Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas - Laboratório de ...

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA E SEMENTES SINTÉTICAS
Guerra, M.P.; Torres, A.C.; Teixeira, J.B. 1999. Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas. In:
Torres, A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. (eds.). Culturas de Tecidos e Transformação Genética de
Plantas. Brasília, Embrapa-CBAB. v.2. p. 533-568.
Introdução
Embriogênese somática, adventícia ou assexual são têrmos usualmente empregados para
designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas desenvolvem através de diferentes
estádios embriogênicos dando origem a uma planta, sem que ocorra a fusão de gametas (Williams &
Maheswaran, 1986). Este processo constitui um exemplo da expressão da totipotencialidade das
células das plantas, postulado por Haberlandt (1902).
O padrão de desenvolvimento de um embrião somático em dicotiledôneas apresenta muitas
características morfológicas semelhantes as do embrião zigótico. Inicialmente, ambos são
caracterizados pela diferenciação de uma estrutura bipolar, constituída de ápice caulinar e radicular.
Ambos passam pelos estádios de desenvolvimento pró-embrionários e embrionários propriamente
ditos: globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar, num processo ontogenético que pode ser subdividido
em 20 diferentes estágios que representam tres grandes eventos (Jurgens e Mayer, 1992).
As estruturas internas do embrião somático globular e cordiforme são semelhantes aos equivalentes
zigóticos; a protoderme é evidente, bem como a polaridade, e no estádio cordiforme, simetria
bilateral (Smith, 1985). As principais diferenças entre os embriões somáticos e zigóticos relacionamse
com o fato de os embriões somáticos se desenvolvem livres de correlações físicas, fisiológicas e
genéticas que ocorrem durante o desenvolvimento de um embrião zigótico (Zimmermann, 1993) e
poderem apresentar desenvolvimento anormal. Uma particularidade dos embriões somáticos é a
presença de um sistema vascular fechado, sem conecção vascular com os tecidos do explante
inicial. Esta característica aliada a sua bipolaridade torna este modelo morfogenético distinto dos
processos de micropropagação e de organogênese.
A embriogênese somática in vitro foi descrita pela primeira vez, independentemente, por Steward
et al. (1958) e Reinert (1958) em cenoura, sendo também possível induzir embriões somáticos a
partir de células generativas (micrósporos) de Datura inoxia (Guha & Maheswari,1964) e Nicotiana
tabacum (Nitsch & Nitsch, 1969a,b). Atualmente, a embriogênese somática foi relatada em mais de
300 espécies (Bajaj, 1995).
A embriogênese somática pode ser natural e in vitro ou induzida. No primeiro caso, células dos
tecidos embrionários podem ser direcionadas para esta rota de desenvolvimento morfogenético,
como é o caso do sistema da embriogenia adventícia ou nucelar em Citrus sp, onde os embriões
apomíticos originam-se por gemação a partir de células do nucelo que representam o genoma
materno (Spiegel-Roy & Vardi, 1984). Estes embriões apomíticos são geneticamente idênticos à
planta-mãe e a consequência deste fenômeno é a perpetuação de populações clonais através da
semente.
Na embriogênese somática in vitro ou induzida, células haplóides ou diplóides (somáticas) em
diferentes estágios de diferenciação podem, se adequadamente induzidas, por estímulos ambientais
ou químicos, serem reprogramadas e adquirirem novas competências morfogenéticas.
A embriogênese somática in vitro é um método importante para propagação massal clonal de
genótipos superiores. Além disto é uma técnica de grande aplicabilidade para os estudos básicos
relacionados com a fisiologia, genética e bioquímica do desenvolvimento embrionário (Yeung, 1995).
Atualmente este sistema vem sendo utilizado para a obtenção de plantas transgênicas (Prakash &
Varadarajan, 1992; Gama, 1993) e sementes sintéticas (Schultheis et al., 1990).
Revisões recentes, abordando diferentes aspectos sobre este tema são encontradas, entre
outros, em Zimmerman (1993), Lindsey e Topping (1993), Goldberg et al., (1994), Meinke (1995),
Schmidt et al., (1994) e Dodeman et al., (1997).

Padrões e origem dos embriões somáticos in vitro
Dois padrões básicos de expressão da embriogênese somática são comumente observados in
vitro (Sharp et. al, 1980). O primeiro corresponde ao modelo direto no qual os embriões somáticos
originam-se dos tecidos matrizes sem a formação de estágios intermediários de calos. Este padrão
ocorre por exemplo, em células nucelares de variedades poliembriônicas de citros (Sharp et al.,
1982), em embriões imaturos de Malus pumila (James et al., 1984), de Medicago sativa e Trifolium
repens (Maheswaran & Williams, 1984), das palmeiras Euterpe edulis (Guerra e Handro, 1988) e em
inflorescências jovens de Euterpe edulis (Guerra & Handro, 1991). Um sistema referência para este
modelo é mostrado na figura 1 e foi desenvolvido por Guerra e Handro (1988 e 1991).
O segundo padrão corresponde ao modelo indireto no qual os embriões somáticos se formam a
partir de um tecido intermediário chamado calo, que apresenta células em diferentes estágios de
diferenciação e, consequentemente com diferentes graus de determinação. Estas células podem
adquirir novas competências mediadas por mensageiros químicos específicos, como será discutido
mais adiante. Um exemplo clássico deste sistema é a indução da embriogênese somática em tecidos
do floema secundário de cenoura Steward et al. (1958) e Reinert (1958).
Independentemente do padrão direto ou indireto, as células-mães embriogênicas apresentam
um conjunto de características comuns ao comportamento de células embrionárias em divisão ativa.
Estas características incluem o tamanho pequeno (100-200 µm), conteúdo citoplasmático denso,
núcleos grandes com nucléolos proeminentes, vacuolos pequenos e presença de grãos de amido. As
propriedades histoquímicas destas células sugerem intensa atividade metabólica e de síntese de
RNA (Tisserat et al., 1979; Sharp et al., 1980; Vasil, 1982).
Os têrmos complexo celular pró-embrionário e massa celular suspensor-pró-embrionária devem
ser empregados, respectivamente em angiospermas e gimnospermas, para designar grupos
celulares embriogenéticos polimórficos, em oposição ao têrmo calo. Neste último, as células-filhas
crescem de maneira desorganizada, a menos que elas tenham sido induzidas para padrões que
caracterizam calos embriogênicos. Neste caso, deve-se tomar cuidados uma vez que podem ocorrer
alterações genéticas causadas pelos substratos nas populações clonais originadas destes calos
(Durzan, 1988). Komamine et al. (1990) empregou o têrmo ‘celula embriogenética’ para definir as
células derivadas de tecidos somáticos, que atingiram a transição para um estágio em que não são
mais necessários estímulos externos para produzir um embrião somático.
Origem e ontogênese
As circunstâncias associadas à origem a partir de células simples ou múltiplas foram
propostas por Williams e Maheshwaran (1986) com base nas idéias formuladas por Sharp et al.
