林怡廷

生化科技學系微生物學組專題討論
題目:Epstein-Barr Virus-Induced miR-155 Attenuates NF- B Signaling and Stabilizes
Latent Virus Persistence
作者:Fang Lu, Andreas Weidmer, Chang-Gong Liu, Stefano Volinia, Carlo M. Croce, and
Paul M. Leiberman
文章來源:Journal of Virology 82(21): 10436-10443, 2008
演講人:Yi-Ting Lin 林怡廷 B94B02013
指導老師:Li-Kwan Chang PhD 張麗冠博士
演講日期:May 12 th , 2009
演講地點:The 6 th Classroom
摘要
Epstein-Barr Virus (EBV)為疱疹病毒科 gamma 亞科的病毒,接近九成的人類受其感
染,與淋巴及上皮細胞組織的惡性腫瘤有密切相關。當 EBV 進入人體細胞後,絕大部
分都以潛伏的狀態存在於細胞中,但有少部分的病毒會自發性的進入溶裂循環 (lytic
cycle),產生大量的 EB 病毒顆粒並釋放到宿主細胞外,感染其它細胞。LMP1 (latent
membrane protein 1)為 EBV 潛伏期基因產物,是一種很強的 oncoprotein,也是 EBV 使 B
細胞進入不死化 (immortalization)的重要蛋白質。miR-155 為細胞中的 miRNA,由 BIC
轉錄而形成,可以與特定的 mRNA 的 3’-UTR 結合,抑制 mRNA 轉錄並降解 mRNA。
先前的研究指出 miR-155 可與 IKK 的 3’-UTR 結合,而 IKK 可以活化 NF- B,因
此本研究藉由觀察 miR-155 與 IKK 的相互關係,了解 miR-155 調控訊息傳導的機制。
研究中首先發現只有在感染 EBV 的 B 細胞中 LMP1 會誘導 miR-155 表現。細胞加入
miR-155 抑制劑後進行冷光分析發現 miR-155 會降低感染 EBV 的 B 細胞中 NF- B 的
活性。最後以西方點墨法和 real-Time PCR 偵測細胞中 IKK 蛋白質與 EBV 基因的含
量,證實 miR-155 會抑制 IKK 表現,進而調控 NF- B 與 IFN 訊息傳導路徑,並且
藉由調控 EBNA1 的 mRNA 的表現維持潛伏期 EBV 基因的穩定性。
前言
本研究之重要性
EBV 感染了逾九成的人類族群,與鼻咽癌等癌症有重要關聯,LMP1 為 EBV 潛伏
期產物,是一種很強的 oncoprotein,可以藉由許多訊息傳導路徑使 B 細胞進不死化。而
在 EBV 誘發的腫瘤中有大量的 miR-155,藉由研究 miR-155 與 EBV 潛伏期之訊息傳導
的關連性,可以了解 EBV 誘發 B 細胞不死化的詳細機制。
前人做過的研究
先前的研究發現 miR-155 在 B 細胞形成的惡性腫瘤與 EBV 誘發的腫瘤中大量表現
[1,2,3] ,也會參與正常 B 細胞的發育 [4,5] ,最近的研究也指出 miR-155 可與 IKK 的
1

3'-UTR 結合 [6] 。IKK 也被證實可以藉由磷酸化 RelA 與 c-Rel 來調控 NF- B [7,8] 。
作者為何要做本研究
由於目前對於 EBV 誘發 B 細胞不死化 (immortalization)的詳細機制並不清楚,先前
的研究又發現 miR-155 在 EBV 誘發的腫瘤細胞中大量表現,並且與 IKK 3'-UTR
結合。而 IKK 可以調控 NF- B,進而細胞內調節訊息傳導路徑。因此作者希望在此
研究中了解 miR-155 影響 B 細胞不死化的機制和訊息傳導路徑中扮演的角色。
本研究欲完成之項目
作者以 miRNA assay 證實在 EBV 感染之細胞中會持續表現 miR-155 與 BIC,之後
以 RT-PCR 偵測各種細胞感染 EBV 前後 BIC 與 actin 之相對量,確定 miR-155 在哪一種
細胞中表現,最後再觀察 miR-155 與 EBV 潛伏期訊息傳導路徑之關聯性。藉由上述實
驗,作者可以了解 miR-155 調節訊息傳導的機制。
材料方法
細胞株
Raji 細胞是由 Burkitt's 淋巴腫瘤分離出來的第三型潛伏期 B 細胞,LCL 細胞為感
染 B98-5 EBV 的第三型潛伏期 B 細胞,DG-75 細胞為未感染 EBV 的 Burkitt's 淋
巴腫瘤細胞。293T 細胞為未感染 EBV 的 HEK 細胞,ZKO 為感染 EBV 的 293T 細
