apostila de exercícios

QBQ-0116BIOQUÍMICA: ESTRUTURA DE BIOMOLÉCULASe METABOLISMO2012

pH e SISTEMAS TAMPÃO01. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 1, Problema 1-19. O Ka do ácido fraco HA é1,6 x 10 -6 . Calcular:a) O grau de ionização do ácido para uma solução 10 -3 M.b) O pH02. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 1, Problema 1-26.a) Indicar os componentes de um tampão acetatob) Mostrar através de reações como o tampão acetato resiste a mudanças de pHquando se adiciona íons OH - ou H + .03. Quais os fatores que determinam a eficiência ou capacidade tamponante de uma solução?04. Dispõe-se de solução de ácido acético e acetato de sódio ambas 0,1 M. Com estas duassoluções, preparar os seguintes tampões acetato 0,1 M (pKa do ácido acético = 4,7):a) pH = 3,7b) pH = 5,708. Lehninger, Biochemistry, segunda edição, Capítulo 2, Problema 8.a) Calcular a relação [HCO 3- ]/[H2 CO 3 ] no plasma sanguíneo em pH 7,4 (pKa =3,77),b) Calcular a relação [HPO 42- ]/[H2 PO 4- ] no plasma sanguíneo (pKa = 7,20),c) Qual dos dois pares ácido-base conjugados é o tampão mais eficiente em umaamostra de plasma sanguíneo em um frasco fechado, sem espaço disponível paragases (totalmente ocupado por líquido)?09. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 1, Problema 1-52. O plasma sanguíneocontém uma reserva ("pool") total de carbonato (essencialmente HCO 3- + CO 2 ) de 2,52 x10 -2 M.a) Qual é a razão [HCO 3- ]/[CO2 ] e a concentração de cada componente do tampãopresente a pH 7,4?b) Qual seria o pH se for adicionado 10 -2 M de H + sob condições tais que o aumentoda [CO 2 ] não possa ser liberado?c) Qual seria o pH se for adicionado 10 -2 M de H + e o excesso de CO 2 eliminado(mantendo-se assim a [CO 2 ] original)?Considerar o pKa para o equilíbrio abaixo:CO 2 + H 2 O → HCO 3- + H + , como sendo 6,1.←

→AMINOÁCIDOS01. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 1, Problema 1-45. Escreva as estruturas dasvárias formas de alanina, ácido aspártico e lisina que podem ser obtidas. Mostre comocada forma ioniza em água.02. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 1, Problema 1-46 Desenhe a curva de titulaçãode cloridrato de alanina com KOH. Indique o pI. São dados:pKa 1 = 2,4 e pKa 2 = 9,603. Conhecidos os valores dos pKas, discuta as curvas de titulação do ácido aspártico elisina. Indique os respectivos pIs.04. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 2, Problema 2-2. Quais são as mobilidadeseletroforéticas relativas de glicina, leucina, ácido aspártico, ácido glutâmico e lisina a pH4,7?Dados:Aminoácido P.M. pILisina 146,2 9,74Glicina 75,1 5,97Leucina 131,2 5,98Ácido Glutâmico 147,1 3,22Ácido Aspártico 133,1 2,98Considere: mobilidade eletroforética = k .pH - pIP.M.05. Lehninger, Principles of Biochemistry, Capítulo 5, Problema 3. Relação entre estrutura epropriedades químicas dos aminoácidos.Uma vez que os aminoácidos servem como unidades fundamentais formadoras dasproteínas, o conhecimento de suas estruturas e propriedades químicas é crucial para acompreensão de como as proteínas executam suas funções biológicas.a) Escreva as estruturas das cadeias laterais (grupos R) dos seguintes aminoácidos: (1) Ala,(2) Arg, (3) Asn, (4) Asp, (5) Cys, (6) Glu, (7) Gly, (8) His, (9) Lys, (10) Met, (11) Phe,(12) Pro, (13) Ser, (14) Trp, (15) Tyr e (16) Val.b) Associe compatibilizando cada estrutura com a descrição de suas propriedades fornecidasabaixo (algumas descrições podem ser usadas mais de uma vez).(Associe o número do aminoácido com a letra correspondente à descrição).a) Grupo R pequeno e polar contendo um grupo hidroxila. Este aminoácido é importante nosítio ativo de algumas enzimas.b) Provoca o menor impedimento estérico.c) O grupo R tem pKa próximo de 10,5, o que torna-o carregado positivamente no pHcelular.d) O grupo R contém enxofre e é neutro em todos os pHs.e) O grupo R é aromático, de natureza hidrofóbica e neutro em todos os pHs.f) Hidrocarboneto saturado, importante em interações hidrofóbicas.g) O único aminoácido que possui um grupo R ionizável com pKa próximo de 7. É um grupoimportante no sítio ativo de algumas enzimas.

h) O único aminoácido que possui um alfa-amino grupo substituído. Influencia o dobramentoda proteína forçando uma curvatura na cadeia.i) O grupo R tem pKa próximo de 4 e assim está carregado negativamente em pH 7.j) Tem grupo R aromático, capaz de formar pontes de hidrogênio; tem pKa perto de 10.k) Forma ligações cruzadas de dissulfeto (pontes de dissulfeto) entre cadeias polipeptídicas,o pKa do seu grupo funcional é cerca de 8.l) O grupo R tem pKa próximo de 12, fazendo-o positivamente carregado em todos os pHsfisiológicos. Sua carga positiva é importante em algumas proteínas para a ligação comgrupos fosfatos negativamente carregados.m) Quando seu grupo R polar não carregado é hidrolisado, este aminoácido converte-se emoutro que possui uma carga negativa em seu grupo R quando em pH ao redor de 7.06.Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Capítulo 2, Problema 2-2. Analisandoas estruturas dos aminoácidos, indique qual deles se adapta às seguintes descrições:a) ______________________ altera o dobramento da cadeia polipeptídica porque não é umverdadeiro aminoácido. Nas cadeias polipeptídicas da mioglobina e hemoglobina nemtodo dobramento tem ________________, mas todo(a) _________ produz umdobramento. (Todos os três espaços vazios correspondem ao mesmo resíduo deaminoácido, o qual é único na maneira pela qual ele forma ligações peptídicas).b) ________________ tem uma cadeia lateral não polar e interage com outros anéisaromáticos. (Os anéis aromáticos têm a tendência a se empilhar (estaquear) com outrosanéis aromáticos).c) ______________ é pequeno(a), e não contém enxofre. Ele (ela) pode formar pontes dehidrogênio internas numa proteína enovelada.d) O par de elétrons solitário em um dos nitrogênios do anel no(a) ______________, o(a)torna, como metionina um ligante potencial, importante na união dos íons de ferro nahemoglobina.e) ______________________ desempenha um papel crucial na estabilização da estrutura demuitas proteínas em virtude da habilidade de dois de tais resíduos formar uma ligaçãocovalente entre suas cadeias laterais, quando estes resíduos estão presentes na mesma ouem diferentes cadeias polipeptídicas.f) Os carbonos em um aminoácido são designados por letras do alfabeto grego começandocom o carbono alfa e extendendo pela cadeia lateral: beta, gama, delta, ... Se dois ou trêsgrupos (não átomos de hidrogênio) são ligados ao carbono beta, a molécula é ditaramificada no carbono beta. Dois resíduos adjacentes que têm ramificações no carbono βtornam a estrutura do polipeptídeo conhecido como alfa hélice instável. Por este critério__________, ________ e ________ devem interromper a α-hélice quando adjacentes.g) Nas proteínas, sob condições fisiológicas normais (próximo ao pH = 7), as cadeias lateraisde ________ e __________ são quase totalmente positivamente carregadas, mas ascadeias laterais de __________ estão somente em parte positivamente carregadas.PEPTÍDEOS1. Baseado em Marzzoco e Torres, Bioquímica Básica, Página 220, Problema 3.Para o tripeptídeo H 3 N + -Ala-Lys-Ser-COO -a) Classifique os grupos R segundo suas polaridades.b) Diga para que tipo de ligação esses grupos poderiam contribuir na estrutura terciária deuma proteína.c) Calcule o pI sabendo que:

Ala Lys Ser GlupK a1 2,34 2,18 2,21 2,19pK a2 9,69 8,95 9,15 9,67pK a3 (grupo R) 10,53 4,25d) Para que polo migraria o tripeptídeo numa eletroforese feita a pH = 7?e) Discuta a capacidade do peptídeo de atuar como tampão.f) Refaça os ítens anteriores para um tripeptídeo contendo ácido glutâmico no lugar delisina.02. Stryer, Biochemistry, 3 a edição, Capítulo 3, Problema 1. Os seguintes reagentes sãocomumente usados na Química de Proteínas:CNBr (brometo de cianogênio) Cloreto de DabsilaUréiaHCl 6Nβ-MercaptoetanolNinhidrinaTripsinaFenil isotiocianatoÁcido PerfórmicoQuimiotripsinaQual(is) dele(s) é(são) o(s) mais adequado(s) para executar cada uma das seguintes tarefas?a) Determinação da sequência de aminoácidos de um peptídeo pequeno.b) Identificação de um resíduo amino-terminal de um peptídeo (do qual dispõe-se somentede menos de 10 -7 g).c) Desnaturação reversível de uma proteína isenta de pontes de dissulfeto. Que outroreagente seria necessário se elas estivessem presentes?d) Hidrólise de ligações peptídicas no lado carboxílico de resíduos com R aromático.e) Clivagem de ligações peptídicas no lado carboxílico de metioninas.f) Hidrólise de ligações peptídicas no lado carboxílico de resíduos de lisina e arginina.03. Rawn, Biochemistry, Capítulo 3, Problema 4. Um peptídeo tem a composição: Ala, Arg,Asp 2 , Glu 2 , Gly 3 , Leu, Val 3 .Os seguintes peptídeos foram isolados após hidrólise ácida parcial e suas sequênciasdeterminadas:(1) Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala(2) Val-Asp-Val-Asp-Glu(3) Val-Asp-Val(4) Glu-Ala-Leu-Gly-Arg(5) Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg(6) Leu-Gly-ArgCom estes dados, indique a sequência de aminoácidos no peptídeo original.04. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 2, Problema 2-3. A hidrólise parcial de umaproteína forneceu vários polipeptídeos. Um deles foi purificado. Deduza a sequência deaminoácidos neste polipeptídeo a partir das seguintes informações:a) A hidrólise ácida completa forneceu Ala + Arg + 2 Ser + Lys + Phe + Met + Trp + Pro.b) O tratamento com fluorodinitrobenzeno (FDNB, o reagente de Sanger) seguido dahidrólise ácida completa forneceu como únicos dinitrofenil derivados (DNP derivados), aalfa- dinitrofenilalanina (alfa-DNP-Ala) e a epsilon-dinitrofenilisina (epsilon-DNP-Lys).c) Carboxipeptidase A ou carboxipeptidase B não liberaram qualquer aminoácido Cterminal.d) O tratamento com brometo de cianogênio (CNBr) forneceu dois peptídeos. Um continhaSer + Trp + Pro. O outro continha todos os aminoácidos restantes (inclusive a segundaserina).e) O tratamento com quimiotripsina forneceu três peptídeos. Um continha somente Ser +Pro. Outro, somente Met + Trp. O terceiro Phe + Lys + Ser + Arg + Ala.

f) O tratamento com tripsina forneceu três peptídeos. Um continha somente Ala + Arg. Outrocontinha somente Lys + Ser. O terceiro continha Phe + Trp + Met + Ser + Pro.Informações: (1) FDNB reage com amino-grupos livres fornecendo DNP-aminoácidos apóshidrólise; (2) Carboxipeptidase A libera todos os aminoácidos C terminais, exceto Arg, Lys ePro e Carboxipeptidase B libera somente C terminal correspondente a Arg ou Lys; (3) CNBrcliva especificamente no lado carboxílico de resíduos de Met; e (4) Quimiotripsina e tripsinaclivam especificamente no lado carboxílico, respectivamente, de resíduos com R aromático(Phe, Tyr e Trp) e de resíduos com R de Lys e Arg.PROTEÍNAS01. Indique as propriedades das proteínas nas quais se baseiam as seguintes técnicasutilizadas na sua purificação:(a) Eletroforese, (b) Salting out, (c) Precipitação no pI, (d) Ultra centrifugação e (e) Diálise02. Lehninger, Biochemistry, 2 a. ed., Capítulo 7, Problema 6. Para que direção, isto é para oanodo (A), para o catodo (C) ou permenência na origem (O), migrarão num campoelétrico as seguintes proteínas, nos pHs indicados?a) Albumina do ovo (pI = 4,6) em pH 5,0b) β-Lactoglobulina (pI = 5,2) nos pHs 5,0 e 7,0c) Quimiotripsinogênio (pI = 9,5) nos pHs 5,0, 9,5 e 11,003. Lehninger, Biochemistry, 2 a. ed., Capítulo 7, Problema 7. Em que pH será a eletroforesemais eficiente na separação das seguintes misturas de proteínas?a) Albumina sérica e hemoglobina; pIs = 4,9 e 6,8, respectivamenteb) Mioglobina e quimiotripsinogênio; pIs = 7,0 e 9,5, respectivamentec) Albumina do ovo, albumina sérica e urease, pIs = 4,6, 4,9 e 5,0, respectivamente04. Marzzoco e Torres, Bioquímica Básica, Página 220, Problema 7. Abaixo estárepresentada a mobilidade eletroforética em pH 8,6 da hemoglobina normal e de umasérie de hemoglobinas anormais (que possuem um aminoácido substituído):(-) ______________________________________________________ (+)A B Normal C DIndique a que posição A, B, C ou D corresponde cada hemoglobina anormal:HbS - Val em lugar de Glu, HbJ - Asp em lugar de Gly, HbN - Glu em lugar de Lys eHbC - Lys em lugar de ácido Glu.05. Segel, Biochemical Calculations, 2 a. ed., Capítulo 2, Problema 2-7. O peso molecularmédio de um resíduo de aminoácido é 120. A densidade média de uma proteína é 1,33g/cm 3 . Calcule:a) A massa de uma única molécula de uma proteína que contém 270 aminoácidos, (b) Ovolume ocupado por uma única molécula desta proteína, e (c) Poderá uma molécula destaproteína adaptar-se no interior de uma membrana celular medindo 100 Å de espessura?Considere que esta molécula é esférica.06. Wood et al, Biochemistry: A Problems Approach, Capítulo 4, Problema 4-1. Indique seas seguintes afirmações são falsas ou verdadeiras. Justifique as que forem falsas:a) Pontes de hidrogênio ocorrem entre átomos de Hidrogênio na superfície das moléculas deproteína em solução.