(1980), os quais procuraram distinguir entre embriogênese somática direta e indireta. Assim,
embriogênese somática direta passou a ser considerada para aqueles explantes que sofreram
poucas divisões celulares antes da indução embriogenética. Embriogênese somática indireta seria
aquela na qual os explantes passaram por um período longo de proliferação desorganizada, na
forma de calos, antes da indução embriogenética propriamente dita. Sharp e seus colaboradores
sugeriram que a embriogênese somática direta era característica de explantes nos quais as células
eram pré-determinadas para a rora embriogenética, como consequência da retenção de algumas
propriedades das células mersitemáticas parentais, das quais as células do explante derivam. Isto
poderia explicar a tendência da embriogênese somática ocorrer preferencialmente em explantes
derivados de tecidos embrionários ou juvenis. Já, a embriogênese somática indireta é considerada
como característica de explantes derivados de tecidos mais diferenciados, ou maduros, noa quais as
células devem passar por vários ciclos antes de adquirir a condição embriogenética.
Uma vez que não se dispõe ainda de marcadores confiáveis para definir `competência
embriogenética´ torna-se difícil conceituar pré-determinação. Além disso, as caracteristicas
associadas à embriogênese direta ou indireta não necessariamente indicam diferenças substanciais
nas características e atributos nas células envolvidas nesta rota morfogenética.
Morfogênese e fitorreguladores
Apesar dos avanços verificados no estudo da embriogênese somática, ainda é limitada a
compreensão dos estímulos e condições necessárias para a indução e controle deste processo. A

possibilidade de manipulação deste sistema experimental para fins tecnológicos depende do
domínio preciso de princípios de fisiologia do desenvolvimento. Desta maneira morfogênese pode ser
conceituada como a integração entre os processos decorrentes da divisão e diferenciação celular.
Por determinação celular define-se o processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma
célula torna-se limitado a uma rota específica (Christianson,1985), e por competência celular a
capacidade das células reagirem a sinais (que podem ser reguladores de crescimento) específicos
de desenvolvimento. Epigênese é aqui definida como a ativação seletiva e diferencial de genes
(reprogramação celular), envolvendo células receptivas ou tecidos responsivos. Exemplos
representativos de epigênese em plantas são a transição da fase juvenil para adulta e a camada de
abscisão em pecíolos de folhas. Para a embriogênese somática um exemplo de células receptivas ou
marcadas para a ativação epigenética é a camada epidérmica de explantes embrionários. Existem
evidências que a iniciação de poliembriões nucelares em Citrus sp ocorre em resposta a um estímulo
provocado pela alta biossíntese de fitohormônios, principalmente auxinas, que ocorre nas fases
iniciais da embriogênse zigótica. Em geral, na maioria dos modelos de embriogênese induzida in
vitro, as auxinas e entre elas o 2,4-D, são consideradas as substâncias responsáveis pelo
desencadeamento dos processos de desdiferenciação (modelos indiretos) e rediferenciação
(modelos diretos), alterando determinação e conferindo novas competências às células responsivas
presentes nos explantes.
Fitohormônios são uma classe de compostos químicos endógenos, facilmente transportados
para células responsivas, onde estão diretamente envolvidos com o contrôle da atividade gênica em
nível de transcrição e de tradução, em um grande número de processos. Supõe-se que estas células
responsivas são caracterizadas pela presença de receptores, que se ligam ao fitohormônio e,
subsequentemente, iniciam a resposta na célula. Estes receptores estão localizados nas
membranas, no citoplasma e no núcleo e são, na maioria dos casos, de origem proteica (van der
Linde, 1990). Células responsivas seriam aquelas que possuem sensibilidade, que foi definida por
Trewavas (1981) como sendo a competência de um tecido em responder a um sinal específico. Os
fitohormônios exercem sua ação através do reconhecimento de receptores específicos presentes em
células responsivas, traduzindo sinais hormonais em eventos bioquímicos e fisiológicos. Existem
similaridades nos mecanismos gerais de transmissão de sinais entre sistemas animais e vegetais,
contudo, os aspectos específicos revelam diferenças marcantes. Enquanto os primeiros tem uma
rota de sinais baseada principalmente no AMP cíclico, os segundos tem esta rota baseada em
proteinas quiinases dependentes de cálcio, que são enzimas específicas para plantas e que não são
utilizadas por animais. Além disto já está bem estabelecido o papel do cálcio e do potássio nos
sistemas de mensageiros secundários em plantas (Barendse & Peeters, 1995).
Tem sido proposto que a concentração de uma substância específica, presente em um
compartimento celular que contém receptores para aquela substância, determina a magnitude de
alguns processos regulatórios naquela célula. Aceita-se também que os reguladores de
crescimento não influenciam as respostas da planta exclusivamente através de mudanças na sua
concentração, mas que esta regulação também pode ser exercida através de mudanças na
sensitividade das células responsivas. Desta maneira, a resposta a um determinado fitoregulador
pode ser alterada por mudanças: a) no número e na afinidade dos receptores, e b) no nível de outras
substâncias endógenas (Firn, 1986). Estes aspectos analisados em conjunto explicam porque
determinados explantes são competentes para a embriogênese somática e outros não e porque
explantes de mesma origem, coletados em diferentes períodos apresentam respostas diferentes à
indução embriogenética. Traduzida desta maneira, a tão conhecida quanto vaga terminologia
‘estágio fisiológico do explante’ seria aquela condição na qual as células responsivas do explante
conteriam um grande número de receptores para aqueles reguladores de crescimento presentes no
meio de cultura.
O mecanismo de ação das auxinas sobre processos fisiológicos, proposto por van der Linde
(1990), relaciona-se com a formação de um complexo receptor proteico-hormônio no citoplasma.
Este complexo migra até o núcleo da célula onde promove a ativação da RNA-polimerase, a qual
aumenta a transcrição de genes envolvidos na regulação da divisão celular. O receptor é inativado
por fosfatases no núcleo, liberando o grupo fosfato e a auxina, sendo subsequentemente, reciclado
no citoplasma em uma conformação inativa. No citoplasma este receptor pode ser novamente
ativado se a concentração de cálcio livre for suficientemente alta para ativar a respectiva proteinaquinase
e se houver auxinas em concentração suficientemente alta para saturar o receptor.

Com base nisto, uma hipótese a ser postulada é a de que padrões diretos de embriogênese
somática seriam o resultado de uma ativação de células responsivas contendo receptores para
determinado regulador de crescimento. Estas células seriam rediferenciadas para novas rotas
morfogenéticas, gerando células-mães embrionárias competentes, que podem originar populações
clonais de células embriogenéticas. Padrões indiretos de embriogênese somática seriam produto de
uma desdiferenciação de células contendo estes receptores, gerando células calosas. Células
responsivas destes calos podem, por processo de indução, adquirir competência embrionária,
gerando populações clonais de células embriogenéticas.