胞,D98 細胞為感染 EBV P3HR1 病毒株的 HeLa 細胞。
miRNA array analysis
將細胞中 RNA 萃取出來後進行反轉錄 (reverse transcription),再以 Genepix Pro 6.0
進行分析。
冷光酵素分析 (Luciferase assay)
利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)將 miR-155 相似物送入 293T 細胞,LCL 細胞與
DG75 細胞則以電擊方式轉染 miR-155 抑制劑或相似物,培養 48 小時後以 Promega
Dual-Liciferase reporter assay system 進行冷光分析。
RT-PCR、real-time PCR
RNA 經過反轉錄酶 (reverse transcriptase)作用合成 cDNA,再以 Syber green 探針偵
測 cDNA 含量。
結果討論
EBV 感染細胞中持續表現 miR-155 與 BIC
以 miRNA assay 偵測人類血球細胞感染 EBV 前後各種 miRNA 的含量,發現在被
EBV 感染後 miR-155 會持續表現,而被 EBV 感染前或以 mock 感染之細胞不會表現
miR-155 (圖一 A)。以 RT-PCR 偵測 BIC 和 actin 之相對量可以發現在 EBV 感染後 BIC
RNA 的含量大幅提升 (圖一 B)。利用北方雜合法以 miR-155 的探針偵測第 4、5 與 6 號
樣本,發現在感染 EBV 後可以偵測到 miR-155 (圖一 C)。由上述結果可以得知感染 EBV
後會使細胞中 BIC RNA 含量增加。
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EBV 感染之 B 細胞中 BIC RNA 會大量表現
作者偵測 B 細胞與上皮細胞感染 EBV 前後 BIC、LMP1 和 EBNA-2 與 actin 的相對
量,發現感染 EBV 的 B 細胞 (Raji 與 LCL)中有很高的 BIC 表現,而上皮細胞 (293T、
ZKO 與 D98)不論有無感染 EBV,BIC 的表現量皆很低 (圖二)。由此結果顯示,只有被
EBV 感染的 B 細胞中 BIC 的表現量會增加。
LMP1 誘發 B 淋巴細胞中 BIC RNA 表現
將 LMP1 和 EBNA-2 轉染至未感染 EBV 的 B 細胞 (DG75)與上皮細胞 (293T)中,
偵測 BIC、LMP1 和 EBNA-2 與 actin 的相對量,發現當 DG75 細胞只轉染 LMP1 時 BIC
的表現量是未轉染 LMP1 的 7 倍 ;只轉染 EBNA-2 時 BIC 的表現量為未轉染的 3 倍;
同時轉染 LMP1 與 EBNA-2 也會使 BIC 的表現量增加,但增加效果比只轉染 LMP1 低 (圖
三 A、B、C)。而在 293T 細胞中,不論有無轉染 LMP1 和 EBNA-2,BIC 的表現量都不
會增加 (圖三 D、E、F)。由上述結果可以得知 LMP1 可在 B 淋巴細胞中誘發 BIC 表現。
miR-155 會降低 NF- B 訊息傳導
以具有 miR-155 可辨認之 3'-UTR 的冷光酶 (luciferase)基因的 LCL 細胞,加入
miR-155 抑制劑作用,再以冷光分析儀測量冷光值,發現加入 miR-155 抑制劑後冷光值
變高 (圖四 A),因此作者猜測 miR-155 可能參與 LMP1 訊息傳導路徑。LMP1 主要透過
NF- B 傳遞訊息,作者以含有 NF- B response element (5x B-L)的冷光酶基因的
LCL 細胞加入 miR-155 抑制劑,再偵測冷光值,發現 miR-155 抑制劑可以活化 5x
B-L (圖四 B)。以 miR-155 相似物作用在未感染 EB 病毒的 DG75 細胞,會使 5x B-L
的活化量降低 5 倍左右 (圖四 C),而 miR-155 相似物作用在 293T 細胞則沒有顯著的差
異 (圖四 D)。由以上結果可以得知 miR-155 可以降低感染 EBV 感染之 B 細胞中 NF-
B 的活性。
先前研究指出 IKK mRNA 為 miR-155 的目標物,因此作者利用西方點墨法偵測
IKK 蛋白質的表現量,由實驗結果得知在 LCL 細胞以 miR-155 抑制劑作用後 IKK
的表現量增加一倍;DG75 細胞以 miR-155 相似物作用後 IKK 的表現量減少一半 (圖