) A conformação termodinamicamente mais estável de uma proteína corresponde a estruturade energia livre mais baixa.c) A formação de pontes de hidrogênio internas corresponde a principal interação quedireciona o dobramento da molécula de proteína.d) Solventes orgânicos desnaturam proteínas, principalmente por dificultar interaçõesiônicas.e) O dobramento de uma molécula de proteína hidrofóbica é acompanhado por um aumentona entropia do polipeptídeo.f) O termo estrutura quaternária refere-se a conformação da proteína em quarta dimensão,isto é, como uma função do tempo.g) Pontes dissulfeto ligam covalentemente resíduos de cisteína cujas proximidades sãodeterminadas por interações prévias não covalentes.h) Numa alfa-hélice, os Hidrogênios amídicos de todas as ligações peptídicas estão formandopontes de Hidrogênio.i) A partir da estrutura primária completa de uma proteína, é possível predizer suaconformação tridimensional.07. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Capítulo 4, Problema 4-2a) As conformações das proteínas correspondentes ao mínimo de energia livre muitas vezessão favorecidas por ligações cruzadas covalentes entre resíduos de ____________.b) As interações hidrofóbicas levam a um(a) ____________ de energia livre quando ascadeias laterais dos resíduos de aminoácidos não polares são removidos da fase aquosa.c) O posicionamento de cadeias laterais hidrofóbicas no interior de uma proteína________________ a entropia do ambiente aquoso.d) Solventes orgânicos estabilizam (diminuem a energia livre) de grupos _______________em meio aquoso.e) Na α-hélice, as pontes de hidrogênio entre os grupos C=O e N-H são bastante estáveisporque os três átomos envolvidos são __________________.08. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Capítulo 4, Problema 4-16. Suponhaque foram fornecidas a você pequenas quantidades de três proteínas desconhecidas: A, Be C. Seu instrutor de bioquímica lhe informou que uma delas forma predominantementeα-hélice, outra, folha pregueada β e a terceira, hélice tripla de colágeno. O laboratórioonde você está trabalhando está equipado com um analisador de aminoácido, masinfelizmente não dispõe de um equipamento para R-X cristalográfico. Você determinou acomposição de aminoácidos (em porcentagem molar) para cada proteína, como mostradona tabela a seguir:A B C A B CAla 29,4 5,0 10,7 Leu 0,5 6,9 2,4Arg 0,5 7,2 5,0 Lys 0,3 2,3 3,4Asp 1,3 6,0 4,5 Met - 0,5 0,8Cys - 11,2 - Phe 0,5 2,5 1,2Glu 1,0 12,1 7,1 Pro 0,3 7,5 12,2Gly 44,6 8,1 33,0 Ser 12,2 10,2 4,3His 0,2 0,7 0,4 Trp 0,2 1,2 -Hypro - - 9,4 Tyr 5,2 4,2 0,4Ile 0,7 2,8 0,9 Val 2,2 5,1 2,3Baseado nos dados da tabela, você pode prever a estrutura secundária predominantepara cada uma?

09. Lehninger, Principles of Biochemistry, Capítulo 8, Problema 9. Comparação entre ashemoglobinas da mãe e do feto. Estudo do transporte de oxigênio em mulheres grávidasmostraram que as curvas de saturação pelo oxigênio do sangue materno e fetal sãomarcadamente diferentes quando medidas nas mesmas condições. Esta observaçãoprovém do fato de os eritrócitos fetais possuirem uma variante natural da hemoglobina A(hemoglobina F, alfa 2 gama 2 ), enquanto que os eritrócitos maternos contém ahemoglobina A (alfa 2 beta 2 ), normal em adultos.a) Qual das hemoglobinas apresenta maior afinidade pelo oxigênio nas condiçõesfisiológicas? Explique.b) Qual é o significado fisiológico das diferenças de afinidade? Explique.Removendo-se cuidadosamente todo DPG de amostras de hemoglobina A e F,verifica-se que as curvas de saturação pelo oxigênio (e consequentemente as afinidades) sãodeslocadas, no gráfico, para o lado esquerdo. Nesta situação, hemoglobina A passa a termaior afinidade pelo oxigênio. Recolocando-se DPG, as curvas de saturação voltam aonormal, como mostrado no gráfico acima. Pergunta-se:c) Qual é o efeito de DPG na afinidade da hemoglobina pelo oxigênio?d) Como as informações acima (relativas ao item c) podem explicar a razão das diferentesafinidades apresentadas pela hemoglobina fetal e materna?10. Seguindo as instruções abaixo, faça com papel um modelo aproximado da alfa-hélice:a) Trace em papel milimetrado duas linhas paralelas separadas 1,8 cm uma da outra.b) Na linha de baixo, a partir de origem marque pontos distantes 3 cm um do outro.c) Na linha superior marque a origem 0,5 cm à frente da origem correspondente na linhainferior. A partir da origem, marque pontos na linha superior distantes 3 cm um do outro.d) Una os pontos correspondentes nas linhas superior e inferior, de tal modo a obter umasérie de paralelogramos.e) Em cada paralelogramo trace três segmentos auxiliares:(1) No lado menor da esquerda marque um ponto 0,3 cm abaixo do vértice esquerdosuperior. No lado menor à direita marque um ponto 0,3 cm acima do vértice inferior. Unaestes pontos.(2) e (3) Trace segmentos paralelos aos lados menores que distem entre si 1 cm.Desta forma o paralelogramo é dividido por estes segmentos em três terços iguais.f) Escreva a letra C (Carbono) no encontro dos segmentos (1) e (2) e o N (Nitrogênio) noencontro de (1) e (3).g) No centro dos lados menores escreva Cα.h) Una C α - C - N - C α - C - N - ....i) Faça C = O para cima ao longo do segmento (2) e N - H para baixo ao longo de (3).

j) Dobre a tira de papel nas posições correspondentes aos lados menores e fixe as pontes dehidrogênio N - H ... O = C com pequeno pedaço de fita adesiva, de tal forma a obter noconjunto uma hélice.11. Seguindo as instruções abaixo, faça com papel um modelo aproximado de um folhapregueada beta com cadeias polipeptídicas antiparalelas:a) Numa folha de papel sulfite com seus lados maiores em posição horizontal trace as linhasauxiliares da maneira indicada abaixo.b) Trace levemente linhas verticais distantes entre si 6 cm. A primeira linha à esquerda podedistar 1 cm do lado menor.c) Trace levemente pares de paralelas horizontais distantes 1,2 cm entre si. No primeiro par,a linha superior deve distar 1 cm do lado maior superior da folha de papel. A paralelainferior dista 1,2 cm da linha superior.d) Abaixo 4,2 cm da linha inferior do primeiro par de paralelas trace a linha superior dosegundo par. Trace em seguida a linha inferior do segundo par.e) Da mesma forma trace o terceiro e quarto pares de paralelas.f) Com as verticais e os pares de paralelas você obteve uma série de retângulos medindo 1,2cm (lado menor) por 6 cm (lado maior).g) Na primeira série de retângulos (a série superior) escreva Cα no vértice superior esquerdodo primeiro retângulo da esquerda. No vértice inferior direito escreva também Cα. Assim,de forma diagonalmente oposta, vá escrevendo Cα na primeira série de retângulos.h) Na segunda série de retângulos (uma abaixo da série superior) escreva Cα no vérticeinferior esquerdo do primeiro retângulo da esquerda. No vértice superior direito escrevatambém Cα. Assim, de forma diagonalmente oposta, vá escrevendo Cα na segunda sériede retângulos.i) Proceda com em (g) para escrever Cα na terceira série de retângulos.j) Proceda como em (h) para escrever Cα na quarta série de retângulos.k) Entre duas verticais (separadas de 6 cm) trace levemente duas outras verticais separadasde 2 cm.l) Agora, na primeira série de retângulos escreva C de forma diagonalmente aposta a Cα.Diagonalmente oposto a C escreva N. Vá escrevendo C e N diagonalmente opostos.m) Também, na segunda série de retângulos escreva N de forma diagonalmente oposta a Cα.Diagonalmente oposto a N escreva C. Vá escrevendo N e C diagonalmente opostos.n) Na terceira série de retângulos escreva C e N como em (l).o) Na quarta série de retângulos escreva N e C como em (m).p) Nos C (não em Cα) faça C = O (as ligações devem estar centradas em C e a 120 o ).q) Nos N faça N - H (as ligações devem estar centradas em N e a 120 o ).r) Estabeleça as pontes de hidrogênio entre as cadeias com os C = O e H - N próximos(C = O --- H - N).s) Dobre a folha de papel em zig-zag, vincando-a nas verticais que passam por Cα.

ENZIMAS01. Segel, Biochemical Calculations, Capítulo 4, Problema 4-18. Um extrato bruto livre decélulas contém 20 mg/ml de proteína. Uma alíquota de 10 µl (microlitros) deste extratoem um volume total de reação standard de 0,5 ml catalisou a formação de 30 nmoles(nanomoles) do produto em 1 min sob condições ótimas de ensaio (força iônica e pHótimos, concentrações saturantes de todos substratos, coenzimas, ativadores, etc.)a) Expresse v em termos de nmoles x ml -1 x min -1 , nmoles x litro -1 x min -1 , µmolesx litro -1 x min -1 , M x min -1b) Qual seria o valor de v se os mesmos 10 µl do extrato fossem ensaiados em um volumetotal de 1,0 ml?c) Em termos de unidades/ml, qual é a concentração da enzima na mistura de ensaio e noextrato?d) Qual é a atividade específica da preparação?02. Rawn, Biochemistry, Capítulo 7, Problema 1. A acetilcolinesterase (uma esterase)catalisa a hidrólise da acetilcolina:acetilcolina + H O2 →colina + acido aceticoa) Escreva a reação catalisada usando fórmulas estruturais e indique na estrutura daacetilcolina a ligação que é clivada. A enzima é inativada por DFP (diisopropilfluorofosfato).b) Qual é o resíduo de aminoácido que provavelmente está no sítio ativo da esterase?c) Como poderia ser identificado o resíduo modificado?d) Qual é o provável papel deste resíduo no mecanismo da catálise?03. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Capítulo 7, Problema 7-7 (Resolvernumericamente; não graficamente). Os dados da tabela abaixo foram obtidos para umareação enzimática (volume final 10 ml), usando-se o seguinte procedimento:A fim de se estudar a dependência da velocidade de uma reação enzimática pelaconcentração de substrato, uma quantidade constante de enzima foi adicionada a umasérie de tubos contendo diferentes concentrações de substrato. As velocidades iniciais dareação foram determinadas medindo-se o número de moles (ou µmoles) de substratoconsumido (ou produto formado) por minuto. A tabela a seguir mostra as velocidadesiniciais fornecidas pelas respectivas concentrações de substrato:Pergunta-se:[S] (moles/litro)v (µmoles/min)5,0 x 10 -2 0,255,0 x 10 -3 0,255,0 x 10 -4 0,255,0 x 10 -5 0,205,0 x 10- 6 0,0715,0 x 10- 7 0,0096(a) Qual é a V max para esta concentração de enzima?(b) Qual é o K M desta enzima?(c) Verifique se esta reação segue uma cinética simples de Michaelis-Menten.(d) Quais serão as velocidades iniciais para:[S] = 1,0 x 10 -6 M e [S] = 1,0 x 10 -1 M?

(e) Calcule a quantidade total de produto formado durante os primeiros cinco minutosquando a [S] = 2,0 x 10 -3 M. É possível fazer o mesmo cálculo para uma[S]=2,0x10 -6 M?(f) Suponha que a concentração de enzima em cada tubo foi aumentada por um fator de 4.Quais são os valores de K M e V max ? Neste caso, qual é o valor de v para[S] = 5,0x10 -6 M?04. Stryer, Biochemistry, 2 a. ed., Capítulo 6, Problema 2. A penicilinase, uma enzimapresente em algumas bactérias resistentes, hidrolisa penicilina tornando-a inativa. O P.M.desta enzima em Staphylococcus aureus é 29.600. Mediu-se em função da concentraçãode penicilina, a quantidade deste antibiótico que foi hidrolisada em 1 min em 10 ml deuma solução que continha 10 -9 g de penicilinase purificada. Considere que aconcentração de penicilina não se altera apreciavelmente durante o ensaio:Penicilina(moles/litro)Quantidade hidrolisada(moles)0,1 x 10 -5 0,11 x 10 -90,3 x 10 -5 0,25 x 10 -90,5 x 10 -5 0,34 x 10 -91,0 x 10 -5 0,45 x 10 -93,0 x 10 -5 0,58 x 10 -95,0 x 10 -5 0,61 x 10 -9(a) Projete 1/v versus 1/[S] para estes dados. Há indicação de que a penicilinase segue umacinética de Michaelis-Menten? Em caso afirmativo, qual é o valor de K M ?(b) Qual é o valor de V max ?(c) Qual é o valor do número de transformação (turnover) da penicilinase nestas condiçõesexperimentais? (Considere um centro ativo por molécula de enzima)05. Faça o gráfico da velocidade de uma reação enzimática em função do pH, admitindo-seque a enzima seja estável de pH 3 a 12, o substrato não contém grupos ionizáveis e acatálise depende da presença no centro ativo de: (a) uma carboxila (pKa = 5)desprotonada, (b) um grupo amina (pKa = 9) protonado, e (c) uma carboxila (pKa = 5)desprotonada e um grupo amina (pKa = 9) protonado.06. Stryer, Biochemistry, 2 a. ed., Capítulo 6, Problema 3. Foram efetuadas medidascinéticas para uma enzima na ausência e na presença de inibidor ([I] = 2 x 10 -3 M, fixa).As velocidades iniciais correspondentes às várias concentrações de substrato estãoindicadas na tabela abaixo:Pergunta-se:[S] MVelocidade (µmol/min)sem inibidor com inibidor0,3 x 10 -5 10,4 4,10,5 x 10 -5 14,5 6,41,0 x 10 -5 22,5 11,33,0 x 10 -5 33,8 22,69,0 x 10 -5 40,5 33,8(a) Quais são os valores de V max e K M na ausência de inibidor? E na sua presença? (b)Qual é o tipo de inibição? (c) Qual é a constante de dissociação do complexo enzimainibidor?Compare com o valor de K M .

