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3.2.1.1 - Digestão
Foi preparado inicialmente 100 mL do tampão de extração [1 mL de cloreto de
sódio 5M, 10 mL de SDS 20% (dodecil sulfato de sódio), 86 mL de água Milli-Q
esterilizada, 1 mL de Tris, pH 8,0 8M e 2 mL de EDTA 0.5M] sendo que 500 µL deste
em tubo tipo eppendorf juntamente com 10 µL de Proteinase K a 10 mg/mL, 10 µL
de RNAse a 10 mg/mL, 20 µL de DTT (ditiotreitol) 1M e aproximadamente 500 mg
de tecido picado do espécimen em questão. O tubo eppendorf em seguida levado à
estufa a 37 ºC para digestão por 24 – 48 horas.
3.2.1.2 - Purificação do DNA – Extração fenol-clorofórmio
Após a digestão, foi adicionado 500 µL de fenol equilibrado com tampão TEN
2 (Tris-HCl 20 mM pH 8.0, EDTA 10mM e NaCl 0.1M) ao tubo com tecido digerido.
O tubo foi agitado por 5 min e imediatamente centrifugado, por 5 min, a 3000 g. A
camada sobrenadante resultante da centrifugação foi transferida para um tubo limpo
e repetido o mesmo processo.
A camada sobrenadante foi então transferida para um novo tubo onde foi
adicionado 500 µL de solução fenol/clorofórmio/álcool isoamílico na proporção de
25:24:1 e agitado por 5 min seguido de centrifugação a 3000 g no mesmo período de
tempo. Em seguida a camada sobrenadante foi transferida para um tubo limpo e
repetiu-se a mesma operação.
O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e em seguida foram
adicionados 500 µL de solução clorofórmio/álcool Isoamílico (24:1). O tubo foi
agitado por 5 min seguido de centrifugação a 3000 g, também por 5 min.
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