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68 Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada Santos et al.<br />INTRODUÇÃO<br />Na germinação da semente de cevada<br />durante a etapa de maltagem ocorrem três fases<br />evidentes: embebição de água, alongamento da<br />célula e aumento do número de células. O<br />início da germinação da cevada ocorre somente<br />a partir de determinados teores de umidade<br />acima de 30% (Ma et al., 2002; Helland et al.,<br />2002).<br />As enzimas na cevada são produzidas<br />como resultado da ação de hormônios, que são<br />distribuídos com a penetração de água do<br />escutelo ao longo da camada de aleurona<br />(Maya-ampudia & Bernal-lugo, 2006). Dentre<br />as enzimas produzidas a alfa e beta amilase<br />caracterizam-se por serem as principais<br />enzimas produzidas durante a germinação<br />(Onyeka & Dibia, 2002; Muralikrishna &<br />Nirmala, 2005).<br />A alfa-amilase (1,4-α-Dglucanohidrolase,<br />EC 3.2.1.1, enzima<br />dextrinizante) pode atacar as cadeias dos<br />componentes do amido em qualquer ponto no<br />interior da cadeia linear. Isto eqüivale dizer que<br />a alfa-amilase é uma endoenzima que hidrolisa<br />ligações O-glicosídicas α(1-4), produzindo<br />oligossacarídeos que contêm ligações α(1-6),<br />além de glicose e maltose. As ligações α(1-6)<br />não são quebradas pela alfa-amilase (Georgkraemer<br />et al., 2000; Macgregor et al, 2001;<br />Juge et al., 2006; Xiao et al., 2006; Eneje et al.,<br />2004; Adewale et al., 2006).<br />Segundo Kunze (1996), a alfa-amilase<br />não está acentuadamente presente na cevada; a<br />maior parte da alfa-amilase é produzida no<br />segundo e quarto dias de germinação e a<br />quantidade desta enzima pode ser aumentada<br />durante o prolongamento da germinação.<br />Segundo Georg-kraemer et al. (2000) é crucial<br />saber os momentos de ascensão das amilases<br />durante a germinação.<br />A beta amilase, α-1,4- α glucan<br />maltohidrolase (EC 3.2.1.2) é uma exoenzima e<br />hidrolisa ligações α(1-4), a partir da<br />extremidade não-redutora, produzindo maltose<br />(Clark et al., 2003; Mohan et al., 2005; Brien &<br />Fowkes, 2005; Sahlström et al., 2003).<br />Antes da germinação, a beta-amilase já<br />está presente em quantidades maiores na<br />cevada, quando comparada à alfa-amilase.<br />Depois de uma diminuição inicial, a quantidade<br />de beta-amilase tem aumentos consideráveis no<br />segundo e terceiro dias de germinação (Molinacano<br />et al., 2000, 2001; Kunze, 1996).<br />A quantidade de alfa e beta-amilase<br />depende de vários fatores: variedade da cevada,<br />condições climáticas, tamanho do núcleo<br />embrionário, conteúdo de água mais elevado na<br />produção de malte verde, temperatura de<br />germinação e maceração; quanto mais elevada<br />à temperatura, mais rápido é o processo (Saika<br />et al., 2005). Em função da importância desses<br />fatores se faz necessário o estudo das condições<br />com determinação de variáveis específicas de<br />forma a otimizar as atividades enzimáticas.<br />O objetivo do presente trabalho foi<br />examinar as mudanças na expressão da alfa e<br />beta amilase no endosperma da cevada da<br />variedade BR2 em termos de atividade<br />específica durante a germinação no processo de<br />maltagem, de forma a verificar as maiores<br />produções em relação ao tempo de germinação.<br />Baseado no ponto de vista que são enzimas de<br />fundamental importância para fabricação da<br />cerveja na etapa de mosturação, pois são<br />responsáveis pela hidrólise dos polissacarídeos<br />em açúcares mais simples.<br />MATERIAIS E MÉTODOS<br />O presente trabalho foi conduzido nos<br />Laboratórios de Armazenamento e<br />Processamento de Produtos Agrícolas<br />(Departamento de Engenharia Agrícola), de<br />Tecnologia e Produção de Sementes<br />(Departamento de Fitotecnia) e de Enzimologia<br />(Núcleo de Biotecnologia Aplicada a<br />Agropecuária), todos da Universidade Federal<br />de Viçosa, Viçosa-MG.<br />Foram utilizadas sementes de cevada<br />(Hordeum vulgare L.) da variedade BR-2,<br />processadas, fornecidas pela Companhia<br />Brahma (Filial Malteria Navegantes, Porto<br />Alegre-RS).<br />As principais etapas do processo de<br />malteação utilizadas no experimento foram:<br />classificação, maceração, germinação, secagem<br />e desbrotamento (Figura 1).<br />Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010