07. Stryer, Biochemistry, 2 a ed., Capítulo 6, Problema 4. Foram efetuadas medidas cinéticaspara a enzima discutida no exercício anterior na presença de um inibidor diferente([I] = 10 -4 M, fixa):Pergunta-se:[S] MVelocidade (u mol/min)sem inibidor com inibidor0,3 x 10 -5 10,4 2,10,5 x 10 -5 14,5 2,91,0 x 10 -5 22,5 4,53,0 x 10 -5 33,8 6,89,0 x 10 -5 40,5 8,1(a) Quais são os valores de V max e K M na presença deste inibidor? (b) Qual é o tipo deinibição? (c) Qual é a constante de dissociação do complexo enzima-inibidor?CARBOIDRATOS01. Stryer, Biochemistry, 3 a ed., Capítulo 14, Problema 1. Indique se cada um dos seguintespares consiste de anômeros, epímeros ou par aldose-cetose:a) D-gliceraldeido e dihidroxiacetonab) D-glicose e D-manosec) D-glicose e D-frutosed) α-D-glicose e β-D-glicosee) D-ribose e D-ribulosef) D-galactose e D-glicose02. Gumport et al., Student’s Companion to Stryer’s Biochemistry, Capítulo 14, Self-Test,Problema 3. Examine as cinco seguintes estruturas de açúcares.

Indique através das letras representativas os açúcares que:a) contêm ou são pentosesb) contêm ou são cetosesc) contêm os mesmos monossacarídeos dê o nome destesmonossacarídeosd) fornecem diferentes açúcares por hidrólise enzimática ou química da ligação glicosídicae) são redutoresf) contêm um carbono β anoméricog) sofrem mutarrotaçãoh) é sacarosei) correspondem aos que são liberados na digestão do amido03. Lehminger, Principles of Biochemistry, Capítulo 11, Problema 1. Interconversão dasformas de D-galactose.Uma solução recém-preparada da forma α (1g/ml em um tubo polarimétrico de 1 dm)mostra uma rotação óptica de + 150,7 o . Quando deixada em repouso por um longoperíodo de tempo a rotação decresce gradualmente até atingir um valor de equilíbrioigual a + 80,2 o . Em contraste, uma solução recém-preparada (1g/ml) da forma β mostrarotação ótica de apenas +52,8 o . Quando esta solução é deixada em repouso por váriashoras a rotação aumenta até o valor de equilíbrio igual a +80,2 o , valor idêntico àqueleobservado para a α-D-galactose.a) Escreva as fórmulas de projeção de Haworth das formas α e β da D-galactose. Qualcaracterística distingue as duas formas?b) Por que a rotação de uma solução recém-preparada da forma α decresce gradualmentecom o tempo? Explique por que soluções das formas α e β (de concentrações iguais)atingem o mesmo valor de rotação óptica no equilíbrio? Explique.c) Calcule a composição percentual das duas formas de galactose no equilíbrio.04. Van Eikeren, Guide to Lehninger’s Principles of Biochemistry, Capítulo 11, Structureand Properties of Monosaccharides, Study Questions and Problems, Problema 7. Frutose,o principal açúcar do mel, é comumente usada como adoçante de alimento. Este açúcarna forma β-D-piranose é provavelmente a substância mais doce conhecida. A forma β-Dfuranoseé muito menos doce.Quais são as estruturas da β-D-frutopiranose e β-D-frutofuranose?A doçura do mel diminui ao deixá-lo em repouso e ao mesmo tempo aumentando atemperatura. Explique.05. Van Eikeren, Guide to Lehninger’s Principles of Biochemistry, Capítulo 11, CovalentlyBonded Monosaccharides: Disaccharides and Polysaccharides, Study Questions andProblems. Problema 1. Conhecendo-se as fórmulas de projeção de Haworth da maltose,lactose e sacarose, identifique em cada uma delas a ligação glicosídica. Quais são osprodutos quando cada dissacarídeo é hidrolisado em presença de ácido? Escreva asestruturas dos monossacarídeos.

06. Van Eikeren, Guide to Lehninger’s Principles of Biochemistry, Capítulo 11, CovalentlyBonded Monosaccharides: Disaccharides and Polysaccharides, Study Questions andProblems. Problema 2. Uma amostra de dissacarídeo corresponde ou lactose ou sacarose.A amostra fornece resultado negativo no teste para se verificar se o dissacarídeo éredutor. Entretanto, o mesmo teste dá resultado positivo se a amostra é antes tratada comácido diluído e aquecida. A amostra desconhecida corresponde a lactose ou a sacarose?Explique.07. Lehninger, Principles of Biochemistry, Capítulo 11. Problema 7. Comparação entrecelulose e glicogênio. A Celulose, praticamente pura obtida das fibras que envolvem assementes do algodão, é resistente, fibrosa e completamente insolúvel em água.Diferentemente, o glucogênio extraído de fígado ou músculo dispersa-se facilmente emágua quente formando uma solução turva. Embora eles tenham propriedades físicasmarcadamente diferentes, as duas substâncias são compostas por moléculas de D-glicosepolimerizadas através de ligações 1 → 4 e têm pesos moleculares comparáveis.Quais características estruturais são responsáveis por estas propriedades tãodiferentes dos dois polissacarídeos?Quais as vantagens biológicas de suas respectivas propriedades físicas?08. Van Eikeren, Guide to Lehninger’s Principles of Biochemistry, Capítulo 11,Glycoproteins: Hybrid Molecules of Carbohydrate and Protein, Problema 1. A figuraabaixo mostra uma unidade repetitiva da molécula de uma glicoproteína.Escreva a fórmula de projeção de Haworth desta unidade, assumindo-se que osmonossacarídeos são ligados por ligação glucosídica β1 → 4.09. Van Eikeren, Guide to Lehninger’s Principles of Biochemistry, Capítulo 11, Self-Test,Problema 13. A porção de natureza sacarídica de algumas glicoproteínas pode servircomo sítio de reconhecimento celular. Para desempenhar esta função, os oligossacarídeosou glicoproteínas devem ter a capacidade de formar um grande número de diferentesestruturas. Qual dos dois pode produzir uma maior variedade de estruturas:oligopeptídeos compostos de cinco resíduos de diferentes aminoácidos ouoligossacarídeos compostos de cinco resíduos de diferentes monossacarídeos? Explique.10. Stryer, Biochemistry, 3 a ed. Capítulo 14, Problema 7. Supõe-se que uma unidadetrissacarídica de uma glicoproteína de uma superfície celular desempenha um papelcrítico em promover a adesão célula-célula em um determinado tecido. Planeje umexperimento simples para testar esta idéia.LIPÍDEOS e MEMBRANAS01. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 12, Problema 1. Ponto de fusão dosácidos graxos. Os pontos de fusão de uma série de ácidos graxos de 18 átomos decarbono são: ácido esteárico (69,9 o C), ácido oléico (13,4 o C), ácido linoléico (-5 o C) eácido linolénico (-11 o C). Que aspecto estrutural destes ácidos graxos de 18 carbonos

pode ser correlacionado com o ponto de fusão? Forneça uma explicação molecular paraesta tendência do ponto de fusão.02. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 12, Problema 13. Fluidez e função damembrana. Uma hipótese central, na área da pesquisa de membranas, é que os lipídeosde membrana devem ser fluídos (em oposição a "congelados") a fim de que a membranapossa desempenhar suas funções. O apoio para esta hipótese é fornecido pela observaçãode que a composição de ácido graxo das membranas pode ser alterada pelas condiçõesnas quais a bactéria cresce. Por exemplo, se a bactéria está crescendo em temperaturamenor que a normal, as quantidades observadas de ácidos graxos insaturados (relativasao conteúdo de ácido graxo saturado) estão acima do normal.Contrariamente, se a bactéria está crescendo em temperatura acima da normal, asquantidades observadas de ácidos graxos insaturados nos lipídeos da membrana (relativasaos ácidos graxos saturados) estão abaixo do normal.(a) Sugira razões por que o conteúdo lipídico na membrana bacteriana deve ser fluido paraque a membrana intacta opere apropriadamente.(b) Explique como a alteração observada nos níveis dos ácidos graxos insaturados relativaaos níveis dos ácidos graxos saturados, em diferentes temperaturas de crescimento, apóiaa hipótese da fluidez da membrana.03. Rawn, Biochemistry, Capítulo 9, Problema 1. Seja uma bicamada lipídica sintéticaformada apenas de fosfatidato, na qual as duas cadeias hidrofóbicas correspondem aoácido graxo saturado C18, ácido esteárico. Considere que a esta bicamada foramimpostas as seguintes mudanças:(a) substituição de metade das cadeias hidrofóbicas por outras cadeias hidrofóbicas derivadasde C18, nas quais ocorrem uma insaturação de configuração cis (entre C9 e C10).(b) Adição de íons Ca 2+ à solução que contém a bicamada.Em ambos os casos, faça uma previsão a respeito da temperatura de transição de fase.04. Stryer, Biochemistry, 2 a. ed., Capítulo 10, Problema 1 Quantas moléculas de fosfolipídeoexistem em 1 µm 2 da região da membrana em bicamada de fosfolipídeo? Considere que amolécula de fosfolipídeo ocupa 70 Å 2 de área.05. Rawn, Biochemistry, Capitulo 9, Problema 3. Qual é a força ("driving force") que dirigea formação de bicamadas fosfolipídicas?06. Lehninger, Principles of Biochemistry, Capítulo 4, Problema 9. O pH e a absorção dedrogas. A droga aspirina, intensamente receitada, é um ácido fraco com um pKa de 3,5.a) Escreva por fórmulas estruturais a ionização reversível da aspirina.A aspirina é absorvida para o sangue através das células de revestimento do estômagoe do intestino delgado. Para uma substância ser absorvida ela deve atravessar facilmentea membrana celular. A passagem através da membrana celular é determinada pelapolaridade da molécula: moléculas iônicas (carregadas) e moléculas altamente polarespassam lentamente, enquanto aquelas neutras e hidrofóbicas passam rapidamente. Comoo pH do suco gástrico é cerca de 1 e o pH no intestino delgado, cerca de 6, pergunta-se:b) Onde a aspirina é mais absorvida para a corrente sanguínea, no estômago ou no intestinodelgado? Justifique claramente a sua escolha.07. Rawn, Biochemistry, Capítulo 9, Problema 2. Forneça uma explicação termodinâmicapara o fato de que moléculas de fosfolipídeo difundem rapidamente no plano dabicamada, mas muito lentamente mudam de uma face à oposta.

08. Stryer, Biochemistry, 3 a. ed., Capítulo 12, Problema 5. R.D. Kornberg e H.M.McConnell (1971) pesquisaram a difusão transversa (flip-flop) de fosfolipídeos em umamembrana em bicamada usando um análogo paramagnético da fosfatidilcolina chamadofosfatidilcolina marcada com marcador de spin. (Procure a fórmula estrutural destemarcador de spin no Stryer).O grupo nitróxido (NO) em uma fosfatidilcolina marcada com marcador de spinfornece um espectro de ressonância paramagnética eletrônica característico. Este espectrodesaparece quando nitróxidos são transformados em hidroxilaminas por agentesredutores, tal como o ascorbato.Vesículas de lipídeos contendo fosfatidilcolina (95%) e o análogo marcado (5%)foram preparadas por sonicação e purificadas por cromatografia de filtração em gel. Odiâmetro externo destes lipossomos mediu cerca de 25Å. A amplitude do espectro deressonância paramagnética eletrônica decresceu a 35% do seu valor inicial em poucosminutos após a adição de ascorbato. Não houve nenhuma mudança detectável noespectro poucos minutos após a adição de uma segunda alíquota de ascorbato. Entretanto,a amplitude do espectro residual decai exponencialmente com uma meia-vida de 6,5 h.Como você interpreta estas mudanças na amplitude do espectro paramagnético?09. Campbell, Biochemistry, Capítulo 16, Problema 15. Por que, ao invés de na forma livre,o colesterol é transportado na corrente sanguínea na forma empacotada? (Ler noCampbell, no Capítulo 11, o tópico "Receptores de Membrana" e, no Capítulo 16, otópico "O Papel do Colesterol em Doenças do Coração". Ler no Stryer, no Capítulo 23,os tópicos "Colesterol e outros Lipídeos são transportados a Alvos Específicos porLipoproteínas", "O Receptor da Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) desempenha umpapel importante no controle do Metabolismo do Colesterol", "O Receptor da LDL é umaProteína Transmembrânica com cinco domínios funcionalmente diferentes" e "Aausência do Receptor de LDL leva a Hipercolesterolemia e a Aterosclerose").10. Campbell, Biochemistry, Capítulo 11, Problema 8. Que tipo de resíduos de aminoácidosé mais provável se encontrar no sítio de ligação do receptor da LDL? Dê uma razão parasua resposta.TERMODINÂMICA APLICADA ÀS REAÇÕES BIOQUÍMICAS01. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Capítulo 9, Problema 9-4. O ∆G o’para a hidrólise do ATP a ADP + Pi é -7,3 Kcal/mol.a) Calcule a constante de equilíbrio para esta reação. No equilíbrio há mais ADP que ATP ouo inverso?.b) Na célula, esta reação está no equilíbrio?02. Wood et al., Biochemistry: A Problems Approach, Capítulo 9, Problema 9-5. No interiorda célula é, em geral, o ∆G' para a hidrólise do ATP mais negativo ou menos negativoque o ∆G o’ ? Por quê?03. Stryer, Biochemistry, 3 a edição, Capítulo 13, Problema 5. A formação de Acetil CoA apartir de Acetato é um processo dependente de ATP:Acetato + ATP + CoAAcetil CoA + AMP + PPia) Calcular o ∆G o ' da reação acima, sabendo-se que os ∆G o ' de hidrólise do Acetil CoA aAcetato é -7,5 Kcal/mol e do ATP a AMP e PPi é -7,3 Kcal/mol.

