina-eosina, impregnazione argentica e/o anticorpi monoclonali per neurofilamenti ed elementi schwanniani, cristal-violetto Kluver-Barrera per le guaine mieliniche e Grimelius per le cellule dei chemorecettori. Metodologia Microbiologica In tale ambito assumono pregnante rilievo le indagini di biologia molecolare con la tecnica di polymerase chain reaction (PCR) e reverse transcriptase (RT)-PCR, effettuata su campioni di sangue, miocardio e polmone prelevati all’autopsia, congelati e conservati in azoto liquido a -80°, o se non disponibile, su materiale incluso in paraffina (15). L’RT-PCR e PCR sono utilizzate per evidenziare la presenza di virus cardiotropi e sequenze genomiche ben definite, in soggetti deceduti per miocardite o cardiopatia di natura infiammatoria (da RNA-coxsackievirus, paramixovirus, influenza virus, hepatitis C virus- e DNA-cytomegalovirus, Epstein Barr Virus, herpes simplex virus, parvovirus, adenovirus, varicella zoster virus, epatite B). Quando viene evidenziata la presenza del virus nel miocardio si processa anche il sangue (se disponibile) per verificare se l’agente infettivo è la vera causa della patologia. Tali metodiche di biologia molecolare sono utilizzate anche nel sospetto di cardiopatia eredo-familiare geneticamente determinata; in tal caso, la regione codificante di ciascun gene, amplificata mediante reazione a catena (PCR), è sottoposta a screening di mutazioni mediante sequenziamento diretto o mediante DHPLC (WAVW Transgenomic) degli esoni “critici”, cioè esoni nei quali sono già state precedentemente descritte mutazioni patogene. Metodologia Tanatochimica L’intrinseca natura organolettica del sangue cadaverico, soggetto a precoce emolisi/autolisi, la carenza di dati sulla variabilità e stabilità post-mortali dei diversi parametri emato-chimici, riducono la validità diagnostica degli indicatori tanatochimici, il cui rilievo comunque inderogabile assume valore conoscitivo indiretto, rapportabile alla specifica peculiarità del caso in esame. 99
100 REPORTING SYSTEM / DOPING – ANTIDOPING / 2006 Metodologia Chimico-tossicologica Assumono altrettanta rilevanza le modalità quali-quantitative dei prelievi per esami chimico-tossicologici. In particolare, sussiste la necessità del costante prelievo di sangue venoso periferico, di urine ed umor vitreo, nonché di bile, liquido cerebro-spinale, e soprattutto di formazioni cheratiniche (peli, capelli, unghie), che consentono di ampliare la finestra cronologica di assunzione (41). Detti prelievi andranno sempre accompagnati dai frammenti dei principali organi (encefalo, polmoni, cuore, fegato, reni, milza, tessuto adiposo, muscolare ed osseo). Nell’ambito delle indagini laboratoristiche l’approccio di studio deve poter consentire analisi mirate per l’identificazione di specifici agenti, alla luce delle emergenze circostanziali, clinico-documentali e anatomo-isto-patologiche (Tab. 4.10), come anche indagini generiche indeterminate, mediante analisi tossicologica sistematica di ricerca, logica, chimico-analitica di agenti la cui presenza non è sospettata e la cui identità non è conosciuta. Conclusioni La trattazione sin qui esposta dimostra la sussistenza di un rischio di morte correlabile alla esposizione a sostanze e pratiche dopanti. L’incidenza del rischio, prevalente per gli anabolizzanti e gli stimolanti, sussiste anche per l’emodoping, l’ormone della crescita ed i diuretici. La carenza di dati epidemiologici, relativi al consumo di dopanti ed ai casi di morte correlabili, non consente di definire le reali dimensioni del fenomeno, certamente sottostimato. L’utilizzo di dopanti è accettato dalla collettività sportiva, anche in ragione della sottostima di pericolosità. L’incapacità di definire la reale pericolosità si traduce nel mancato allertamento delle istituzioni, deputate all’attuazione di interventi di prevenzione, educativo-informativi e repressivi. La comunità scientifica non ha sinora intrapreso le necessarie iniziative di ricerca poli ed interdisciplinare. La diagnosi di morte da dopanti, esempio paradigmatico della necessità di correlare i dati anamnestico-clinici, i reperti anatomo-patologici (macro e microscopici) e le risultanze chimico-tossicologiche, necessita di una corretta applicazione della criteriologia medico-legale e tossicologicoforense. È pertanto ineludibile l’elaborazione di protocolli metodologici standardizzati, comprensivi dello studio morfologico accurato di tutti gli organi-bersaglio di effetti tossici cronici (indicatori morfologici di consumo) e non solo del cuore e del sistema nervoso centrale. In analogia, le indagini di laboratorio devono essere mirate alla ricerca di agenti dopanti su una vasta gamma di matrici biologiche, utili a dimostrare tipologia, entità ed epoca di esposizione. La metodologia proposta lascia tuttavia insolute alcune problematiche, legate in primo luogo ad alcuni agenti (oggi non analizzati) ed allo sviluppo di nuove pratiche dopanti, prima tra tutte quella genetica, finalizzata alla implementazione nella produzione di sostanze endogene (es. fattori di crescita). La valutazione epicritica dei dati ottenuti nelle diverse fasi, utile ad identificare gli effetti acuti e cronici della sostanza o pratica sul soggetto deceduto, dovrebbe uniformarsi al processo deduttivo sintetizzato in Tab. 4.12, soprattutto in merito al ruolo di causa/concausa del decesso. Lo sviluppo di programmi di monitoraggio epidemiologico e di ricerca scientifica pluridisciplinare potrebbe fornire un efficace impulso alla revisione delle normative, favorendone anche l’evoluzione verso una maggiore diffusione ed efficacia dei controlli antidoping.
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Bibliografia CAPITOLO 2 • Legge 1
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