De uma maneira geral, a embriogênese somática é induzida por auxinas fortes. Neste caso, uma
célula somática adquire competência para originar uma linhagen de células-filhas que irão formar
embriões somáticos. O têrmo célula embriogênica tem sido empregado para designar aquelas
células que já não necessitam mais de auxinas para produzir os embriões somáticos (De Jong et al.,
1993). Células em transição entre célula somática e célula embriogênica são chamadas de células
competentes (Toonen et al., 1994). A indução embriogenética de uma célula somática não é
exclusivamente dependente do uso de reguladores de crescimento. Choques térmicos, variações nos
níveis de pH e utilização de outros produtos químicos podem tambem induzir competência
embriogenética em células somáticas (Toonen et al., 1996).
Fatores que afetam a embriogênese somática
Explante
Em geral, quase todas as partes da planta podem ser usadas na indução da embriogênese
somática: ápices caulinares (Cantliffe et al. 1987; Chee & Cantliffe, 1988), hipocótilos (Halperin,
1966); discos foliares (Sondahl & Sharp, 1977); segmentos foliares (Rabéchault et al., 1970; Ahée et
al., 1981); inflorescências (Chu et al. 1984), raízes (Okamura et al. 1973), entre outros.
Em batata-doce cultivar "White Star", os ápices caulinares são excelentes explantes para
indução da embriogênese somática por apresentarem alta frequência de produção de calos
embriogênicos (Cantliffe et al., 1987). Uma vantagem adicional deste explante é relaciona-se com a
possível manutenção da identidade genética do material a ser propagado.
Um dos tecidos com maior competência embriogênica é o tecido epidérmico de cotilédones. Na
figura 4 são mostrados os estágios da embriogênese somática em Feijoa sellowiana, uma mirtácea
nativa do planalto de Santa Catarina. Nesta figura pode-se observar a iniciação dos embriões
somáticos diretamente sobre o tecido epidérmico cotiledonar.
Composição do meio nutritivo
Sais minerais
Meios com alta concentração salina tais como o de MS (Murashige & Skoog, 1962), o SH
(Schenk & Hildebrandt, 1972), e o B5 (Gamborg et al., 1968) têm sido usados pelos efeitos positivos
no crescimento e desenvolvimento de embriões somáticos. Amirato & Steward (1971) mostraram que
estruturas pró-embriônicas têm melhor desenvolvimento nestes meios quando comparados com o
desenvolvimento em meio de baixa concentração salina, como o de White (White, 1943).
A grande vantagem do meio MS é a presença do nitrogênio sob a forma de nitrato de amônio
(Ammirato, 1983). A forma pela qual o nitrogênio é adicionado ao meio de cultura é determinante no
sucesso da embriogênese somática. Sabe-se que a adição simultânea de compostos nitrogenados
na forma reduzida e de nitrato têm efeito estimulatório na embriogênese somática. (Halperin &
Wetherell, 1965; Reinert et al., 1967; Amirato, 1983; Gleddie et al., 1983). Nitrogênio na forma
amoniacal é essencial para o desenvolvimento do pró-embrião (Halperin & Wetherell, 1965; Kato &
Takeuchi, 1966) e na ausência de amônio nâo houve formação de embriões em cenoura. Para
Reinert et al. (1967) a quantidade de nitrogênio no meio é mais importante do que a forma do íon,
observando-se a formação de embriões em cultura de tecidos de cenoura tanto em presença de
KNO3 quanto de NH4NO3 .

Em meio contendo nitrato a adição dos aminoácidos L-glutamina; ácido L-glutâmico e α-alanina
favorece a produção de maior número de embriões somáticos formados e com melhor qualidade,
quando comparado com os resultados obtidos em meio suplementado com o ion amônia (Kamada &
Harada, 1979; Higashi et al., 1997). Para mostrar os diferentes efeitos dos aminoácidos e do íon
amônio foi medida a atividade da sintetase da glutamina (enzima chave na assimilação do
nitrogênio). A atividade desta emzima decresce durante os últimos estádios de desenvolvimento do
embrião (Higashi et al., 1997).
O potássio é outro íon fundamental para a embriogênese somática. Maior número de embriões
formados foi obtido pela inclusão de KH2PO4 ao meio contendo uma fonte de nitrogênio reduzido
Reinert et al., 1967). A exigência por potássio também foi mostrada por Brown et al. (1976) em
cultura de células de cenoura, onde o número de embriões produzidos se correlacionava com o
aumento da concentração de potássio no meio de cultura. Para Ipomoea batatas a proliferação de
calo embriogênico foi maior em meio suplementado com 30μM de KCl (Cantliffe, 1992).
O uso de quelatos de ferro pode favorecer o desenvolvimento de embriões somáticos in vitro.
Desenvolvimento dos embriões após o estádio globular foi inibido em meio desprovido de ferro
(Ammirato, 1983). O desenvolvimento normal de embriões androgênicos em Nicotiana tabacum
(Nitsch, 1969b; Havranek & Vagera, 1979) só ocorreu na presença de ferro no meio de cultura
Com relação ao cálcio, a forma em que este elemento é adicionado ao meio influencia o
processo da embriogênese. Tazawa & Reinert (1969) observaram que a adição de 28,4 mM de
Ca(NO3)2 no meio de cultura inibia a embriogênese somática em cenoura.
Concentrações de sódio entre 46-83 mM não mostraram nenhum efeito na embriogênese
somática de cenoura (Tazawa & Reinert,1969). Por outro lado, Wetherell & Dougall (1976)
observaram inibição da embriogênese na presença de sais de sódio.
Tem sido demonstrado que com a otimização e balanceamento adequados dos meios de cultura
feito por torna-se possível a redução na concentração dos reguladores de crescimento nestes meios
Preece (1995). Em alguns casos a combinação precisa entre a composição do meio de cultura e o
estágio fisiológico do explante pode até mesmo eliminar a necessidade de suplementação de
reguladores de crescimento, como é o caso da indução de culturas poliembriogenéticas do Pinheiro
do Paraná (Araucaria angustifolia) à partir de explante de pró-embriões zigóticos (Guerra, M.P.,
dados não publicados) cultivados em meio LP (von Arnold & Erikson, 1981).
Para a embriogênese somática normalmente são empregados pelo menos dois diferentes meios
de cultura. O primeiro meio é otimizado visando a indução da embriogênese somática, enquanto que
o segundo meio visa permitir o desenvolvimento dos embriões somáticos. As condições que
favorecem a primeira fase geralmente, inibem a segunda.
Carboidratos
Vários trabalhos têm observado os efeitos da concentração e tipo de carboidratos na
embriogênese somática. Infelizmente, nestes estudos não se determinou se o efeito dos carboidratos
ocorre na iniciação ou no desenvolvimento dos embriões.