) Sabendo que nas células o PPi formado é rapidamente hidrolisado a 2Pi por umapirofosfatase inorgânica (∆G o '= -8 Kcal/mol), discuta o efeito da hidrólise do PPi naformação de Acetil CoA a partir de Acetato.04. Stryer, Biochemistry, 3 a edição, Capítulo 13, Problema 4. Dados os ∆G o ' de hidrólise deglicose-6-fosfato e glicose-1-fosfato, respectivamente -3,3 Kcal/mol e -5,0 Kcal/mol,calcule:a) O ∆G o ' da isomerização de glicose-6-fosfato a glicose-1-fosfato.b) No equilíbrio, qual é a razão entre as concentrações de glicose-6-fosfato e de glicose-1-fosfato?c) Em que condições celulares a isomerização referida no item (a) poderia produzircontinuamente e em alta velocidade a glicose-1-fosfato?05. Stryer, Biochemsitry, 3 a edição, Capítulo 13, Problema 1. Discuta em que sentidoocorrem as reações abaixo, quando os reagentes estão presentes inicialmente emquantidades equimolaresa) ATP + creatina creatinafosfato + ADPb) ATP + glicerol glicerol-3-fosfato + ADPc) ATP + piruvato fosfoenolpiruvato + ADPd) ATP + glicose glicose-6-fosfato + ADP∆G o ' de hidrólisecreatinafosfato-10,3 Kcal/molglicerol-3-fosfato- 2,2 Kcal/molfosfoenolpiruvato-14,8 Kcal/molglicose-6-fosfato- 3,3 Kcal/molATP a ADP- 7,3 Kcal/mol06. Van Eikeren, quide to Lehninger's Principles of Biochemistry, Capítulo 14, Self-Test,Problema 1. Considere um ecossistema que consiste de um ovo e uma chocadeira. Aclara e a gema do ovo contêm proteínas, carboidratos e lipídeos. Se fertilizado, o ovotransforma-se de uma simples célula em um organismo complexo. Discuta este processoirreversível em termos de variações de entropia que se verificam no sistema, vizinhançase universo. Esteja certo de que, antes de mais nada, você tenha definido claramente osistema e as vizinhanças.INTRODUÇÃO AO METABOLISMO01. Considerar o mapa metabólico simplificado apresentado em classe e responder:(a) Quais são os passos irreversíveis que aparecem no mapa?(b) Qual é o primeiro composto comum que aparece na degradação de proteínas, lipídeos ecarboidratos?(c) Animais de laboratório foram submetidos a dietas compostas exclusivamente decarboidratos, ou lipídeos, ou proteínas. Analisar em que caso haveria sobrevivência,verificando se é possível sintetizar:ácido graxo a partir de glicoseproteína a partir de glicoseglicose a partir de ácido graxoproteína a partir de ácido graxoglicose a partir de proteínaácido graxo a partir de proteína

Em cada caso afirmativo, indicar a via utilizada02. Que compostos um indivíduo deve obrigatoriamente receber na dieta? Utilizar apenas asinformações do mapa metabólico simplificado.03. Glicose é utilizada como fonte de energia para a célula, ou organismo com a finalidadede produzir ATP. O excesso de glicose pode ser convertido em gordura. O esquemasimplificado abaixo mostra estas duas possibilidades:Discuta:a) Neste esquema, quais são as possíveis reações catalisadas por enzimas alostéricas?b) Como funciona o esquema acima quando há disponibilidade de muita glicose?c) O substrato B pode dar origem a dois produtos diferentes. Faça os gráficos de velocidadeem função da concentração de B para cada uma das enzimas.d) Quando houver pouca disponibilidade de B qual seu caminho preferencial? Por quê?04. Lehninger, Principles of Biochemistry, Capítulo 13, Problema 5. Comparação entre viacatabólica e via anabólica. A interconversão de glicose a frutose-1,6-difosfato, uma sériemuito importante de etapas no metabolismo de carboidratos, é mostrada abaixo. Aquebra da glicose constitui a via catabólica, enquanto a biossíntese de glicose a partir defrutose-1,6-difosfato corresponde a via anabólica. Ambas as vias usam as mesmashexoses monofosfato intermediárias. Embora estas vias tenham semelhanças, elasapresentam diferenças básicas. A finalidade deste exercício é reconhecê-las.

a) Esquematize a reação balanceada para cada passo na via catabólica. Escreva a equaçãolíquida que resulta quando soma-se os passos individuais.b) Repita o item (a) para a via anabólica.c) Baseado nas equações líquidas, quais são as diferenças que podem ser notadas entre asvias catabólica e anabólica? As duas vias são simplesmente o reverso uma da outra?d) O que assegura o sentido das reações individuais no catabolismo da glicose? Ou seja, oque impede que no catabolismo da glicose passe a ocorrer por vias reversas?e) Nas vias catabólica e anabólica, a interconversão de glicose e glicose-6-fosfato poderia sercatalisada pela mesma enzima? Explique. A interconversão de glicose-6-fosfato efrutose-6-fosfato nas vias catabólica e anabólica poderia ser catalisada pela mesmaenzima? ExpliqueGLICÓLISE01. Stryer, Biochemistry 3 a edição, Capítulo 15, Problema 3. Escreva a equação balanceadapara a conversão da Glicose a Lactato.a) Calcule a variação de energia livre padrão desta reação usando os dados apresentados natabela 15-2 do capítulo 15 do Stryer (3 a edição) e levando em conta que o ∆G o' para areação Piruvato + NADH + H + → Lactato + NAD + , é igual a -6 Kcal/molb) Qual é a variação de energia livre (∆G', não ∆G o’ ) para esta reação quando asconcentrações de reagentes e produtos são:Glicose 5 mM ADP 0,2 mMLactato 0,05 mM Pi 1 mMATP2 mM02. Stryer, Biochemistry, 3 a edição, Capítulo 15, Problema 2. Glicose marcada com 14 C emC-1 é incubada com as enzimas da glicólise e os cofatores necessários. Qual é adistribuição de 14 C no Piruvato que é formado? (Considerar que a interconversão entreGliceraldeído 3-fosfato e Dihidroxiacetona fosfato é muito rápida comparada com opasso subsequente).03. Discutir a regulação da via glicolítica em função da relação ATP/ADP.04. Em relação a via glicolítica:a) Verificar os compostos que apresentam ligações tipo: fosfoenol, anidrido fosfórico e ésterfosfórico e identificar aqueles que são compostos ricos em energiab) Indicar as reações de oxidorreduçãoc) Dizer como é regulada a via glicolítica e citar as enzimas e seus moduladoresd) Mostrar os passos irreversíveis que fazem parte do mapae) Determinar quantas moléculas de Ácido Pirúvico se formam a partir de uma molécula dehexose05. Rawn, Biochemistry, Capítulo, 12, Problema 14. Uma pessoa incapaz de executarexercícios físicos intensos e prolongados teve suas enzimas analisadas. Todas as enzimasda via glicolítica estavam em concentração normal, com excessão da fosfogliceratomutase muscular.

a) Como será afetada a produção de energia metabólica em uma célula que apresenta baixosníveis desta enzima?b) Como será afetada a produção de Lactato na ausência desta enzima? [Referência: DiMauro, S.; Miranda, A.F.; Kahn, S.; Gitlin, K. - Human muscle phosphoglycerate mutasedeficiency Science 212: 1277-1279, 1981].β-OXIDAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS01. Carnitina é amplamente distribuída nos tecidos, mas atinge concentração elevada nomúsculo. O que sugere este dado?02. Cite os compostos que devem ser fornecidos para a manutenção da espiral de Lynen.03. Compare a oxidação de 3 Glicose → Acetil-CoA, com a oxidação de Ácido Láurico(12C) a Acetil-CoA, quanto a:a) Número de moléculas de Acetil-CoA formadasb) Liberação de CO 2c) Gasto em ATPd) Saldo de ATPe) Número de moléculas de NADH ou FADH 2 formadasf) Coenzimas e vitaminas envolvidasg) Localização celular04. Indique o caminho percorrido pelos carbonos do Glicerol na sua transformação a AcetilCoA.CICLO DE KREBS01. Quando uma preparação de mitocôndrias (convenientemente tratada) é incubada comAcetil-CoA, verifica-se que para cada mol de Acetil-CoA adicionado formam-se doismoles de CO 2 e que a velocidade de formação de CO 2 (µl de CO 2 /min) tem um valor Aqualquer.a) Quando se adiciona Acetil-CoA + Succinato, observa-se que a velocidade da produção deCO 2 aumenta e o aumento de CO 2 produzido excede a quantidade de Succinatoadicionado, ou seja, o efeito do Succinato é catalítico.Discuta as observações acima.b) O que aconteceria se a incubação fosse feita na presença de Acetil-CoA + Succinato +Malonato?02. Como os intermediários do ciclo de Krebs poderiam ser repostos se houvesse intensasíntese de Ácido Aspártico e Glutâmico às custas dos intermediários do ciclo de Krebs?03. A carboxilase pirúvica é estimulada alostericamente por Acetil-CoA. Discuta aimportância deste fato para o metabolismo energético.04. Mostre como o ciclo de Krebs e a glicólise podem ser reguladas pela isocitratodesidrogenase.

05. Por que um esquimó com dieta deficiente em carboidratos estaria nutricionalmentemelhor comendo alimentos com lipídeos contendo ácidos graxos com número ímpar deátomos de Carbono ao invés de número par?CADEIA RESPIRATÓRIA01. A relação entre energia livre de uma reação e o potencial redox é:∆G o ' = -nF∆E o ' onde n é o número de elétrons transferidosF é a constante de Faraday(F = 23.060 cal V -1 )∆E o ' é o potencial padrão da dupla redox.Utilizar esta relação para calcular os pontos da cadeia respiratória onde a energia"liberada" na reação de transferência de elétrons poderia ser usada para a síntese de umcomposto rico em energia, aproximadamente +7300 cal/mol.02. A uma solução 1 M de NAD + , NADH, Piruvato e Lactato, adicionou-se lactatodesidrogenase:Lactato + NAD + ↔ Piruvato + NADH + H +E o ' (NAD + /NADH) = -0,32 VE o ' (Piruvato/Lactato) = 0,19 Va) Em que sentido a reação ocorrerá?b) À medida que a reação ocorre, como variam esses potenciais redox?c) Quando a reação atingirá o equilíbrio? Qual o valor do potencial redox (∆E) nessasituação?03. Citar as consequências dos seguintes fatores para o funcionamento da cadeia respiratóriae da fosforilação oxidativa:a) Presença de KCN ou COb) Carência de Pic) Carência de ADPd) Presença de DNP (dinitrofenol)e) Carência de Pi e/ou ADP em presença de DNPf) Presença de oligomicinag) Presença de oligomicina + DNP04. Uma droga X inibe o consumo de O 2 e a síntese de ATP em uma suspensão demitocôndrias. Que tipo de droga deveria ser adicionada para se determinar o modo deação da droga X?05. Calcular o número de moléculas de ATPs formadas na oxidação total de:I. glicose (uma molécula)II. ácido palmítico (16C) (uma molécula)a) Qual seria o destino da energia não armazenada sob a forma de ATP?b) Qual seria o resultado na presença de dinitrofenol?06. Discutir o funcionamento do ciclo de Krebs, beta-oxidação e via glicolítica em umasuspensão de células hepáticas na presença dos seguintes compostos:

antimicina, oligomicina, dinitrofenol, antimicina + dinitrofenol e oligomicina +dinitrofenol.Justificar.07. A membrana externa da mitocôndria é permeável à maioria dos solutos de baixo pesomolecular. A membrana interna, entretanto, possui seletividade, sendo impermeável porexemplo a coenzimas, nucleotídeos, etc. De posse dessas informações responder asseguintes indagações:a) Como os acil-CoA produzidos após ativação dos ácidos graxos podem ser degradados naβ-oxidação?b) Como o NADH produzido na via glicolítica pode ser reoxidado na cadeia respiratória?c) Como o ATP produzido na cadeia respiratória pode ser utilizado nas biossínteses queocorrem no citoplasma?08. Um microorganismo aeróbico facultativo é cultivado em meio líquido glicosado comaeração e sem aeração. Em qual das duas culturas o consumo de glicose pelas células émaior? Justificar a resposta em termos de regulação metabólica.09. Aceita-se que a oxidação de NADH ao nível de cadeia respiratória produz, em média, 3ATP. É conhecido que existem "sítios" de produção de ATP (quais?). Discutir a relaçãoestequiométrica e a existência de "sítios" à luz da teoria do acoplamento quimiosmótico.VIA DAS PENTOSES01. Pode-se considerar, para efeito de melhor compreensão, que a via das pentoses constituisede um ramo oxidativo (transformação irreversível de glicose-6-fosfato a pentoses) e deum ramo não oxidativo (transformação reversível de pentoses a frutose-6-fosfato egliceraldeído-3-fosfato). Partindo-se de glicose-6-fosfato e considerando-se estes doisramos, pede-se indicar como podem ser obtidos os seguintes intermediários quando umadeterminada célula deles necessite em grandes quantidades:a) ribose-5-fosfatob) ribose-5-fosfato e NADPHc) NADPH02. Experimentos com glicose-6-fosfato marcada com isótopo radioativo ( 14 C) no C 1 ou noC 6 indicam quanto do substrato inicial é metabolizado pela via das pentoses e quanto émetabolizado pela ação combinada da glicólise e ciclo de Krebs. Uma alíquota dohomogenato do tecido em estudo é incubada com glicose-6-fosfato com 14 C no C 1 eoutra, com o mesmo substrato com 14 C no C 6 . Que resultado deve ser esperado, emtermos de produção de 14 CO 2 em função do tempo, se o homogenato metabolizaglicose-6-fosfato:a) Somente pela ação combinada da glicólise e ciclo de Krebs,b) Somente pela via das pentoses, ec) Pelas duas vias simultaneamente03. Discutir as condições em que deverá haver predomínio de uma das vias (glicólise ou viadas pentoses) no metabolismo da glicose. Citar os tecidos onde a via das pentoses é maisativa.04. Esquematizar o catabolismo da glicose na hemácia enfatizando:

