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3.2.4 - Reação de seqüenciamento
As etapas de número 3.2.4, 3.2.5 e 3.2.6 foram realizadas no laboratório de
Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Pará – Campus de
Bragança.
O DNA das amostras de B. flavicans foi seqüenciado com a utilização do Kit de
seqüenciamento ABI PRISM BigDye Terminator Cicle Sequencing. Em função de a
região controle ter 1070 pb, cada amostra de DNA foi seqüenciada em duas etapas,
uma com o primer L (leve) quando se obteve em torno de 600 pb iniciando-se na
extremidade 5’ do gene, e outra com o primer H (pesado), quando também se
obtiveram em torno de 600 pb, a partir da outra extremidade (L) do gene. Mediante a
complementação das duas fitas foi possível obter toda a seqüência da região controle
para todos os indivíduos.
A reação de seqüência foi realizada também através da técnica de PCR
(seqüenciamento cíclico) na qual o volume final de cada reação foi obtido com os
seguintes componentes:
• 8 µL de água milli-Q autoclavada (esse volume teve variação que dependeu
da concentração de cada amostra de DNA amplificado);
• 6 µL de tampão (200mM tris base pH 9.0, 5mM de cloreto de magnésio, água
Milli-Q autoclavada);
• 1 µL do primer L (leve) ou H (pesado) utilizado anteriormente na amplificação
do fragmento;
• 2 µL da solução de Seqüenciamento Big Dye terminator;
• 3 µL de DNA purificado (entre 30 –90 ng/µL).
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