A sacarose tem é a fonte de carboidrato mais usada para a embriogênese somática, embora
outros mono e dissacarídios possam ser utilizados. A concentração de sacarose influencia nos
processos de iniciação e diferenciação dos embriões somáticos, uma vez que o seu metabolismo em
plantas é regulado por um grupo de genes (sacarose sintase e sacarose invertase) cujas respostas
são moduladas de acordo com a variação da sua concentração (Koch et al., 1995).
Em geral a concentração de 3% de sacarose é satisfatória para os processos de iniciação e
diferenciação. Em algumas situações, por exemplo, em Ipomoea batatas a transferência dos calos
embriogênicos para meio desprovido de substância reguladora de crescimento, deve ser
acompanhada da redução da concentração de sacarose para 1,6% para favorecer a produção de
embriões e sua conversão em plantas (Cantliffe, 1992).
Homes (1967) observou em cenoura o aumento no número de embriões formados com o
aumento da concentração de glucose do meio nos níveis de 0 a 10%. Essa correlação também foi
mostrada em cultura de células de Ranunculus onde o número máximo de embriões formados foi
em meio com até 2% de sacarose; concentração de 5% deste açucar inibia ligeiramente este

processo (Konar & Nataraja, 1969). Masuda et al. (1981) observaram que sacarose ou maltose foram
os carboidratos mais efetivos na indução de embriogênese somática em cenoura, quando
comparados com glucose, manose, rafinose e glucose + frutose.
Substâncias reguladoras de crescimento
Atenção tem sido dada ao tipo, concentração e período de tempo em que os reguladores de
crescimento são mantidos na cultura, objetivando minimização da sua concentração e tempo de
exposição (Ammirato, 1989). As auxinas e citocininas, estas nem sempre necessárias, têm papel
fundamental na embriogênese somática de várias espécies de plantas. Algumas espécies
necessitam que o meio seja suplementado com ácido giberélico ou ácido abscísico para o
desenvolvimento de embriões somáticos, enquanto outras não necessitam desta suplementação
uma vez que o processo de indução foi estabelecido.
Auxinas
As auxinas estão envolvidas com a indução e a iniciação de embriões somáticos. Tem sido
sugerido que as auxinas são necessárias para a formação de agregados embriogênicos a partir de
células individuais expresando a totipotencia das células competentes (Komamine et al., 1992). Em
muitas espécies, o processo de iniciação se verifica ao se cultivar o explante em meio com
concentração relativamente elevada de 2,4-D. O desenvolvimento subsequente dos embriões
somáticos ocorre após transferência do calo ou suspensão celular para meio com baixa
concentração de auxinas, ou desprovido desta delas (Halperin & Wetherell, 1964; Reinolds &
Murashige, 1979; Chée & Cantliffe, 1988). Isto ocorre porque após a iniciação, as auxinas,
particularmente o 2,4-D, inibem o desenvolvimento subsequente dos embriões. Tem sido sugerido
que a manutenção prolongada das culturas embriogênicas em meio com 2,4-D causa variações
genéticas e epigenéticas que afetam o potencial embriogênico (Caligari & Shohet, 1993). Observouse
em alguns sistemas que os embriões somáticos tornam-se habituados durante períodos
prolongados de sub-cultivos em 2,4-D, resultando na perda do potencial de maturação (Tautorus et
al., 1991). Em Ipomoea batatas culturas submetidas a longos peródos em 2,4-D perdem a
capacidade dos embriões converterem em plantas.
O efeito das auxinas no desenvolvimento de embriões somáticos é primariamente inibitório, e se
manifesta nos estádios subsequentes ao globular. Isto foi demonstrado pelo trabalho de Halperin e
Wetherell (1964), em cenoura, em culturas mantidas em meio com 1 mg/l de 2,4-D. Newcomb &
Wetherell (1970) também verificaram que, na presença de 2,4-D, os embriões somáticos se
desenvolviam até o estádio de pró-embrião. Desenvolvimento posterior para os estádios globular,
cordiforme, maturo e plantas adultas só ocorria em meio desprovido de 2,4-D.
Citocininas
As citocininas podem favorecer a produção de calo embriogênico (Chée & Cantliffe, 1988), mas,
em algumas famílias, como a Umbelliferae, elas parecem não serem necessárias (Ammirato, 1983).
Schenck & Hildebrandt (1972), entretanto, afirmaram que baixas concentrações de citocininas são
necessárias para a embriogênese somática na maioria das culturas de células de dicotiledôneas. Em
suspensão celular de soja foi mostrado que a zeatina não foi efetiva, que a benziladenina foi
adequada e que a cinetina teve ótimo efeito na formação de embriões somáticos (Phillips & Collin,
1981). Recentemente, Gosukonda et al.(1993) observaram que o thiadizuron apresentou a melhor
resposta para produção de embriões somáticos em batata-doce entre as várias citocininas testadas
Ácido Abscísico
O ácido abscísico afeta o desenvolvimento de embriões somáticos. Fujimura e Komamine (1975)
observaram que embora o número total de embriões somáticos em desenvolvimento decrescia com
o aumento da concentração de ácido abscísico no meio, o número de embriões que permaneciam
nos estádios globular e cordiforme não se alterava. Isto indica que todo o processo de embriogênese
somática foi inibido e não apenas o desenvolvimento dos embriões dos estádios precoce aos
tardios. Concentrações de ABA entre 10 -4 - 10 -7 podem favorecer o crescimento, desenvolvimento e
produção de embriões somáticos normais, evitando a germinação precoce dos mesmos (Ammirato,
1977). Quanto mais cedo se adicionar o ABA no meio de cultura, mais efetivo é o seu efeito no

desenvolvimento normal dos embriões. A inclusão de ABA também, aumenta a frequencia de
embriões somáticos produzidos e sua conversão em plantas (Zheng et al. 1993).
Ácido Giberélico
Em alguns casos, o ácido giberélico tem sido usado para a conversão de embriões somáticos
em plantas. A concentração de 1 mg/l de GA3 estimulou a formação de raízes em embriões
somáticos de nucela de Citrus (Button e Borgnman, 1971). Também foi demonstrado o efeito
estimulador do ácido giberélico no enraizamento de embriões somáticos (Kochba et al. 1974). O GA3
nas concentrações entre 1 e 5 mg/l aumentava o enraizamento dos embriões; em combinação com
sulfato de adenina (27 mg/l) e este regulador de crescimento apresentou um efeito direto na
iniciação do desenvolvimento da raiz ou no desencadeamento do desenvolvimento inicial de raizes
pré-formadas.
Efeitos negativos de ácido giberélico no desenvolvimento de embriões somáticos de cenoura foi
observado por Fujimura e Komamine (1975), onde o aumento da concentração de GA3 de 10-8 a 10 -5
M correspondia a um decréscimo no número total de embriões somáticos produzidos.