a) O destino do lactatob) A função do NADPHA hemácia é uma célula aeróbica? Ela utiliza o oxigênio transportado pelahemoglobina?05. Ler o Stryer, no cap. referente a Via das Pentoses, o tópico: "A deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase causa anemia hemolítica induzida por droga".BIOSSÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS01. Escrever a equação de síntese de ácido palmítico (16C) a partir de Acetil-CoA.02. Comparar a beta-oxidação com a biossíntese de ácidos graxos no complexomultienzimático quanto a:a) Localização celularb) Coenzimas envolvidas e suas vitaminasc) Carregador de grupo acilad) Forma em que as unidades de carbono são removidas ou adicionadas03. Comparar a degradação de ácido palmítico até acetil-CoA com sua síntese a partir deacetil-CoA quanto a necessidade de:a) ATPb) Coenzimas04. Discutir a regulação da síntese de ácidos graxos em função da relação ATP/ADP05. A síntese de triglicerídeos requer glicerol-3-fosfato, mas o tecido adiposo não possui aenzima glicerol quinase. Como os adipócitos obtém esse composto essencial para aestocagem de ácidos graxos ?06. Verificar em quais das seguintes situações haverá estímulo da formação de corposcetônicos:a) Dieta rica em carboidratos e normal em lipídeosb) Jejumc) Dieta rica em lipídeos e normal em carboidratosd) Diabetes07. Em caso de jejum prolongado o cérebro passa a oxidar também corpos cetônicos, alémde glicose, como fonte de energia. Citar as enzimas que o cérebro deve sintetizar nessaadaptação metabólica.08. Citar as vias de produção e de utilização de acetil-CoA pela célula.09. Explicar com base na regulação de enzimas alostéricas o fato de uma dieta rica emcarboidratos promover o acúmulo de lipídeos.NEOGLICOGÊNESE01. O hepatócito pode reverter a transformação de glicose em piruvato apesar de haver trêsreações irreversíveis na glicólise. Em cada uma dessas etapas, comparar as reações no

sentido glicose → piruvato e piruvato → glicose, quanto às enzimas, reagentes, produtose coenzimas.02. Lactato produzido pelo músculo e pelas hemácias pode ser utilizado pelo fígado paraconvertê-lo novamente em glicose. Calcular o número de moléculas de ATP, pormolécula de glicose, necessário a essa conversão.03. Lehninger, Princípios de Bioquímica. Capítulo, 20, Problema 4. Quais são os efeitos deconcentração crescente de ATP e AMP nas atividades catalíticas de frutose difosfatase efosfofrutoquinase? Quais são as consequências destes efeitos do ATP e AMP no fluxorelativo dos metabolitos através da neoglicogênese e da glicólise?04. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 20, Problema 5. Um procedimentocomum para determinação da efetividade de compostos como precursores da glicose écolocar um animal em jejum até que os estoques de glicogênio do fígado sejamdepletados e então administrar o substrato em questão. Um substrato que leva a umaumento líquido no glicogênio hepático é chamado de glicogênico pois ele deve primeiroser convertido em glicose-6-fosfato. Mostre por meio de reações enzimáticas conhecidasquais das seguintes substâncias são glicogênicas:(a) succinato, (b) glicerol, (c) acetil CoA, (d) piruvato e (e) butirato.Escreva as fórmulas estruturais das substâncias relacionadas de (a) a (e).05. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 20, Problema 6. As concentrações delactato no plasma sanguíneo, antes, durante e depois de uma corrida de 400 metros serãomostradas no gráfico concentração de lactato sanguíneo versus tempo, a ser fornecidodurante a aula. (Ver no livro).(a) O que provoca a rápida elevação na concentração do lactato?(b) O que provoca o declínio do nível do lactato depois do término da corrida? Porque o declínio ocorre mais lentamente de que a elevação?(c) Por que a concentração do lactato não é zero durante o estado de repouso?SÍNTESE E DEGRADAÇÃO DO GLICOGÊNIO01. Esquematizar simplificadamente a estrutura da molécula do glicogênio indicando osterminais não redutores, redutor e pontos de ramificação e mostrar as ações das seguintesenzimas envolvidas na degradação do polissacarídeo a glicose-6-fosfato:(a) fosforilase, (b) transferase (enzima de desramificação), (c) α-1,6-glicosidase, (d)fosfoglicomutase02. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 20, Problema 9. Escrever a sequência e areação global requeridas para calcular o custo em número de moléculas de ATPsnecessárias para a conversão de glicose-6-fosfato citoplasmática em glicogênio e deste devolta a glicose-6-fosfato. Que fração do número máximo de ATPs, que é disponível docatabolismo completo da glicose-6-fosfato, este custo representa?03. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 20, Problema 10. Uma amostra de tecidode fígado foi obtida "post-mortem" do corpo de um paciente, o qual acreditava-se sergeneticamente deficiente em uma das enzimas do metabolismo de carboidratos. Umhomogenato da amostra do fígado mostrou as seguintes características:1. Degradou glicogênio a glicose-6-fosfato2. Foi incapaz de sintetizar glicogênio a partir de qualquer açúcar mais simples, ouutilizar galactose como fonte de energia, e3. Sintetizou glicose-6-fosfato a partir de lactato.

Qual das três enzimas seguintes é deficiente?(a) glicogênio fosforilase, (b) frutose difosfatase, (c) UDP-glicose pirofosforilaseFornecer razões para sua escolha04. Nível alto de insulina no sangue indica que o organismo está bem nutrido (período logoapós a refeição). Nível baixo, por outro lado denota estado de jejum. Glucagon age demaneira oposta à de insulina. Adrenalina tem ação semelhante à do glucagon.Relacionar estas afirmações com o papel destes hormônios na síntese e degradaçãodo glicogênio.05. Existem várias doenças relacionadas com alterações no metabolimo do glicogênio.Nestas doenças certas enzimas são produzidas em forma defeituosa, ou em quantidadedeficientes ou mesmo não são produzidas.Indicar, nos casos assinalados, na sequência das reações metabólicas, o passo que éafetado e o que isto implica na síntese e/ou degradação do glicogênio.nome da doença enzima deficienteVon Gierke glicose-6-fosfataseCoriα-1,6-glicosidaseMcArdlefosforilase de músculoAndersenenzima ramificadoraMETABOLISMO DE AMINOÁCIDOS01. Esquematizar as reações que permitem a síntese da maioria dos aminoácidos a partir deNH 3 , alfa-cetoglutarato e alfa-cetoácidos correspondentes. Discutir as implicações dareversibilidade das reações.02. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 19, Problema 6. Os três átomos decarbono no lactato e alanina tem estados de oxidação idênticos, e animais podem usarqualquer um deles como combustível metabólico. Comparar o rendimento líquido deATP (moles de ATP por mol de substrato) para a oxidação completa (a CO 2 e H 2 O) delactato versus alanina quando o custo de excreção de nitrogênio como uréia é incluído.03. A alanina desempenha um papel importante no transporte de amônia para o fígado, numaforma não tóxica. A amônia produzida no músculo e outros tecidos, principalmente peladegradação de aminoácidos, torna-se o alfa-amino grupo da alanina e desta forma étransportada do músculo (e outros tecidos) para o fígado através da corrente sanguínea.No fígado, a alanina perde o amino grupo que é eliminado como uréia. O esqueletocarbônico da alanina é convertido em glicose, que volta através da corrente sanguínea aomúsculo. Esta interrelação entre músculo e fígado é chamada ciclo da alanina-glicose.Esquematize o ciclo da alanina-glicose. Identifique as vias metabólicas envolvidasem células de músculo e fígado.04. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 9, Problema 4. Uma criança de dois anosde idade foi levada ao hospital. Sua mãe indicou que ela vomitava frequentemente,especialmente após as refeições. O peso da criança e o seu desenvolvimento físico eramabaixo do normal. Seus cabelos, embora escuros, continham porções de cabelos brancos.Uma amostra de urina tratada com cloreto férrico (FeCl 3 ) apresentou cor verdecaracterística da presença de ácido fenilpirúvico. A análise quantitativa de amostras deurina apresentou os resultados mostrados na tabela abaixo:SubstânciaPacienteNormal(mmol/l)(mmol/l)Fenilalanina 7,0 0,01

Fenilpiruvato 4,8 0Fenilactato 10,3 0a) Sugerir a enzima que possa estar deficiente. Propor um tratamento para esta condição.b) Por que a fenilalanina aparece na urina em grandes quantidades?c) Qual é a fonte de fenilpiruvato e do fenilactato? Por que estas vias (normalmente nãofuncionais) entram em ação quando a concentração de fenilalanina se eleva?d) Por que o cabelo da paciente apresenta porções brancas?05. Analisar as consequências, para o metabolismo geral, de uma dieta calórica normal econtendo proteínas de baixo valor biológico (proteína com baixo conteúdo emaminoácidos essenciais).Definir balanço de nitrogênio. O que significa balanço de nitrogênio negativo, zero epositivo?AÇÃO HORMONAL01. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 25, Problema 3. Baseados nas suaspropriedades físicas, os hormônios caem em duas categorias; aqueles que são muitosolúveis em água mas relativamente insolúveis nos lipídeos, por exemplo, a adrenalina, eaqueles que são relativamente insolúveis em água mas altamente solúveis nos lipídeos,por exemplo, os hormônios esteroídicos. Na sua função de reguladores da atividadecelular, a maioria dos hormônios hidrossolúveis não penetram no interior das células dostecidos-alvo. Os hormônios lipossolúveis, por outro lado, penetram nas células-alvo efinalmente atuam no núcleo. Qual é a base para a correlação entre solubilidade, alocalização dos receptores e o modo de ação destas duas categorias de hormônios?02. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 25, Problema 4. Na década de 50, EarlSutherland e seus colegas realizaram experimentos pioneiros para elucidar o mecanismode ação da adrenalina e do glucagon. À luz da nossa atual compreensão da açãohormonal interprete cada um dos seus experimentos descritos abaixo. Identifique oscomponentes e indique o significado dos resultados.a) A adição da adrenalina a um homogeneizado ou preparação de células rompidas do fígadonormal resulta num aumento da atividade da glicogênio fosforilase. Entretanto, se ohomogeneizado for primeiro centrifugado numa alta velocidade e a adrenalina ou oglucagon adicionados à fração sobrenadante límpida, nenhum aumento na atividade dasua fosforilase é observado.b) Quando a fração particulada, sedimentada de um homogeneizado do fígado porcentrifugação é preparada e tratada com adrenalina, uma nova substância é produzida.Esta substância foi isolada e purificada. Ao contrário da adrenalina, esta substância ativa aglicogênio fosforilase quando adicionada à fração sobrenadante do homogeneizado.c) A substância formada pela fração particulada era estável ao calor; isto é o tratamento comcalor não impedia sua capacidade de ativar a glicogênio fosforilase (Dica: seria este ocaso se a substância fosse uma proteína?). A substância era idêntica a um compostoobtido quando ATP puro era tratado com hidróxido de bário.03. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 25, Problema 7. Durante uma situação de"lutar ou correr", a liberação de adrenalina promove a degradação do glicogênio nofígado, coração e músculo esquelético. O produto da degradação do glicogênio no fígadoé a glicose. Ao contrário, o glicogênio do músculo esquelético é degradado pela glicólise:

a) Por que produtos diferentes são observados na degradação do glicogênio nestes doistecidos diferentes?b) Qual é a vantagem para o organismo durante uma condição de "lutar ou correr", de se terestas vias específicas de degradação do glicogênio?04. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 25, Problema 8. Certos tumores malignosdo pâncreas provocam uma excessiva produção de insulina pelas células B. Taispacientes apresentam calafrios e tremores, fraqueza e fadiga, sudorese e fome. Se estacondição se prolongar ocorre lesão cerebral. Qual é o efeito do hiperinsulinismo nometabolismo dos carboidratos, aminoácidos e lipídeos do fígado? Quais são as causasdos sintomas observados? Sugira por que esta condição, se prolongada leva a lesãocerebral?INTEGRAÇÃO METABÓLICA01. Os nutrientes absorvidos no trato intestinal passam diretamente ao fígado (com excessãode uma grande parte de triacilgliceróis). Por este grande centro de distribuição, açúcares,aminoácidos e aluguns lipídeos são processados e distribuídos aos outros órgãos etecidos. Propor um mapa metabólico unificado, integrando as principais vias destesnutrientes neste órgão.02. Ao contrário do músculo esquelético, o músculo cardíaco deve trabalhar constante eritmicamente. O que torna possível, a nível de metabolismo e características da célulacardíaca, esta adaptação para o trabalho constante?03. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 24, Problema 14. O glicerol-3-fosfato éum intermediário chave na biossíntese dos triacilgliceróis. As células adiposas, que sãoespecializadas na síntese e degradação dos triacilgliceróis, não podem usar o gliceroldiretamente devido à falta da gliceroquinase, que catalisa a reação:Glicerol + ATP → Glicerol-3-fosfato + ADPComo o tecido adiposo obtém o glicerol-3-fosfato necessário para a síntese dotriacilglicerol? Explicar.04. Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 24, Problema 20. Pacientes comdeficiência de tiamina exibem um conjunto de sinais neurológicos característicos: perdados reflexos, estado de ansiedade e confusão mental. Sugira uma razão por que adeficiéncia de tiamina é manifestada na função cerebral.05. A tabela (a ser fornecida na sala de aula) indica vários efeitos da deficiência de insulina(Diabetes mellitus) no metabolismo. Para cada um dos ítens compare com uma situaçãoem que o organismo foi submetido a jejum severo.(Ver tabela 25-6 do Lehninger, Princípios de Bioquímica, Capítulo 25).06.Van Eikeren , Guide to Lehninger’s Principles of Biochemistry, Capítulo 26 (NutriçãoHumana), Challenge Problems, Problema 19.Acidose láctica e hipoglicemia em dependentes de álcool.Pessoas que consomem muita bebida alcoólica desenvolvem níveis sangüíneos nãonormal e baixo em glicose (hipoglicemia), maior do que o normal de ácido láctico(acidose láctica suave) e ainda apresentam cetose. Explique.

