apostila de exercícios

QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO VI - FRACIOAMENTO CELULAR E VERIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DASUCCINATO DESIDROGENASE.Fracionamento celular - Sacrificar um rato por concussão cerebral. Remover ofígado, mergulhá-lo em 20 ml de uma solução de sacarose 0,25 M, previamente resfriada a0 o C e picá-lo bem com tesoura. Decantar a sacarose adicionar outros 20 ml e tornardecantar. Adicionar 20 ml sacarose 0,25 M, também gelada. Homogeneizar o fígado ecentrifugar a 800 x g (4.000 rpm) por 10 minutos.Decantar o sobrenadante e centrifugá-lo a 10.000 x g (10.000 rpm) por 30 minutos.Decantar este precipitado. Recolher o sobrenadante em tubo de ensaio e conservá-lo no gelo.Esta será a fração celular I.VERIFICAÇÃO DA ATIVIDADE DA SUCCINATO DESIDROGENASEO azul de metileno pode apresentar-se na forma oxidada (azul) ou reduzida (incolor).A redução do azul de metileno pode ser obtida a partir da oxidação do succinato, catalisadapela succinato desidrogenase. Seguir o protocolo 1. Para verificar a oxidação do succinato,as frações devem ser incubadas a 37 o C, por 10 minutos.Antes de iniciar a experiência, o grupo deve:1. escrever a reação que está sendo analisada;2. discutir as funções de succinato, sacarose, azul de metileno e óleo mineral;3. planejar o controle da experiência.II - INIBIÇÃO DA SUCCINATO DESIDROGENASE POR MALONATOSabendo em que fração celular se encontra a atividade da succinato desidrogenase,observe a inibição competititva da enzima por malonato, um processo historicamenteimportante na elucidação das etapas de ciclo de Krebs. Você utilizará a redução do MTT viasuccinato desidrogenase: o MTT é amarelo quando oxidado e violeta quando reduzido, nãosendo reoxidado pelo O 2 do ar. Seguir o protocolo 2.Deixe os tubos 10 minutos à temperatura ambiente e compare suas cores. Se a reaçãoestiver lenta (isto dependerá da sua preparação mitocondrial), aqueça os tubos a 37 o C por5 minutos e os compare novamente. NÃO ESQUEÇA, a inibição é competitiva, existe ofator cinético e você deverá fazer as comparações ATENTAMENTE A CURTOSINTERVALOS DE TEMPO.III - DETERMINAÇÃO DO PONTO DE AÇÃO DE DROGAS NA CADEIA DETRANSPORTE DE ELÉTRONS.Esta determinação deve ser feita com o uso de aceptores e doadores artificiais deelétrons: a escolha dos aceptores e doadores artificiais de elétrons deve ser feita consultandoas tabelas que se seguem.Os aceptores e doadores são fornecidos na forma oxidada, com exceção do reagentep-fenilenodiamina.