Outras Substâncias
Recentemente, Desamero et al. (1993) desenvolveram um protocolo de induzir embriogênese
somática direta em batata-doce, a partir de explantes de ápices caulinares com 1 a 3 primórdios
foliares (0.3 a 0.5 mm de tamanho), suplementado o meio de cultura com combinações de ácido
picolínico (2 e 3 mg/l) e cinetina (0.25 e 1 mg/l).
A embriogênese somática também pode ser induzida quando agua de côco, extratos de
levedura, caseína hidrolisada são adicionadas a esta formulação básica (Kohlenbach, 1976).
Concentração Osmótica
O aumento da concentração osmótica do meio pela adição de sacarose, sorbitol ou manitol
previne a germinação precoce e o desenvolvimento anormal de embriões somáticos em cultura de
células de cenoura (Ammirato & Steward, 1971).
Luz
Em geral, o processo de indução e iniciação de embriões somáticos é realizado no escuro. A luz
afeta o desenvolvimento dos embriões somáticos somente após a iniciação. Entretanto, em
Ranunculus sceleratus o desenvolvimento de embriões somáticos foi similar tanto no escuro, quanto
na luz (Komar e Nataraja, 1969).
Estágios e modulação da embriogênese somática
Uma estratégia geral a ser empregada para a indução e modulação da embriogênese e
poliembriogênese somática encontra-se esquematizada na figura 2. O primeiro passo consiste em
determinar na planta matriz a melhor fonte de explantes. O processo básico consiste de dois ciclos.
No ciclo A, um explante juvenil ou embrionário, por exemplo um embrião zigótico, em estágio inicial
de desenvolvimento, é inoculado em meio contendo 2,4-D. Estas culturas são normalmente mantidas
no escuro e geram complexos ou massas celulares pró-embrionárias, que por processos de
embriogênese repetitiva, representados por fenômenos de clivagem e gemação, resultam em um
ciclo repetitivo de divisões celulares, formando complexos celulares suspensor-embrionários, no
caso de gimnospermas e de embriões somáticos globulares, no caso de angiospermas. Biorreatores
podem ser empregados para a produção em larga escala das culturas nesta fase. No ciclo B, esses
pró-embriões são estimulados a prosseguir o seu desenvolvimento pela retirada das auxinas no
meio, ou pela inclusão de ABA, citocininas e de agentes que promovam um estresse osmótico. Nesta
fase as culturas são mantidas em condições de luminosidade. Esse ciclo de maturação forma
embriões somáticos que podem ser convertidos a plantas ou que podem então então serem
encapsulados para a obtenção de sementes sintéticas. Cada uma destas fases será detalhada a
seguir.

Iniciação das culturas embriogenéticas
Como já foi descrito anteriormente, culturas embriogenéticas são geralmente iniciadas à partir de
explantes embrionários, juvenis ou maduros cultivados em meios semi-sólidos, contendo altos níveis
das auxinas ANA, 2,4-D, e Picloran (20-100 µM) com ou sem uma das citocininas BAP, KIN,
Thidiazuron (10-20 µM). Em modelos diretos, a primeira expressão morfogenética é o surgimento de
estruturas globulares brancas e translúcidas que correspondem a embriões somáticos globulares.
Em modelos indiretos, inicialmente há a diferenciação de calo e o surgimento neste de setores
friáveis, normalmente brancos e translúcidos, convencionalmente designados de massas ou
complexos celulares pró-embriogenéticos, os quais dividem-se para formar pró-embriões somáticos.
Além das características morfológicas as massas calosas e pró-embrionárias podem ser distinguidas
por características citoquímicas. Células que reagem fortemente ao corante Carmin Acético e
fracamente ao Azul de Evans são embriogenéticas e células com reação fraca ao primeiro e
intermediária ao segundo são células calosas (Durzan, 1988).
São necessários quatro ou cinco sub-cultivos em placas de petri contendo meios semi-sólidos
para que ocorra a purificação e estabilizacão destas culturas, de tal maneira que elas possam ser
consideradas linhagens celulares embriogenéticas.
Manutenção, multiplicação e cultura massal
A estratégia, neste caso, consiste em determinar as condições adequadas para o
estabelecimento de ciclos repetitivos de divisão celular e o controle restrito dos processos de
diferenciação, de tal maneira que as culturas sejam constituídas por células pró-embrionárias ou
embriões somáticos em estágios globulares iniciais de desenvolvimento. Suspensões celulares são
mais adequadas, podendo ser cultivadas em biorreatores ou frascos Erlenmeyers sob agitação. Um
sistema simples, eficiente e de baixo custo e facilmente adaptável às condições dos laboratórios
brasileiros, consiste no emprego do agitador rotatório, com as células sendo multiplicadas em balões
voluméticos modificados de 1.000 ml. Esta modificação consiste na alteração das paredes laterais do
balão para a soldadura de pontas de tubos de ensaio e a formação de protuberâncias (nipple-flasks).
Estes frascos são fixados por molas em uma placa de acrílico perfurada no tamanho do diâmetro do
balão volumético. Cada placa contendo seis balões gira (1 rpm), em torno de um eixo horizontal
levemente inclinado, que pode conter quatro destas placas. Cada aparato completo pode conter
quatro eixos, perfazendo um total de 96 balões volumétricos. Este equipamento nada mais é do que
uma adaptação do sistema empregado por Steward em seus experimentos com células
embriogênicas de cenoura.
Para o estabelecimento de ciclos repetitivos de divisão celular e a cultura massal (scale-up)
destes complexos pró-embriogenéticos, inocula-se uma determinada quantidade dos mesmos em
frascos Erlenmeyers ou balões volumétricos de 1.000 ml, contendo 250 ml de meio de cultura. para
iniciar as culturas a quantidade de 2 a 5 g ou de 5 a 10ml de volume sedimentado destas linhagens
são suficientes. A partir disto pode-se estabelecer a curva de crescimento, determinando-se as
fases lag, exponencial, linear e estacionária e, adicionalmente, pode-se determinar o índice mitótico
para cada fase desta curva e o volume ou peso final na fase estacionária, avaliando-se também
através de monitoramento histoquimico a qualidade destas culturas. Com isto é possível determinar o
intervalo médio de sub-cultivos, que serão feitos quando as culturas estiverem no ponto mediano da
fase linear da curva de crescimento e a quantidade de biomassa celular que gerará o número
desejado de embriões somáticos ao final do ciclo.
O principal ponto de contrôle da manutenção das linhagens em ciclos repetitivos diz respeito à
uma redução considerável nos níveis dos reguladores de crescimento. Nos vários sistemas em
funcionamento, observa-se que as concentraçoes médias destes reguladores nesta fase estão na
faixa de 2 a 5 µM para as auxinas e de e 2 a 5 µM para as citocininas (Gupta et al., 1993).