QBQ-211BIOQUÍMICA: ESTRUTURA DE BIOMOLÉCULASe METABOLISMO1996LABORATÓRIOS: I, II, III, IV, V e VI

OBJETIVOSQBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO ITITULAÇÃO E CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOSIdentificação de um aminoácido através de cromatografia em papel e de titulação.01. Execução de cromatografia em papel e de titulação02. Identificação de um aminoácido através de seu Rf e de seus pKas03. Comparação da curva de titulação de um aminoácido com a de um ácido fracomonoprótico04. Verificação do pH de diversos fluidos biológicos mais comuns (de origem vegetal eanimal) e não biológicos, conforme mostrado na figura 2-15 do Rawn, Biochemistry, pg39 e na figura 4-9 do Lehninger, Principles of Biochemistry, pg 77.FUNDAMENTOSAs unidades constituintes das proteínas são os L α-aminoácidos. Como o próprionome indica, estes compostos em suas moléculas apresentam pelo menos um grupo amina(-NH 2 ) e um grupo carboxílico (-COOH). Em consequência deste fato, ao serem dissolvidosem água, os aminoácidos apresentam caráter anfotérico, ou seja comportam-se como ácido ecomo base. Os grupos amina e carboxila podem sofrer protonações e desprotonaçõesreversíveis, isto é comportam-se como eletrólitos fracos. Se os considerarmos em suasformas de ácidos conjugados: -NH + e -COOH, veremos que cada um deles apresentará um3valor de pKa. Assim, um aminoácido apresenta pelo menos dois valores de pKa edependendo da natureza ionizável ou não do grupo R ligado ao carbono alfa, pode ocorrer ounão um terceiro valor de pKa.Em pH 7,0 e no estado sólido, o amino grupo apresenta-se protonado (forma ácida) eo grupo carboxila desprotonado (forma básica).Neste experimento utilizaremos um processo de separação de aminoácidos baseadona polaridade dos grupos R de cadeia lateral e que determina a preferência do aminoácidopor uma fase líquida polar ou apolar, isto é sua partição entre duas fases. A água que hidrataa celulose, principal constituinte do papel, constitui a fase polar, neste caso a faseestacionária, enquanto que o solvente orgânico que migra pelo papel por capilaridadeconstitui a fase apolar, neste caso a fase móvel. Assim, quanto mais apolar for o grupo R,maior a mobilidde do aminoácido com a fase móvel e o seu Rf maior . O Rf é dado pela

elação entre a distância percorrida pelo aminoácido no papel e a distância percorrida pelafase móvel. A Tabela I apresenta valores de Rf de alguns aminoácidos.Através da cromatografia em papel identificaremos um aminoácido desconhecido emcomparação com quatro outros conhecidos e por isso denominados de aminoácidos-padrão.Com ajuda da Tabela I e dos valores de pKa obtidos na titulação, confirmaremos aidentidade do aminoácido.TABELA IRf de vários aminoácidos determinados nas seguintes condições:solvente de Partridge, n-butanol/ácido acético glacial/água (4:1:1),papel Whatman n o 1 e temperatura 20 o CAminoácido Rf Aminoácido RfCys 0,08 Ala 0,38Lys 0,14 Pro 0,43His 0,20 Tyr 0,45Arg 0,20 Trp 0,50Asp 0,24 Met 0,55Gly 0,26 Val 0,60Ser 0,27 Phe 0,68Glu 0,30 Ile 0,72Thr 0,35 Leu 0,73TABELA IIAminoácidopKaGlu 2,194,259,67Lys 2,188,9510,53Gly 2,349,6His 1,826,09,17Cys 1,718,3310,78Thr 2,6210,43Asn 2,028,80Ala 2,309,70Leu 2,369,60Pro 1,9910,60

PROCEDIMENTO1. CROMATOGRAFIA EM PAPELTomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman n o 1 e fazer um traço a lápis aolongo do comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a operação.Deixar uma margem de 1,5cm de cada lado.Marcar seis pontos sobre essa linha que distem 4cm um do outro e numerá-los a lápis de 1 a 6. As amostras devem ser aplicadas nos pontosnumerados com auxílio de um capilar de tal modo que a mancha formada sobre o papel sejaa menor possível. Nos números de 1 a 4 aplicar os padrões e no número 6, a mistura depadrões. A amostra desconhecida é aplicada no número 5. Enrolar o papel de modo atransformá-lo em um cilindro e prender as extremidades superiores com clip. Colocar 25 mlde solvente de Partridge (n- butanol/ácido acético glacial/água 4:1:1) em uma placa de Petri emergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente navertical. Evitar que o papel toque na parede da placa. Cobrir o sistema com um béquer de 2litros e deixar o solvente migrar 10 cm. Retirar o papel e marcar imediatamente a linha defrente do solvente. Secar o papel na capela, mergulhar em solução 0,1% de ninhidrina emacetona e levar á estufa (80 o C-100 o C) por alguns minutos. Delimitar com lápis as manchasque aparecem no papel. Determinar o Rf dos padrões e do aminoácido desconhecido.2. TITULAÇÃOColocar 50 ml da solução do aminoácido (0,10 M) em pH 1,0 em um béquer e titularcom solução 0,5 M de KOH medindo o pH após cada adição de 1 ml até atingir pH 11,0.Colocar 50 ml de ácido acético 0,15 M em outro béquer e titular com solução 0,5 Mde KOH medindo o pH após cada adição de 0,5 ml até pH 12,0.ANÁLISE DOS RESULTADOS E DISCUSSÃOCROMATOGRAFIA E TITULAÇÃO01. Comparar seus valores de Rf para os aminoácidos padrão com os valores da TABELA I.Discutir a respeito das possíveis causas de discrepâncias.02. Fazer um gráfico de titulação do aminoácido com base. Estimar os valores de pKas ecomparar estes valores obtidos para o aminoácido desconhecido com aqueles daTABELA II.Fazer o gráfico de titulação do ácido acético.Comparar as curvas de titulação do aminoácido e do ácido fraco.03. Identificar seu aminoácido desconhecido, escrever sua estrutura e suas sucessivasionizações verificadas ao se aumentar o pH.MEDIDA DO pH DE ALGUNS FLUÍDOS BIOLÓGICOS OU NÃO E COMPARAÇÃO DOSVALORES OBTIDOS COM AQUELES APRESENTADOS NA FIGURA 2-15 DO LIVRO DO RAWNOU FIGURA 4-9 DO LIVRO DO LEHNINGER

Selecionar alguns fluidos, com os quais não haja problemas de manipulação e medirseu pH. Eventualmente com auxílio de uma pipeta Pasteur adicionar uma vez, HCl gota agota e outra vez, KOH. Observar a resistência ou não à variação do pH.

QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO IIELETROFORESE EM PAPEL E DOSAGEM COLORIMÉTRICA DEPROTEÍNASIdentificação de proteínas através da eletroforese em acetato de celulose eeletroforese de proteínas do soro humano na mesma matriz em tampão barbital-Tris pH =8,6.Determinação da concentração de uma proteína em solução aquosa através dacolorimetria.OBJETIVOSExecução de uma eletroforese em fita de acetato de celulose.Identificação eletroforética de proteínas e identificação das classes de proteínas dosoro humano.Previsão da direção de migração proteica em base aos pIs e ao pH da solução.Montagem de um protocolo para construção de uma curva padrão para determinaçãoda concentração de proteínas pelo Método do Biureto.FUNDAMENTOS(I) ELETROFORESEA eletroforese abrange todas as operações nas quais as moléculas carregadas migramnum campo elétrico através de soluções.Dependendo da ausência ou presença de uma matriz rígida que sirva como suporte àsolução submetida a um campo elétrico, podem existir dois tipos de eletroforese:Eletroforese em solução - O seu uso é limitado. Consiste em se efetuar a operaçãoem tampão aquoso na ausência matriz-suporte. Esse sistema é vulnerável às pertubaçõesmecânicas (choques, correntes de convecção) o que leva à mistura das bandas em migração eà consequente perda da resolução. As modificações introduzidas para a estabilizaçãomecânica do sistema não se constituem em refinamentos que possam permitir larga aceitaçãodeste método.Eletroforese de zona - Os métodos eletroforéticos aqui englobados são maisutilizados. Consiste basicamente em efetuar a operação com a solução mantida em umamatriz rígida que a suporta (exemplos de matriz: papel, acetato de celulose, gel depoliacrilamida, gel de agarose (poligalactose) e outras). Aqui o termo zona quer indicar que aamostra submetida à eletroforese migra delimitando uma pequena região ou zona no suporte(papel, fita de acetato de celulose ou gel). As perturbações mecânicas, neste caso não afetamo sistema.Os dois tipos de eletroforese são governados pela expressão:constante • (voltagem aplicada) • (carga líquida)Mobilidade =(fricção molecular)

Assim a mobilidade de uma molécula numa solução aumenta com o aumento davoltagem ou carga da molécula e diminui com o aumento da ficção. Esta última depende dotamanho e da forma da molécula.Macromoléculas, como as proteínas, podem ter suas mobilidades eletroforéticaspreditas pela expressão acima. Porém, efetuar esta previsão pode não ser muito simplesporque a forma da molécula influencia na fricção (moléculas filamentosas - um eixoprepondera sobre o outro - têm menos mobilidade que moléculas esféricas). Também, acarga de macromoléculas é bastante afetada pela presença de outros íons, além do H + . Estesfatores ligados a forma e a carga podem dificultar a previsão da mobilidade paramacromoléculas.Proteínas do soro humano - Quando se permite que uma amostra de sanguecoagule, obtem-se por centrifugação uma solução denominada soro.Plasma é a solução obtida por centrifugação do sangue total na presença de anticoagulante.A diferença entre plasma e soro reside no fato de que o primeiro contém, além dasproteínas do soro, fibrinogênio, fibrina e fatores de coagulação. Estas três últimas proteínas,no plasma estão em solução.As proteínas do plasma são classificadas em base ao comportamento eletroforético,em seis categorias:ClassePorcentagem em relaçãoao total de proteínasAlbumina 55Função/NaturezaMantém a pressão osmótica.Transportadora de ânions orgânicos(ex. ânion dos ácidos graxos, defármacos (ex. aspirina).α 1 -Globulinas 5 Glicoproteínas e lipoproteínas HDL.α 2 -Globulinas 9 Transportadoras de hemoglobinas livreno plasma (haptoglobina), de Cu 2+ ,(ceruloplasmina) e LipoproteínasVDL.β-Globulinas 13 Transportadores de Fe 2+ (transferrina)e Lipoproteínas LDLFibrinogênio 7 Formador do coâguloγ-Globulinas 11 ImunoglobulinasA eletroforese de proteínas do soro é efetuada em papel de acetato de celuloseembebido de tampão barbital-Tris (as extremidades da fita mergulhadas no mesmo tampão)em pH 8,6. Este pH é maior que os pIs de todas as proteínas normais (albumina e globulinas)de tal forma que elas se apresentam negativamente carregadas e migram em direção ao anodo(polo positivo). A albumina é a mais negativa e a γ-globulina, a menos negativa dasproteínas.pH < pIpH > pImacromolécula pI macromoléculacom cargacom cargapositivanegativa

As γ-globulinas são sintetizadas por uma classe especial de linfócitos e as outrasproteínas plasmáticas são produzidas pelo fígado. Desta forma, a análise do resultado daeletroforese pode indicar uma possível doença hepática. De fato, a eletroforese de proteínasdo soro constitui-se numa análise clínica importante.Para maiores esclarecimentos, inclusive fotos de fita onde foi corrida umaeletroforese e sua respectiva densitometria, consultar o “Biochemistry: a case-orientedapproach” (The C.V. Mosby Company) 5 a ed. autores: Montagomery, Conway e Spector(pag. 67).DOSAGEM DE PROTEÍNA POR COLORIMETRIAA fotometria é frequentemente usada para se determinar a concentração de umcomposto que absorve luz monocromática que está presente em solução. A lei de Lambert eBeer permite afirmar que:A = abcou seja, ao atravessar uma solução transparente, a fração de luz absorvida A é proporcional auma constante a (absortividade molar), à distância b atravessada pela luz na solução e àconcentração molar c. Modificando-se convenientemente a constante, a absorbância A podeser relacionada com a concentração em g/l.A equação derivada da lei de Lambert e Beer indica que a projeção de A versus c,mantida constante a distância b atravessada pela luz na solução, é uma reta que passa pelaorigem.Dispondo-se de tal projeção é possível, a partir de valores de A, determinargraficamente as concentrações correspondentes. Neste procedimento o gráfico A versus c échamado curva padrão.O Método do Biureto faz uso da propriedade de íons de Cu 2+ em meio alcalino deformar ligações com o nitrogênio das ligações peptídicas. Desta reação (reação de biureto)resulta uma coloração púrpura intensa. Este fato pode ser explorado para se determinarcolorimetricamente a quantidade de proteínas em solução.O Método do Biureto é mais apropriado para proteínas cujas soluções são incolores,ou seja para proteínas não conjugadas (simples). A cor desenvolvida numa reação de íons deCu 2+ em meio alcalino com estas proteínas deve-se unicamente às ligações peptídicas e a suaintensidade é proporcional a quantidade de tais ligações. Deve-se lembrar que a quantidadede ligações peptídicas é proporcional à massa da proteína em solução.Reforçando o que foi dito acima, pode-se afirmar que esta reação, específica paranitrogênios peptídicos, ocorre em igual extensão para uma dada massa proteica qualquer queseja a natureza da proteína em solução.PROCEDIMENTO(1) EletroforeseRetirar uma fita de acetato de celulose do banho de tampão (barbital-Tris pH 8,6).(Atenção: Não manusear a fita, usar pinça). Secá-la entre duas folhas de papel de filtro.Marcar com lápis o polo positivo e a partir dos pontos médios dos lados maiores demarcar aorigem com um traço muito leve. (Unir os pontos médios dos lados maiores).Retornar a fita para o banho. Mergulhar, retirar e secá-la novamente.

