本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

生 物 化 学 实 验 指 导( 补 充 讲 义 )南 方 医 科 大 学 生 物 化 学 与 分 子 生 物 学 实 验 教 学 中 心二 OO 九 年 十 一 月

目录实 验 三 血 清 ( 血 浆 ) 脂 蛋 白 的 测 定 ……………………………………………… 1实 验 四 蛋 白 质 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ……………………………………………… 4实 验 六 肝 糖 原 的 提 取 、 鉴 定 与 定 量 ( 操 作 考 核 )………………………………… 10实 验 七 质 粒 DNA 的 提 取 、 定 量 、 酶 切 与 PCR 鉴 定 ……………………………… 16实 验 九 总 RNA 的 提 取 、 定 量 与 RT-PCR………………………………………… 26实 验 十 生 物 化 学 自 主 设 计 性 实 验 …………………………………………………… 32

实 验 三血 清 ( 血 浆 ) 脂 蛋 白 的 测 定目 的 :掌 握 磷 钨 酸 镁 沉 淀 法 测 定 高 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 HDL-C 的 基 本 原 理 , 熟 悉 磷 钨 酸 镁 沉 淀法 测 定 HDL-C 的 手 工 法 操 作 过 程 。 了 解 磷 钨 酸 镁 沉 淀 法 测 定 HDL-C 对 判 断 高 脂 血 症 、 预 防 动脉 粥 样 硬 化 和 冠 心 病 的 重 要 生 理 意 义 。原 理 :在 脂 蛋 白 中 既 有 蛋 白 质 又 有 胆 固 醇 , 还 有 磷 脂 的 复 合 体 , 较 难 定 量 。 由 于 其 中 的 胆 固 醇含 量 较 为 稳 定 , 因 此 目 前 以 测 定 脂 蛋 白 中 胆 固 醇 总 量 的 方 法 作 为 脂 蛋 白 的 定 量 依 据 , 即 测 定HDL、LDL 或 VLDL 中 的 胆 固 醇 , 并 分 别 称 为 高 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 (HDL-C)、 低 密 度 脂 蛋 白 -胆 固 醇 (LDL-C) 或 极 低 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 (VLDL-C)。测 定 血 清 HDL-C 时 , 通 常 需 根 据 各 种 蛋 白 的 密 度 、 颗 粒 大 小 、 电 荷 等 , 采 用 超 速 离 心 法 、色 谱 法 、 电 泳 法 、 化 学 或 免 疫 沉 淀 法 将 HDL 与 其 他 脂 蛋 白 分 离 开 , 然 后 测 定 HDL 组 分 中 胆 固醇 的 含 量 。 美 国 疾 病 控 制 与 预 防 中 心 (CDC) 测 定 HDL-C 的 参 考 方 法 为 超 速 离 心 法 。 此 法 主要 用 于 靶 值 的 确 定 及 各 种 HDL-C 检 测 方 法 学 评 价 , 但 因 需 特 殊 仪 器 , 对 技 术 操 作 要 求 高 , 一般 实 验 室 难 以 开 展 。 色 谱 法 和 电 泳 法 因 仪 器 、 操 作 要 求 高 等 种 种 原 因 临 床 常 规 实 验 室 也 较 少应 用 , 多 用 于 脂 蛋 白 的 研 究 。临 床 实 验 测 定 HDL-C 的 方 法 大 致 分 为 以 下 三 类 。 第 一 类 为 化 学 沉 淀 法 。 