Expressão da alfa e beta amilase durante a germinação de cevada Santos et al. 69<br />CLASSIFICAÇÃO<br />MACERAÇÃO<br />GERMINAÇÃO<br />SECAGEM<br />DESBROTAMENTO<br />Figura 1 - Fases do processo de malteação da<br />cevada.<br />Na etapa de maceração foram utilizadas<br />amostras de 300 g de cevada, acondicionadas<br />em bandejas de alumínio inoxidável, em um<br />ambiente com temperatura controlada a 20 o C.<br />Utilizou-se um processo cíclico,<br />denominado “2/4/1/4/1” intercalado, recomendado<br />pela Empresa Brahma. Este processo<br />consiste de três etapas, que envolvem<br />umedecimento com água potável, seguido de<br />repouso ao ar ambiente. Na primeira etapa, o<br />período de reumedecimento foi de 2 horas e o<br />de repouso, 4 horas. Na segunda, os períodos<br />de reumedecimento e de repouso foram,<br />respectivamente, de 1 e 4 horas. Finalizando,<br />na terceira etapa, os grãos foram umedecidos<br />durante 1 hora. As pesagens das amostras<br />foram realizadas no início do teste e após 2, 6 e<br />12 horas. Os grãos, durante o processo, foram<br />revolvidos manualmente, para retirada de CO 2 .<br />Em todos os testes, as bandejas<br />provenientes da etapa de maceração, contendo<br />camadas finas de 4 cm de grãos, para facilitar o<br />controle de CO 2, foram colocadas em<br />germinadores a 16 o C, onde permaneceram<br />durante 84 horas. O teor de água do produto,<br />controlada por pesagens periódicas em balança<br />eletrônica, foi mantida em torno de 42 – 45%<br />b.u., com reposição de água nos intervalos de<br />tempo de 16 e 32 horas. A quantidade de água<br />usada na reposição foi determinada pela<br />equação:<br />⎛ ⎞<br />⎜<br />100 −U<br />i<br />Mt<br />⎟<br />f<br />= Mti<br />(1)<br />⎝100<br />−U<br />f ⎠<br />Mt f = massa total final; Mt i = massa total<br />inicial; U i = umidade inicial; U f = umidade<br />final.<br />Durante o período de germinação<br />(84 horas), foram retiradas amostras em<br />intervalos regulares de 8 horas. Estas amostras<br />foram submetidas a testes enzimáticos, para o<br />acompanhamento do desenvolvimento da<br />atividade da beta-amilase.<br />Cinco gramas de malte, finamente<br />triturados, foram dissolvidos em 100 ml de<br />cloreto de sódio 0,5%, permanecendo por 1<br />hora a 30 o C, em constante agitação. Em<br />seguida, foram centrifugados (9.000 rotações<br />por 5 minutos) e filtrados em papel-filtro. Dez<br />mililitros do filtrado, diluídos em 100 ml de<br />cloreto de sódio 0,5%, foram deixados à<br />temperatura ambiente, antes da determinação<br />da atividade.<br />Foram pipetados 0,04 – 1,0 ml da<br />solução de maltose com 5 micromoles/ml,<br />fazendo-se a diluição para 2 ml, em cada tubo,<br />com água deionizada. Após adicionar 1 ml de<br />ácido dinitrossalicílico reativo de cor à solução,<br />esta foi incubada em banho de água fervente,<br />durante 5 minutos. Após o resfriamento à<br />temperatura ambiente, a solução foi diluída<br />com 10 ml, de água deionizada, em cada tubo,<br />e fez-se a leitura a 540 nm, com o aparelho<br />calibrado com o branco. Foi determinada a<br />maltose liberada na curva-padrão.<br />A atividade da alfa-amilase foi<br />determinada pelo método de Bernfeld (1955),<br />utilizando amido como substrato. Para isto, foi<br />pipetado 0,5 ml da solução de extrato de cevada<br />ou malte ou água, no caso do controle,<br />adicionado a 0,5 ml da solução de amido 1%<br />(p/v), em tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH<br />6,9, com 0,006 M de cloreto de sódio. Após a<br />incubação dessa solução durante 3 minutos, a<br />25 o C, adicionou-se 1 ml de ácido<br />dinitrossalicílico 1% (p/v), reativo de cor, e,<br />novamente, ela foi incubada durante 5 minutos,<br />em banho-maria. Após este procedimento,<br />levou-se a solução a 25 o C e, em seguida, foram<br />adicionados 10 ml de água deionizada,<br />determinando-se a absorvância da mistura de<br />reação a 540 nm. A quantidade de micromoles<br />de maltose liberada foi obtida por meio da<br />curva-padrão. A partir desses valores, foram<br />calculadas as atividades, utilizando a seguinte<br />equação:<br />Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.67-73, 2010
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