Em seguida aplicar num ponto da origem uma pequena quantidade de mistura decitocromo c e albumina bovina. Sobre um outro ponto da origem, aplicar a amostra de sorohumano. CUIDADO: as amostras de soro humano não estão testadas em relação a presençade microorganismos patogênicos. USAR LUVA DE POLIETILENO PARA APLICAR ASAMOSTRAS.Montar as fitas no suporte da cuba de eletroforese com todos os polos positivos domesmo lado. Fechar a cuba de correr a eletroforese com 5mA/fita durante 60 minutos.Desligar a corrente, mergulhar as fitas no corante Ponceau por 10 minutos e descorarcom ácido acético 5%.Cuidados especiais- Não tocar as fitas com a fonte da corrente contínua ligada.- Prestar atenção para o fato de que uma das faces da fita de acetato de celuloseapresenta-se mais brilhante. Esta face, correspondente as costas da fita, contém uma películade plástico não absorvente sobre o qual assenta-se a verdadeira matriz que suporta o tampãoe as amostras, o acetato de celulose. As amostras devem ser aplicadas na parte opaca (face deacetato de celulose).- Antes de levar a fita com as aplicações à cuba, fazer uma pequena marca que aidentifique como pertencente a um determinado grupo.A mistura de proteínas contém:pIP.M.Albumina de soro bovino 4,7 66.500Citocromo c 10,7 13.000Com base a estes dados prever a posição de cada uma dessas proteínas na fita ao finalda operação. Justificar.Examinar o eletroforetograma das proteínas do soro humano. Compará-lo com oresultado final da eletroforese de soro apresentado na literatura (p. ex. “Biochemistry: Acase-oriented approach”, The C.V.Mosby Company, 5 a ed., autores: Montgomery, Conway, eSpector, pág. 67).3. DOSAGEM DE PROTEÍNA PELO MÉTODO DO BIURETOElaborar um protocolo para construir uma curva padrão, para a qual se utilizará umasolução estoque de Albumina de concentração conhecida (8mg/ml) e 2,5 ml de Reagente deBiureto, num volume final de 4,0ml por tubo.Após a adição do reagente, agitar e incubar os tubos por 15 minutos a 37 o C. Ler asabsorbâncias a 550 nm.Construir um tubo a partir de 1,0ml de Albumina de concentração desconhecida,adicionar Biureto, completar o volume final a 4,0ml, medir a Absorbância e determinar aconcentração desconhecida.Agradecimento: As amostras de soro humano foram cedidas pelo Laboratório deAnálises Clínicas da FCFUSP. Agradecemos aos responsáveis por este Laboratório e emespecial à Profa.Dra. Ana Campa.BIBLIOGRAFIA

01. Biochemistry: A Case-Oriented Approach, Montgomery, Conway e Spector, 5 a ed., 1990.The C.V. Mosby Company (Ver pág. 65).02. Biochemistry for Medical Sciences, Danishlfsky, 1980. Little, Brown and Company (Verpágs. 34, 40 e 469).03. Experimental Biochemistry, Clark e Switzer, 2 a ed., 1977. W.H. Freeman and Company.04. Outlines of Biochemistry, Conn e Stumpf, 4 a ed., 1976. John Wiley & Sons, Inc. (Verúltimas págs. do livro, págs. 587 a 609 - Apêndice 2).

QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO IIICINÉTICA ENZIMÁTICAOBJETIVOEstudar as influências das concentrações de enzima e de substrato na velocidade deuma reação enzimática, examinar as curvas obtidas, obter alguns parâmetros cinéticos (K m eV max ) e discutir seus valores e importância.INFORMAÇÕES GERAISA enzima escolhida para este estudo é a invertase de levedura que catalisa a hidróliseda sacarose para produzir glicose e frutose.C 12 H 22 O 11 + H 2 O → C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6sacarose glicose frutoseA determinação da velocidade da reação (ou da atividade enzimática) pode ser feitaatravés da dosagem dos açúcares redutores formados (glicose e frutose). A dosagem baseiasena reação entre o ácido 3,5 dinitro-salicílico (DNS) e os açúcares redutores. Estesmonossacarídeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor característica, cujaformação pode ser acompanhada a 540 nm.Nestas experiências as velocidades da reação serão expressas em µmoles de sacarosehidrolisada por minuto.Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µmoles) de açúcares redutoresformada, por um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidadecorrespondente (µmoles) de sacarose hidrolisada.Para estudos de velocidade, o tempo de reação deve ser medido com a maior exatidãopossível. Para isso, o grupo deverá organizar-se de maneira a não permitir que a reação seinicie em tempos diferentes nos vários tubos. Para tal, é importante manter os tubos em gelodurante a adição dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nosprotocolos, com a enzima sendo adicionada por último. Leva-se então os tubos, todos juntos,ao banho a 37 o C para reagir. Transcorrido o tempo determinado , os tubos devem voltartodos juntos, simultaneamente, para o gelo. Aí a reação pára.PROCEDIMENTO1) Curva PadrãoAtenção: A curva padrão será fornecida na forma de um xerox do gráfico A 540 versusµmoles de sacarose hidrolisada.A finalidade da curva padrão é relacionar valores de absorbância a 540 nm comµmoles de sacarose hidrolisada.Para construir a curva padrão utiliza-se seis tubos (180 x 20 mm), conforme indicadoabaixo, contendo volumes crescentes de solução padrão redutora (glicose 5,5 mM maisfrutose 5,5 mM), completando o volume em cada tubo para 2,0 ml com tampão. Como nãoocorrerá hidrólise de sacarose nos tubos de 1 a 5, pode-se acrescentar logo em seguida aotampão, o reagente DNS.

TubosSol. padrãoredutora(ml)Sol. tampãopH 4,77(ml)ReagenteDNS (ml)A 540B - 2,0 2,0 0,000 0,001 0,2 1,8 2,02 0,4 1,6 2,03 0,6 1,4 2,04 0,8 1,2 2,05 1,0 1,0 2,0Sacarose hidrolisada(µmoles)Após a adição do DNS, colocar os tubos em banho-maria fervente por dez minutos.Findo este tempo, esfriar em água corrente e adicionar 16 ml de água destilada.HOMOGENEIZAR e ler as absorbâncias a 540 nm (A 540 ) contra o branco (tubo B).Construir um gráfico A 540 versus µmoles de sacarose hidrolisada (curva padrão).2) Efeito da CONCENTRAÇÃO DA ENZIMANumerar sete tubos de ensaio (180 x 20 mm) e adicionar os reagentes segundo oprotocolo abaixo:TubosSacarose5% emtampãoTampãopH 4,77(ml)TUBOS NO GELOSol.Enzima(ml)Conc. deEnzimaMicromolarA 540Sacarosehidrolisada pormin(µmoles/min)B 1,0 1,0 - 0,00 0,000 0,001 1,0 0,9 0,12 1,0 0,7 0,33 1,0 0,5 0,54 1,0 0,3 0,75 1,0 0,1 0,96 1,0 - 1,0Após a adição da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos de uma temperatura de0 o C e colocá-los simultaneamente em banho-maria a 37 o C. MARCAR o tempo inicial.Incubar a 37 o C por 5 minutos. Transcorrido este tempo, os tubos devem voltarimediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reação pára. Ainda no gelo,adicionar a cada tubo 2 ml de DNS. Na presença de DNS, devido à alcalinidade do reagente,a enzima em pH muito alto, pára de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria ferventee esperar 10 minutos. Findo este tempo, esfriar em água corrente e adicionar 16 ml de águadestilada em cada tubo. AGITAR com inversão da posição na vertical (3 vezes). Ler asabsorbâncias a 540 nm.Fazer um gráfico colocando a concentração da enzima microM nas abcissas e nasordenadas a velocidade de hidrólise expressa em µmoles de sacarose hidrolisada por minuto.Durante a aula de laboratório será fornecido valor da concentração da enzima(microM) na solução estoque.3) Efeito da CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATONumerar sete tubos de ensaio (180 x 20 mm) e adicionar os reagentes segundo oprotocolo a seguir:

TubosSacarose5% emtampãoTampãopH 4,77(ml)TUBOS NO GELOSol.Enzima(ml)Conc. deSubstratoMilimolarA 540Sacarosehidrolisada pormin(µmoles/min)B - 1,5 0.5 0,00 0,000 0,001 0,05 1,45 0,52 0,1 1,40 0,53 0,3 1,20 0,54 0,5 1,0 0,55 0,7 0,8 0,56 1,0 0,5 0,5Proceder EXATAMENTE como no caso do estudo do efeito da concentração daenzima (ítem anterior).Fazer um gráfico da velocidade (µmoles de sacarose hidrolisada/min.) versusconcentração inicial do substrato (mM de sacarose). Estimar os valores de V max e K m .Fazer o gráfico de Lineweaver e Burk e calcular os valores de V max e K m .Comparar o valor de K m com o encontrado na literatura.1). Discutir curvas obtidas para:ANÁLISE DOS RESULTADOS E DISCUSSÃOa) efeito da concentração da enzimab) efeito da concentração de substrato2). Elaborar um protocolo para estudar o efeito do pH sobre a atividade enzimática.Consultar na biblioteca:1. The enzymes, Boyer (editor) (1971) vol. 5, cap. 102. Técnicas e Experimentos de Bioquímica, Villela, Bacila e Tastaldi, (1973) cap. 4, pags222 a 232.3. Asare-Brown, E. and Bullock, C., Simple Practical Investigations Using Invertase,Biochem.Educ. (1988), 16, 98-100.

QBQ 211 - 1996 - LABORATÓRIO IVLIPOSSOMOS e LIPOPEROXIDAÇÃO EM UM MODELO DEMEMBRANAOBJETIVOS1. Ilustrar o uso de lipossomos como modelo de membrana.2. Incorporar um marcador colorido (azul de metileno, AM) em lipossomos de asolecitina eseparar AM incorporado de AM extralipossomal por diálise.3. Observar um dos efeitos deletéricos da lipoperoxidação em membranas.FUNDAMENTOSLipossomosMembranas biológicas cumprem inúmeras funções: organizam moléculas emdiferentes compartimentos, limitam microambientes adequados para funções vitais econtrolam o transporte de várias substâncias. Visando uma simplificação estrutural e químicadas membranas naturais foram propostos diversos sistemas-modelo de membrana. Lipídeosextraídos de membranas podem ser utilizados para a preparação de diversos sistemasreconstituídos que permitem reproduzir, de forma selecionada e simplificada, alguns dosfenômenos que ocorrem em membranas naturais (1). Lipossomos são constituídos pormúltiplas bicamadas concêntricas de fosfolipídeos (2) e podem ser formados por simplesagitação de lipídeos em solução aquosa. Têm sido utilizados para se medir permeaçãopassiva de vários íons e moléculas (3). Como a maior parte do lipídeo está presente na formamultilamelar, o volume sequestrado por mol de lipídeo (eficiência de incorporação) érelativamente baixo em comparação com aquele de uma população constituída por vesículas.Neste experimento, vamos primeiramente incorporar o azul de metileno (AM) emlipossomos de asolecitina. Estimaremos a porcentagem de incorporação usando apropriedade do azul de metileno de absorver luz visível (660nm). Para isso eliminaremos aturbidez das partículas lipossomais micelizando-as com um detergente. Numa segunda etapa,como a asolecitina extraída de soja é especialmente rica em lipídeos com cadeias insaturadas(4), os lipossomos de asolecitina serão utilizados para se observar um dos efeitos deletériosda lipoperoxidação, o aumento de permeação do AM.LipoperoxidaçãoVárias evidências recentes sugerem que radicais livres (e/ou espécies ativas deoxigênio) têm um importante papel em vários processos fisiológicos e patológicos (5,6).Dentre esses pode-se citar a atividade microbicida das células do sistema imune, oenvelhecimento, a carcinogênese, a artrite reumatóide, as injúrias decorrentes de processosde isquemia e reperfusão, a catarata, os efeitos terapêuticos e colaterais de drogas, etc (6).Alguns dos efeitos deletérios de radicais livres parecem envolver lipoperoxidação dasmembranas biológicas. Essas são frequentemente ricas em lipídeos insaturados e estãobanhadas por fluídos que contêm metais de transição e oxigênio. Tais condições favorecem aperoxidação de lipídeos porque os íons metálicos ajudam a quebrar a regra da conservaçãodo spin que torna lenta as reações entre o oxigênio e moléculas orgânicas. A peroxidação delipídeos é um processo radicalar constituído por uma cadeia de reações com três estágios:Iniciação, Propagação e Terminação.Iniciação LH → L • + H • (1)

Propagação L • + O 2 → LOO • (2)LOO • + LH → LOOH + L • (3)Terminação LOO • + L • → LOOL (4)LOO • + LOO • → LOOL + O 2 , etc (5)A iniciação da lipoperoxidação pode ser promovida por enzimas ou agentesquímicos. Dentre esses, estão os agentes redutores como a vitamina C (ácido ascórbico) empresença de metais de transição, como Fe(III). O mecanismo pelo qual ascorbato e Fe(III)complexado iniciam a peroxidação não está completamente elucidado mas parece envolver aformação do radical hidroxila, uma espécie extremamente reativa (6). Obviamente, processosenzimáticos que geram o radical hidroxila também podem iniciar a lipoperoxidação. Oradical hidroxila, ou outros radicais livres, podem abstrair um átomo de hidrogênio da cadeiade ácido graxo, iniciando a cadeia de reações (eq 1-5) que resulta em consumo de oxigênio,rearranjo das duplas nos lipídeos insaturados e, eventualmente, destruição dos lipídeos comprodução de uma série de produtos menores tais como aldeídos, álcoois e hidrocarbonetos(Esquema 1). O malondialdeído, apesar de corresponder a apenas 5% do total de produtosdos lipídeos, tem sido um importante indicador de lipoperoxidação em membranasbiológicas porque forma um produto colorido com o ácido tiobarbitúrico (TBA) queabsorve intensamente a 535nm (ε = 1.56 x 10 5 M -1 cm -1 ) (Esquema 1).Esquema 1: Representação esquemática da lipoperoxidação e de métodos analíticosutilizados para detectá-la.