五 A)。以 RT-PCR 偵測 LCL 細胞與 Raji 細胞中 IKK 、BCL2 和 CCL5 的表現量,發
現 miR-155 抑制劑可以活化 BCL2 和 CCL5 的表現 (圖五 B、C),由上述結果可知 miR-155
會抑制 IKK 表現,進而調控 NF- B 與 IFN 訊息傳導路徑。
最後,作者利用 real-time PCR 偵測 LCL 細胞與 Raji 細胞中 EBV 基因的 copy
number。以 miR-155 抑制劑作用後,LCL 細胞與 Raji 細胞中 EBV 的 DNA 與 EBNA1
的含量皆降低 (圖六 A、B、C、D)。以南方雜合法偵測 Raji 細胞中 EBV 的 DNA 也可
發現經過 miR-155 抑制劑作用後,EBV DNA 的含量為控制組的一半 (圖六 E)。由以
上結果可以知道 miR-155 藉由調控 EBNA 的 mRNA 的表現維持潛伏期 EBV 基因的穩
定性。
參考文獻
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圖表
圖一、感染 EBV 的初級 B 淋巴細胞誘導 miR-155 與 BIC 表現。 (A)以 miRNA assay
analysis 偵測人類周邊血液細胞感染 EBV 前後以及感染 mock 後各種 miRNA 的表現。 (B)
以 RT-PCR 偵測人類周邊血液細胞感染 EBV 前後以及感染 mock 後 BIC 與 actin 之相對
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量。 (C)以北方雜合法偵測第 4、5、6 號樣本感染 EBV 前 (D0)、感染 EBV 後 (+)和感
染 mock (-)後 miR-155 含量。
圖二、感染 EBV 之 LCL 細胞中含有最多 BIC RNA。 以 RT-PCR 偵測各種細胞中 BIC
(A)、LMP1 (B)和 EBNA-2 (C)與 actin 之相對量。
圖三、B 細胞中藉由 LMP1 誘導 BIC RNA 表現。 未感染 EBV 的 DG75 細胞轉染 5
g 的 LMP1、EBNA2、LMP1+EBNA2 或 mock 基因,並與 Raji 細胞中 BIC (A)、EBNA-2
(B)及 LMP1 (C)對 actin RNA 的相對量比較。相同的實驗改用 293T 細胞,偵測細胞中
BIC (D)、EBNA-2 (E)及 LMP1 (F)對 actin RNA 的相對量。
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圖四、B 細胞中 miR-155 可調控 NF- B 訊息傳導路徑。 (A)LCL 細胞加入不同濃度的
miR-155 抑制劑或控制組抑制劑後,以冷光分析法偵測冷光值。LCL 細胞 (B)、DG75
細胞 (C)和 293T 細胞 (D)轉染 5x B-L 和 miR-155 基因後,以冷光分析法偵測冷光值。
圖五、miR-155 會抑制 IKK 路徑。 (A)DG75 細胞轉染 miR-155 相似物 (+)或控制組
(-)、LCL 細胞轉染 miR-155 抑制劑 (+)或控制組 (-),以西方點墨法偵測 IKK 與 PCNA
含量。 (B) LCL 細胞轉染 miR-155 抑制劑 (+)或控制組 (-),以 RT-PCR 偵測 IKK 、
BCL2 和 CCL5 含量。 (C) Raji 細胞轉染 miR-155 抑制劑 (+)或控制組 (-),以 RT-PCR
偵測 IKK 、BCL2 和 CCL5 含量。
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圖六、miR-155 在潛伏期穩定 EBV DNA 的 copy number。Raji 細胞 (A)和 LCL 細胞 (B)
中轉染 miR-155 抑制劑 (+)或控制組 (-),以 real-time PCR 偵測 EBV 的 DS DNA 與 actin
DNA 之相對量。Raji 細胞 (C)和 LCL 細胞 (D)中轉染 miR-155 抑制劑 (+)或控制組 (-),
以 RT-PCR 偵測 EBNA1 mRNA 與 actin DNA 之相對量。 (E)Raji 細胞中轉染 miR-155
抑制劑 (+)或控制組 (-),以南方雜合法偵測 EBV 的 DNA 與細胞端粒子 DNA (telomere
repeat DNA)。 (F)miR-155 與 EBV 造成的不死化以及穩定潛伏期之關係。
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