Estas culturas deverão ser mantidas no escuro, em salas de cultura com temperatura média de
25oC. Devido a maior possibilidade de contaminação da cultura em meio líquido, recomenda-se a
manutenção de um estoque de culturas em meio semi-sólido, em placas de petri, e em estufa

incubadora ajustada para temperaturas mais baixas, para que as repicagens mensais sejam
suficientes para manter as culturas em condições adequadas. No Laboratório de Cultura de Tecidos
do CCA/UFSC, linhagens celulares embriogenéticas de Picea abies tem sido mantidas em sistema
de suspensões no aparato de Steward e em plaqueamento, em ciclos repetitivos de divisão celular
desde 1991, sem perda no potencial morfogenético. Havendo protocolos e recursos disponíveis, a
criopreservação em N líquido pode ser uma alternativa para preservação das linhagens celulares.
Desenvolvimento e maturação
A próxima fase da embriogênese somática consiste em estimular a progressão das fases iniciais
para as fases tardias. A estratégia a ser empregada consiste em interromper os ciclos repetitivos de
divisão celular e fornecer os estimulos fisiológicos, bioquímicos e ambientais para a diferenciacão
celular para que os ciclos de desenvolvimento e de maturação originem um grande número de
embriões somáticos maduros, de alta qualidade e aptos a converterem em plantas.
O conhecimento dos processos e fatores que controlam a embriogênese zigótica é de
fundamental importância para que se procure reconstituir ao máximo os mesmos durante a
embriogênese somática in vitro. Desta maneira as estratégias discutidas a seguir guardam relação
direta com estes eventos.
O aumento da osmolaridade parece estar relacionado com a transição do ciclo
divisão/diferenciação e este aumento pode ser obtido pela adição de PEG, mio-inositol, sorbitol e
manitol, de tal maneira que o meio de cultura esteja ajustado em valores de 200 a 350 mM . O ABA a
exemplo de seus efeitos na embriogênese zigótica exerce efeito notável nesta fase e nas
concentrações de 25 a 100 mg/l pode impedir processos de clivagem e gemação que são a
expressão morfogenética dos ciclos repetitivos de divisão e dos estágios iniciais da diferenciação e
que muitos autores convencionaram conceituar como embriogênese repetitiva ou secundária. Desta
forma o efeito conjunto do ABA e dos agentes osmóticos, principalmente o PEG de peso molecular
entre 1.000 - 8.000, resulta na síntese e acumulação de produtos de reserva, de forma similar aos
eventos desta fase na embriogênese zigótica. Com este método podem ser produzidos 50 a 100
embriões somáticos cotiledonares de alta qualidade, por cada ml de volume sedimentado de
suspensões celulares de Picea abies, o que significa um potencial produtivo de 50.000 a 100.000
embriões somáticos por litro de suspensões celulares, os quais podem apresentar até 90% de taxa
de conversão para plantas .
Poliembriogênese somática
Poliembriogênese somática pode ser definida como a reconstituição por processos de clivagem e
gemação de mais de um embrião à partir de um complexo celular suspensor-embrionário préexistente
na embriogênese zigótica de coníferas, diferenciando este processo daquele observado na
embriogênese somática de angiospermas. Esta terminologia foi empregado primeiramente por Gupta
& Durzan (1986) para descrever o processo adventício originado a partir de células do suspensor de
embriões zigóticos de Pinus lambertiana. Para estes autores o modelo de poliembriogênese
somática observado em Pinus é o que mais se aproxima do processo de poliembriogênese zigótica
em coníferas. Desde o início da manipulação experimental in vitro deste fenômeno, consideráveis
progressos foram obtidos com esta técnica, comparativamente aos avanços observados nos
laboratórios que trabalham com a embriogênese somática em angiospermas. Atualmente várias
espécies de coniferas podem ser regeneradas in vitro através destas técnicas. Na maioria dos casos
embriões zigóticos imaturos e maduros tem sido empregados para iniciar as culturas embriogênicas,
embora gametófitos femininos também apresentam potencial para produzir culturas embriogenéticas
passíveis de regenerar plantas, como é o caso de Larix decidua (Nagmani & Bonga, 1985).
O domínio completo deste sistema regenerativo em coníferas foi relatado pela primeira vez. por
Chalupa (1985) e Hakman et al. (1985) ao cultivarem embriões zigóticos maduros e imaturos de
Picea abies. Estes embriões quando inoculados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) ou LP (von
Arnold & Eriksson, 1981), contendo 10 a 20 µM de 2,4-D e 5µM de BA, originaram um tecido branco

e translúcido denominado de tecido embriogenético, constituído por células alongadas e vacuoladas
do tipo suspensor e por células pequenas com citoplasma denso na região do ápice embrionário.
Conhece-se muito pouco acerca da iniciação e desenvolvimento da poliembriogênese somática
em coníferas e tres diferentes hipóteses foram sugeridas por Hakman et al. (1987) para explicar a
origem deste processo: 1) embriões somáticos podem se originar de células simples ou pequenos
agregados celulares por uma divisão inicial assimétrica que delimita a região apical embrionária da
região do suspensor. No caso de Picea abies e P. glauca, as divisões celulares desiguais nas
camadas epidérmicas e sub-epidérmicas da região do hipocótilo resultam na formação de próembriões
(Nagmani et al., 1987); 2) embriões somáticos podem se desenvolver a partir de células
meristemáticas da região do suspensor, sendo que as iniciais podem se originar por divisão
assimétrica (Hakman et al.,1987; Schuller et al., 1989); 3) embriões somáticos podem se originar por
um mecanismo similar à poliembriogênese por clivagem, com a separação inicial, ocorrendo na
região do ápice embrionário. Este processo foi descrito em culturas de embriões somáticos de Abies
alba (Schuller et al., 1989), espécies de Pinus e Picea (von Arnold & Woodward, 1988).
Fatores que afetam a poliembriogênese somática
A seleção criteriosa do explante é fator crítico para a indução da embriogênese somática em
coniferas. Diferentes tecidos da mesma planta ou tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento
podem originar diferentes respostas in vitro. Em Picea glauca, por exemplo, apenas uma entre várias
épocas de coleta de cones revelou respostas morfogenéticas (Lu & Thorpe, 1987). Efeitos similares
do estágio de desenvolvimento foram observados em Pinus lambertiana (Gupta & Durzan, 1986) e
Pinus taeda (Becwar et al., 1990). De maneira geral, em espécies de Pinus, embriões zigóticos em
estágio pré-cotiledonar são os melhores explantes para a indução de tecidos embriogenéticos,
enquanto que nas espécies de Picea, este resultado é obtido com embriões em estágio cotiledonar.
Estes aspectos mostram a importância da época de coleta dos explantes e sugerem a existência de
um estádio de desenvolvimento em que o explante é altamente responsivo à indução embriogênica.