PROCEDIMENTO (7)1) Determinação da porcentagem de incorporação.Lipossomos 10mM serão obtidos por vortexação de asolecitina (L-α-fosfatidilcolinade soja tipo IV - S, Sigma Chemical Company, grau comercial) em solução 0.2mM de azulde metileno (AM).Quatro alíquotas de lipossomos com azul de metileno (LAM) de 1.0 ml cada serãosubmetidas a um processo de diálise em tubos de celofane contra água (2 l) sob agitaçãoconstante com barra magnética (0.5h). Como controle, simultaneamente será dialisada umasolução de azul de metileno 0.2mM (AM) (1.0 ml). Após a diálise, uma das quatro tripascontendo lipossomos (LAM) será rompida para determinação da porcentagem daincorporação, que é dada por:A2A2c% incorporação = 100. - , onde,A1A1cA 1 e A 2 são as absorbâncias a 660nm de uma alíquota de 0.2ml de LAM adicionada a 2mlde água e 1 ml de TRITON X-100 (1%) antes e depois da diálise, respectivamente.A 1c e A 2c são as absorbâncias a 660nm de uma alíquota de 0.2ml da solução de azul demetileno 0.2mM (AM) adicionada a 2ml de água e 1ml de TRITON X-100 (1%) antes edepois da diálise, respectivamente.Os dados a serem obtidos estão sumarizados na Tabela I.TABELA IDiálise e determinação da porcentagem de incorporação de AM em lipossomosde asolecitinaAMOSTRAS* ABSORBÂNCIA 660nm % DE INCORPO-RAÇÃOANTES DADIÁLISEAPÓS ADIÁLISELAM A 1 = A 2 =AM A 1c = A 2c =*Note bem que as leituras de absorbâncias a 660nm são feitas em 0.2ml de amostra, 2ml deágua e 1ml de TRITON X-100.Como branco pode-se usar 3ml de água destilada2) Determinação da permeação de AM induzida pela lipoperoxidaçãoPara induzir a lipoperoxidação, utilizaremos o sistema ácido ascórbico/Fe 3+ /EDTA.Em um tubo CONTROLE I (CI) adicionaremos uma das três tripas dialisadas contendolipossomos (LAM) e 9.0ml de água. Em outro tubo CONTROLE II (CII) adicionaremosoutra das três tripas, 7.0ml de água e 2.0ml de ácido ascórbico (AA) 10mM. No terceiro tuboTESTE (T), coloca-se a terceira tripa, 5.0ml de água, 2.0ml de AA 10mM e 2.0ml deFe 3+ /EDTA 1mM. Os três tubos serão então incubados durante 0.5h a 40 o C sob agitação.Após esse período de incubação, será feita a leitura de absorbância a 660nm de alíquotas de3ml de cada uma das soluções externas às tripas em CI, CII e T. As leituras de absorbância a660nm devem preencher a Tabela II. Uma vez feitas as leituras, as alíquotas da soluçãoexterna devem ser devolvidas aos respectivos tubos de origem e as tripas arrebentadas. Oconteúdo interno das tripas é recolhido junto com a solução externa.

Para determinar a extensão de lipoperoxidação, alíquotas de 1ml de CI, CII e Tserão adicionadas a 2ml do reagente TBA. Como BRANCO , será usado 1ml de águaadicionados a 2ml de TBA. As quatro amostras assim obtidas serão incubadas a 100 o Cdurante 15min. Após esfriar, serão lidas as absorbâncias a 535nm. Essas leituras permitempreencher a Tabela III.TABELA IIPermeação do azul de metileno induzida pela lipoperoxidaçãoSOLUÇÕES EXTERNASÀS TRIPAS APÓS INCUBAÇÃO A 660CONTROLE I (CI)(água + LAM)CONTROLE II (CII)(água + ác. ascórbico + LAM)TESTE (T)(água + ác. ascórbico + Fe 3+ /EDTA + LAM)TABELA IIILipoperoxidação em lipossomos de asolecitina induzida pelo sistema ácidoascórbico/Fe 3+ /EDTA.AMOSTRAVOLUME DAAMOSTRA(ml)TBA*(ml)água (BRANCO) 1 29.0 ml água + tripa c/ 1.0ml de 1 2LAM (CONTROLE I) (CI)7.0 ml água + tripa c/ 1.0ml de 1 2LAM + 2.0ml de AA 10mM(CONTROLE II) (CII)5.0 ml água + tripa c/ 1.0ml de 1 2LAM + 2.0ml de AA 10mM +2.0 ml de Fe 3+ /EDTA 1mM(TESTE) (T)A 535LIPOPEROXIDAÇÃO(%)*TBA é uma solução contendo 1% do agente micelizante TRITON X-100, HCl 0.25M e0.375% de ácido tiobarbitúrico.ANÁLISE DOS RESULTADOS E DISCUSSÃO01. Calcule a porcentagem de incorporação do AM em lipossomos de asolecitina. Use aexpressão fornecida.02. O que se pode dizer da permeabilidade dos lipossomos de asolecitina ao azul de metilenocom os seus dados de diálise?03. Calcule a porcentagem de lipoperoxidação de seus lipossomos nas diferentes condiçõesexperimentais (CI, CII e T) às quais foram submetidos. Considere que o malondialdeidocorresponde a apenas 5% da lipoperoxidação total.04. Discuta o efeito da lipoperoxidação sobre a permeação do azul de metileno através dasmembranas lipossomais.

BIBLIOGRAFIA01. Gomperts, D.D. (1977) - "The Plasma Membrane: Models for Structure and Function",Academic Press (London).02. Bangham, A.D.; Standish, M.M. e Watkins, J.C. (1965) - J. Mol. Biol. 13, 238.03. Bangham, A.D.; de Gier, J. e Greville, G.D. (1967) - Chem. Phys. Lipids 1, 225.04. Kagawa, Y. e Racker, E. (1966) - J. Biol. Chem. 241, 2467.05. Meneghini, R. (1987) - A toxicidade do oxigênio, Ciência Hoje, 5, 57.06. Halliwell, B. e Gutteridge, J.M.C. (1985) - Free Radicals in Biology & Medicine,Claredon Press, Oxford.07. Augusto, O. e Carmona-Ribeiro, A.M. (1989) - Introducing Model Membranes andLipoperoxidation, Biochemical Education 17(4), 209.

QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO VI - FRACIOAMENTO CELULAR E VERIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DASUCCINATO DESIDROGENASE.Fracionamento celular - Sacrificar um rato por concussão cerebral. Remover ofígado, mergulhá-lo em 20 ml de uma solução de sacarose 0,25 M, previamente resfriada a0 o C e picá-lo bem com tesoura. Decantar a sacarose adicionar outros 20 ml e tornardecantar. Adicionar 20 ml sacarose 0,25 M, também gelada. Homogeneizar o fígado ecentrifugar a 800 x g (4.000 rpm) por 10 minutos.Decantar o sobrenadante e centrifugá-lo a 10.000 x g (10.000 rpm) por 30 minutos.Decantar este precipitado. Recolher o sobrenadante em tubo de ensaio e conservá-lo no gelo.Esta será a fração celular I.VERIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DA SUCCINATO DESIDROGENASEO azul de metileno pode apresentar-se na forma oxidada (azul) ou reduzida (incolor).A redução do azul de metileno pode ser obtida a partir da oxidação do succinato, catalisadapela succinato desidrogenase. Seguir o protocolo 1. Para verificar a oxidação do succinato,as frações devem ser incubadas a 37 o C, por 10 minutos.Antes de iniciar a experiência, o grupo deve:1. escrever a reação que está sendo analisada;2. discutir as funções de succinato, sacarose, azul de metileno e óleo mineral;3. planejar o controle da experiência.II - INIBIÇÃO DA SUCCINATO DESIDROGENASE POR MALONATOSabendo em que fração celular se encontra a atividade da succinato desidrogenase,observe a inibição competititva da enzima por malonato, um processo historicamenteimportante na elucidação das etapas de ciclo de Krebs. Você utilizará a redução do MTT viasuccinato desidrogenase: o MTT é amarelo quando oxidado e violeta quando reduzido, nãosendo reoxidado pelo O 2 do ar. Seguir o protocolo 2.Deixe os tubos 10 minutos à temperatura ambiente e compare suas cores. Se a reaçãoestiver lenta (isto dependerá da sua preparação mitocondrial), aqueça os tubos a 37 o C por5 minutos e os compare novamente. NÃO ESQUEÇA, a inibição é competitiva, existe ofator cinético e você deverá fazer as comparações ATENTAMENTE A CURTOSINTERVALOS DE TEMPO.III - DETERMINAÇÃO DO PONTO DE AÇÃO DE DROGAS NA CADEIA DETRANSPORTE DE ELÉTRONS.Esta determinação deve ser feita com o uso de aceptores e doadores artificiais deelétrons: a escolha dos aceptores e doadores artificiais de elétrons deve ser feita consultandoas tabelas que se seguem.Os aceptores e doadores são fornecidos na forma oxidada, com exceção do reagentep-fenilenodiamina.

PAR REDOXE o'NADH / NAD + -0,32Succinato / Fumarato -0,03FADH 2 / FAD 0,00Azul de Metileno red/ox 0,01Cit b (Fe 2+ ) / Cit B (Fe 3+ ) 0,06Cit c 1 (Fe 2+ ) / Cit c 1 (Fe 3+ ) 0,22Cit c (Fe 2+ ) / Cit c (Fe 3+ ) 0,25Cit a-a 3 (Fe 2+ ) / Cit a-a 3 (Fe 3+ ) 0,40H 2 O / 1/2 O 2 0,82ACEPTORES E DOADORES ARTIFICIAIS E o'Piocianina red/ox -0,342,6-diclorofenolindofeno (DCPI) red/ox 0,20Benzil Viológeno red/ox -0,36Ferricianeto Fe(CN) 64- /Fe (CN)6 3- 0,36p. fenilenodiamino (p-FDA) red/ox 0,27COR DOS ACEPTORES E DOADORES ARTIFICIAIS NAS FORMASREDUZIDA E OXIDADA.REDUZIDO OXIDADO VOLUMEUTILIZADOPiocianina incolor azul 0,12,6-diclorofenolindolenolincolor azul 0,3(DCPI)Benzil violágeno incolor violeta 0,3Ferricianeto incolor amarelo 0,2p-fenilenodiamino (p-FDA) incolor violeta 0,5Seguir o protocolo 3Incubar os tubos a 37 o C por 10 minutos e discutir o resultado com os colegas, identificandoa droga A e B.PROTOCOLO 1TUBO 1 2 3 4 5Tampão A 0,3 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,3 mlSacarose 0, 7 M 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 mlSuccinato 0,5 M - - 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlAzul de Metileno 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 mlÁgua Destilada 1,5 ml 1,5 ml 1,3 ml 1,3 ml 1,4 mlFração Celular 0,1 (I) 0,1 (II) 0,1 (I) 0,1 (II) -Nujol 0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm

QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO VITRANSAMINAÇÃOOBJETIVO: Verificar a reação de transaminação em homogenato de fígado.INTRODUÇÃOA transaminação consiste na transferência reversível do grupo amino de umaminoácido a um cetoácido sem que o grupo -NH 2 ou -NH+ 3 fique livre no meio aquoso. Oaminoácido perde o grupo amino e se converte no cetoácido correspondente e o cetoácidoque ganha o grupo amino se converte no aminoácido respectivo.As transaminases se econtram na maioria dos tecidos animais. Todos os aminoácidosque fazem parte das proteínas participam em transaminações enzimáticas, com exceção dalisinaNesta experiência se identificarão os produtos de uma reação de transaminação pormeio de cromatografia em papel.MÉTODOUma alíquota de um homogenato de fígado será incubada com um aminoácido e umcetoácido. A identificação dos produtos da reação será feita por cromatografia em papel.PREPARAÇÃO DO HOMOGENATO DE FÍGADO DE RATOO Fígado de um rato é picado e lavado 2 vezes com 20 ml de tampão fosfato 0,05 M,pH 7,4 e em seguida é homogeneizado com 10 ml deste tampão fosfato. Este homogenato écentrifugado a 800 x g por 15 minutos para eliminar células não destruídas e núcleos. Osobrenadante é decantado em um tubo de ensaio mantido em gelo e esta fração consiste napreparação enzimática. Notar que não é necessária a enzima pura para que esta catalise areação.REAÇÃO DE TRANSAMINAÇÃOO sistema completo de reação é composto por um aminoácido, um cetoácido, apreparação enzimática, arsenito de sódio (NaAsO 2 ) e um tampão. O arsenito é empregadocom a finalidade de evitar a oxidação posterior dos cetoácidos pelo sistema enzimáticopresente no hepatócito.MISTURA DE REAÇÃOα-cetoglutarato 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 mlAlanina 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 mlPrep. enzimática - 0,2 mlTampão fosfato 0,05 M, pH 7,4 - 0,2 mlArsenito de Sódio 0,2 M - 0,2 mlIncubar a 37 o C por 30 minutos. Em seguida colocar em banho-maria fervente por 3minutos. Centrifugar por 10 minutos em centrífuga Eppendorf. Decantar o sobrenadantetransferindo para um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padrõesadequados.

CROMATOGRAFIAEm um papel de filtro Whatman n o 1 (10x20 cm) traçar com lápis uma linha a 2,5 cmda origem e marcar pontos com 2,5 cm de distância entre si. Colocar padrões de alanina,glutamato, piruvato e α-cetoglutarato, mistura de reação, branco * e 2,4-dinitrofenilhidrazina.Sobre os pontos onde foram aplicados o α-cetoglutarato, piruvato e mistura de reação,adicionar uma aplicação capilar de 2,4-dinitrofenilhidrazina.O solvente utilizado para a cromatografia será n-Butanol/Etanol/NH 4 OH (0,5N).(70:20:30).Após o solvente chega a 1 cm do final do papel, marcar a frente do solvente, secar opapel, marcar as manchas amarelas dos produtos de reação da 2,4-dinitrofenilhidrazina e osα-cetoácidos, e revelar o cromatograma com ninhidrina.* branco: mistura de apenas alanina e α-cetoglutarato.