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19.9 µL de água milli-Q;
3.0 µL de tampão 10X com cloreto de magnésio;
3.0 µL de dNTPs 1 mM;
1.5 µL do primer F-TTF a 10 µM;
1.5 µL do primer F-12R a 10 µM;
0.1 µL de DNA Taq polimerase à 5 U/µL
1.0 µL do DNA genômico do espécimen em questão a 10 – 100 ng/µL.
Os “primers” (iniciadores) (Sivasundar et al., 2000) utilizados na reação localizam-
se adjacentes à região controle da mitocôndria, e tem as seguintes seqüências:
- F-TTF: 5’- GCC TAA GAG CAT CGG TCT TGT AA – 3’; (que se anela à fita leve);
- F-12R: 5’- GTC AGG ACC ATG CCT TTG TG – 3’; (que se anela à fita pesada).
O volume total da reação foi de 30 µL e o tubo foi colocado em termociclador,
programado para realizar 30 ciclos com o seguinte perfil de temperatura: os
primeiros cinco ciclos foram constituídos de um minuto a 94 ºC para a desnaturação
das fitas complementares do DNA, um minuto a 53 ºC para anelamento
(pareamento) dos primers complementares à região estudada e um minuto e meio a
72 ºC para a extensão dos segmentos amplificados de DNA. Os demais vinte e cinco
ciclos com as mesmas condições de temperatura de desnaturação e extensão, porém
com 50 ºC de temperatura de anelamento dos primers. Desta forma, todo o processo
de amplificação totalizou cerca de duas horas.
Após a reação, a eficiência da amplificação foi verificada através da aplicação de
3 µL do produto amplificado de cada reação em gel de agarose 0.8 % e marcador
molecular de peso de bandas conhecidos (λ digerido com HAE III – peso das bandas
– 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234 e 194 pb) por cerca de 1 hora e 40 min com
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