Em Larix decidua verificou-se o desenvolvimento de tecidos embriogênicos a partir das regiões
da chalaza e da micrópila do megagametófito em cultura (von Aderkas et al., 1987). A indução de
tecido embriogênico haplóide somente é possível durante um curto período de desenvolvimento do
cone feminino. Este tecido demonstrou autotrofia para reguladores de crescimento, já que a indução
embriogenética ocorreu em meio de cultura desprovido de auxinas e citocininas, sugerindo que o
megagametófito poderia suprir os hormônios necessários para a iniciação da embriogênese (von
Aderkas et al., 1990).
Em explantes de sementes imaturas de Pinus lambertiana, a presença do gametófito feminino
pode auxiliar no estabelecimento de culturas embriogênicas e esta indução é mais intensa quando o
embrião dominante é removido (Gupta & Durzan, 1986). Não se conhece, contudo, se esta
dominância está relacionada com a presença de inibidores ou de outros fatores.
Em Araucaria angustifolia e em Pinus elliottii a indução de linhagens celulares poliembriogênicas
é dependente do estádio de desenvolvimento do pró-embrião zigótico, sendo que os complexos
celulares suspensor-embrionários surgem a partir das células do ápice embrionário. Esta indução
ocorre em meios contendo 2,4-D, BAP e KIN e ciclos repetitivos de divisão celular foram
estabelecidos, permitindo a cultura massal destas células (Guerra et al., 1993). Na figura 3 são
apresentados os principais estádios de desenvolvimento de um modelo poliembriogenético em A.
angustifolia e Picea abies.
O emprego de embriões zigóticos maduros de sementes armazenadas pode proporcionar
explantes durante todo o ano. Culturas embriogenéticas de Picea glauca (Tremblay, 1990) e de
Picea mariana (Tautorus et al., 1991) foram iniciadas a partir de embriões zigóticos maduros
armazenados por 11 e 13 anos respectivamente. Depois de quatro semanas em cultura, os explantes
produziram um exsudato marron na região do hipocótilo e da radícula, bem como apresentavam um
intumescimento dos cotilédones. Tecidos embriogênicos foram observados surgindo na região citada
seis a oito semanas após a inoculação.
Meios de cultura e reguladores de crescimento

Existem poucos estudos sobre quais constituintes do meio de cultura podem ser considerados
essenciais para a indução e manutenção da poliembriogênese somática. Os reguladores de
crescimento 2,4-D e BA tem sido amplamente empregados nas concentrações de 10 e 5 µM
respectivamente, para a indução e manutenção em ciclos repetitivos de divisão celular de culturas
poliembriogenéticas de várias espécies de coníferas. Agentes que provocam estresse osmótico,
notadamente o polietileno glicol (PEG) e o ABA parecem promover a progressão dos embriões
somáticos para o estágio policotiledonar. A manipulação desta técnica para fins de propagação
clonal massal depende de uma série de fatores tais como a fonte e estágio de desenvolvimento do
explante, o meio de cultura e seus complementos, os reguladores de crescimento, o estabelecimento
de ciclos repetitivos de divisão celular e de ciclos de maturação e a frequência de subculturas.
Modificações dos componentes do meio e das condições de cultura podem afetar
significativamente a indução de tecido embriogenético, principalmente de explantes maduros (Atree
et al., 1990; Tautorus et al., 1991). Os fatores mais importantes são: fotoperíodo, concentrações e
constituintes do meio básico (principalmente, sacarose e nitrogênio), agente geleificante, reguladores
de crescimento e pH. Portanto, uma otimização do meio deverá ser conduzida para cada espécie
utilizando-se várias linhagens celulares (Tautorus et al., 1991).
Embriogênese somática e sementes sintéticas
Uma vez que os embriões somáticos são estruturalmente similares aos embriões zigóticos tornase
vantajoso combinar a eficiência e o baixo custo das sementes como fonte de propágulos com a
produção clonal massal in vitro de embriões a partir de células somáticas. A inserção de sequências
gênicas em células somáticas pode também permitir que embriões somáticos transgênicos sejam
produzidos e multiplicados em grande escala em sistemas automatizados (Gray & Purohit, 1991).
O conjunto de técnicas que visa o emprego de embriões somáticos como sementes funcionais é
chamado de tecnologia de sementes sintéticas ou artificiais. As principais vantanges potenciais deste
método relacionam-se com: a) a produção de grande quantidade de propágulos em curto espaço de
tempo; b) a manutenção da identidade clonal; c) a semeadura direta a campo, eliminando estruturas
caras de aclimatização, sementeiras e viveiros; c) o baixo custo por planta. Para espécies florestais,
pode-se acrescentar que a produção de sementes sintéticas em laboratório pode ocorrer ao longo do
ano e não depender de perdas por condições climáticas desfavoráveis, ataques de pragas e doenças
e anos de baixa produção, aspectos estes comumente associados com a produção de sementes
principalmente em espécies florestais.
Das diferentes técnicas disponíveis, o sistema de encapsulamento em gel é o mais empregado.
Redenbaugh et al. (1986) foram os primeiros a propor o uso de um hidrogel como o alginato de sódio
para a produção de sementes artificiais, observando frequências de 86% de conversão em
sementes sintéticas de alfafa..
O alginato de sódio é o principal gel para o encapsulamento devido as suas propriedades
geleificantes, baixo custo, facilidade de uso e ausência de toxicidade. O procedimento básico para o
encapsulamento consiste na mistura dos embriões somáticos com o alginato de sódio a 2% (p/v).
Com o auxílio de uma ponteira de ependorf e de uma chupeta aspira-se o embrião somático e a
matriz de gel, podendo-se obter sementes sintéticas de diferentes formas e tamanhos que são
colocadas em uma solução de nitrato de cálcio (30 a 100 mM) por períodos de 10 a 30 minutos. O
alginato de sódio, na presença de cátions di e trivalentes, complexa-se e forma o alginato de cálcio.
Os cátions metálicos formam ligações iônicas entre o ácido carboxílico das moléculas de ácido
gulurônico do alginato. A resistência e dureza da cápsula são funções da proporção entre os ácidos
gulurônico e manurônico, os cátions e o tempo de complexação (Redenbaugh et al., 1988). Este
aspecto é importante pois em alguns casos, a dureza excessiva da cápsula impede ou dificulta a
conversão dos embriões para plantas. Além disto as cápsulas de hidrogel podem desidratar e
dificultar trocas gasosas, limitando o período de armazenamento no escuro e em baixas
temperaturas por um período máximo de 1 mes (Redenbaugh et al., 1991). Na figura 3I, e 4E
observam-se embriões somáticos de P. abies e de Feijoa sellowiana encapsulados por este
método.
Esta técnica tem sido continuamente aprimorada de tal maneira que a partir de uma análise
qualitativa e quantitativa dos componentes do endosperma de uma semente, pode-se reconstituir e
adicionar nutrientes inorgânicos e orgânicos, agentes protetores bem como microorganismos

enéficos (micorrizas) ao hidrogel. Uma análise cromatográfica e a posterior adição dos aminoácidos
presentes no endosperma de sementes do palmiteiro (Euterpe edulis), pode auxiliar na
reconstituição de um endosperma sintético de alta qualidade nutricional no encapsulamento de
embriões somáticos desta espécie (Guerra, M.P., dados não publicados). Em sementes sintéticas de
Picea mariana a adição de sais, sacarose e carvão ativado ao alginato de sódio a 3%, resultou em
taxas de germinação de 40-50% após o armazenamento a 4 0 C por um mês (Atree & Fowke, 1993).
A desidratação dos embriões somáticos é a maneira mais adequada de simular as condições
reais de um embrião contido dentro de uma semente verdadeira e vários estudos vem se
concentrando nesta área. Neste caso outros compostos que não hidrogel podem ser empregados
como matriz para o encapsulamento, tais como resinas plásticas de polietileno-óxido solúveis em
água (Janick et al., 1989). Embriões somáticos desidratados de Picea glauca foram encapsulados
em compostos solúveis de baixo ponto de fusão. Isto permitiu a desidratação controlada dos
embriões somáticos em condições que favoreçam sua alta viabilidade após o armazenamento das
sementes sintéticas em baixas temperaturas (Attree & Fowke, 1993).
Apesar dos avanços verificados com a tecnologia de sementes sintéticas nos últimos dez anos,
as técnicas de encapsulamento em alginato e em polietileno-óxido, consideradas como as mais
promissoras, não tem demonstrado aplicabilidade em condições de campo. As limitações principais
tem sido associadas à: a) baixa resistência à dessecação; b) baixa disponibilidade de nutrientes e de
oxigenio; e, c) não tolerância ao dano mecânico e às flutuações de temperatura no leito de
conversão (Gupta et al., 1993). Contudo, inovações e melhorias nos protocolos e o desenvolvimento
de equipamentos visando a automação do processo de seleção e encapsulamento, vem permitindo
aumentar as taxas de conversão de embriões somáticos em plantas.
Considerações finais e perspectivas futuras
Um dos problemas no estudo da morfogênese vegetal é conhecer os processos e fatores que
fazem com que um organismo multicelular complexo evolua a partir do zigôto. Um dos obstáculos
para isto é a localização dos embriões no interior do saco embrionário, acarretando dificuldade na
sua manipulação experimental (Goldberg et al., 1994). A embriogênese somática pode contornar
este obstáculo por apresentar a mesma ontogênese da embriogênese zigótica, fazendo com que
este sistema seja ideal para tais estudos.
Uma das principais aplicações da embriogênese somática em programas de melhoramento de
plantas perenes, relaciona-se com a possibilidade da fixação do ganho genético pela captura dos
componentes aditivos e não aditivos da variância genética. O primeiro é baseado no efeito
independente dos alelos, enquanto que o segundo, normalmente perdido nos processos de
reprodução sexuada, é baseado na interação dos alelos, dentro ou entre locus (Durzan, 1988). Este
processo pode iniciar com o cruzamento controlado entre plantas, que já de antemão sabe-se que
produzirão uma progênie superior. Massas celulares pró-embrionárias podem permitir o
estabelecimento e a multiplicação massal de linhagens celulares embriogenéticas, de acordo com as
sequências propostas anteriormente. Enquanto amostras destas linhagens são criopreservadas, uma
outra parte gerará plantas para o estabelecimento de testes clonais de campo. A performance destes
genótipos será avaliada até que se tenham elementos suficientes para a seleção final dos melhores
clones, após o que algumas linhagens criopreservadas serão eliminadas e outras iniciarão um
programa de propragação clonal massal (Gupta et al., 1993). Para evitar riscos de vulnerabilidade
genética inerentes ao processo de propagação clonal, propõe-se um grande número de cruzamentos
dirigidos entre diferentes progenitores de alta performance, de tal maneira que as populações clonais
resultantes do processo de embriogenêse somática sejam constituidas de mosaicos genéticos.
Em plantas com incompatibilidade de geração gametofítica, o resgate de embriões e o
estabelecimento de linhagens embriogenéticas pode se transformar em uma técnica muito útil e
poderosa para ampliar as possibilidades de sucesso em programas de melhoramento que objetivem
incorporar características de resistência de híbridos de cruzamentos interespecíficos.
A variabilidade clonal genética ou epigenética leva à uma perigosa situação na biotecnologia
vegetal, principalmente quando se trata de plantas perenes, uma vez que as expectativas quanto ao
impacto destas técnicas não são correspondentes à base científica até hoje existente. A instabilidade

genética em populações de células embriogenéticas é considerada indesejável, mas pode levar à
obtenção de variantes úteis se sua frequência for devidamente controlada. Isto significa dizer que
quando a regeneração ocorre a partir de calos ou de células protodérmicas cujas iniciais apresentam
genótipo variável, pode-se esperar algumas aberrações entre as populações de clones. Para fins de
seleção, quando se comparam o têrmos aberração e variação, o primeiro parece mais adequado
para designar os desvios de um genótipo a ser clonado. Em plantas perenes, as características ciclo
celular relativamente curto e ciclo de vida longo reforçam a hipótese que, para muitas aberrações
operam poderosos mecanismos de reparo e de inativação celular, os quais minimizam os efeitos
deletérios (Durzan, 1988).
Para que a embriogênese somática venha a ser o sistema de micropropagação do futuro é
necessário que ocorram melhorias nos protocolos regenerativos. O principal aspecto a ser
melhorado diz respeito ao estabelecimento preciso de um sistema de dois ciclos. No primeiro,
determinam-se as condições necessárias para o estabelecimento de ciclos repetitivos de divisão
celular, no qual seja possível obter-se grandes quantidades de pró-embriões em biorreatores ou
equipamentos similares. Neste ciclo pode-se estabelecer e manter uma base celular para a
progressão para o ciclo seguinte e para a introdução de genes de interesse. No segundo ciclo
determinam-se para cada modelo embriogenético as condições para o desenvolvimento e maturação
dos embriões somáticos, que podem ser convertidos à plantas ou então encapsulados para a
obtenção de sementes sintéticas. Com estes dois ciclos torna-se possível reduzir consideravelmente
o impacto das principais limitações da embriogênese somática, que são: a) a baixa intensidade de
indução a partir de um explante primário; b) a resposta genótipo-dependente; c) a falta de sincronia
das culturas em seus diferentes estágios, e; d) as dificuldades de automatização do processo.
A tecnologia de sementes sintéticas ainda deve ser aprimorada para que seja amplamente
empregada. Pesquisas devem ser conduzidas principalmente no sentido de: a) aumentar a
viabilidade e o período de conservação; b) reconstituição de endospermas sintéticos baseados nos
constituintes do endosperma que envolve o embrião zigótico, e; c) inclusão de microorganismos
benéficos no endosperma sintético.
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Figura 2. Processo de dois ciclos para a indução e modulação da embriogênese somática.
Adaptado de Durzan (1988).