常 用 的 沉 淀 剂 为聚 阴 离 子 / 多 阴 离 子 , 如 磷 钨 酸 (PTA)、 硫 酸 葡 聚 糖 (DS)、 肝 素 或 非 离 子 多 聚 体 如 聚 乙 二 醇(PEG) 与 某 些 两 价 阳 离 子 (Mg 2+ 、Ca 2+ 、Mn 2+ ) 联 合 使 用 。 最 早 为 美 国 国 立 卫 生 研 究 院 (NIH)所 采 用 的 肝 素 - 锰 沉 淀 法 (HM 法 ), 后 多 采 用 硫 酸 葡 聚 糖 - Mg 2+ (DS- Mg 2+ 法 )。 欧 洲 则 多 采 用磷 钨 酸 - 镁 沉 淀 法 (PTA- Mg 2+ 法 ) 和 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 (PEG 法 )。1995 年 中 华 医 学 会 检 验 分 会曾 在 国 内 推 荐 PTA- Mg 2+ 法 作 为 HDL-C 测 定 的 常 规 方 法 。 但 此 类 方 法 常 因 含 apoB 的 脂 蛋 白 组 分 ,沉 淀 不 完 全 而 导 致 结 果 假 性 偏 高 。 第 二 类 采 用 简 便 的 磁 珠 DS- Mg 2+ 法 , 省 去 了 离 心 步 骤 , 但需 要 特 殊 装 置 和 试 剂 而 不 适 于 推 广 应 用 。 第 三 类 为 匀 相 测 定 法 , 即 直 接 测 定 法 。 其 特 点 为 :标 本 用 量 少 , 不 需 沉 淀 处 理 , 可 用 于 自 动 生 化 分 析 仪 测 定 , 在 准 确 度 和 精 密 度 方 面 基 本 达 到美 国 国 家 胆 固 醇 教 育 计 划 (NCEP) 的 分 析 目 标 , 因 此 在 短 短 的 数 年 里 迅 速 为 临 床 实 验 室 采 用 。磷 钨 酸 - 镁 沉 淀 法 测 定 高 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 : 采 用 大 分 子 多 阴 离 子 化 合 物 ( 磷 钨 酸 盐 )与 两 价 阳 离 子 ( 镁 离 子 ) 作 学 沉 淀 剂 沉 淀 血 清 中 的 LDL、VLDL 和 Lp(a) 后 , 上 清 液 中 只 含 有HDL, 然 后 用 酶 法 测 定 其 中 的 胆 固 醇 含 量 , 即 血 清 中 胆 固 醇 酯 可 被 胆 固 醇 酯 酶 水 解 为 游 离 胆固 醇 和 游 离 脂 肪 酸 (FFA), 胆 固 醇 在 胆 固 醇 氧 化 酶 的 氧 化 作 用 下 生 成 △4- 胆 甾 烯 酮 和 过 氧 化氢 , 过 氧 化 氢 在 4- 氨 基 安 替 比 林 和 酚 存 在 时 , 经 过 氧 化 物 酶 催 化 , 反 应 生 成 苯 醌 亚 胺 的 红色 醌 类 化 合 物 , 其 颜 色 深 浅 与 标 本 中 胆 固 醇 含 量 成 正 比 。主 要 器 材 :1. 试 管2. 加 样 枪3. 水 浴 箱1

4. V-1100 分 光 光 度 计5. 离 心 机主 要 试 剂 :1. 沉 淀 剂磷 钨 酸100mmol/L氯 化 镁5mmol/L2. 酶 试 剂 ( 试 剂 R)GOOD'S 缓 冲 液 (pH6.7) 50mmol/L苯 酚5mmol/L4- 氨 基 安 替 比 林 0.3mmol/L胆 固 醇 酯 酶>200U/L胆 固 醇 氧 化 酶>100U/L过 氧 化 物 酶>3KU/L3. 胆 固 醇 标 准 液 (1.81mmol/L/70.00mg/dl)实 验 方 法 :1.HDL-C 分 离取 血 清 和 沉 淀 剂 各 200ul, 充 分 混 匀 , 置 室 温 放 置 10min 后 ,3000r/min, 离 心 15min,吸 取 上 清 液 按 下 表 操 作 。 如 果 上 清 液 混 浊 , 则 需 再 以 转 速 10000r/min, 离 心 15min。2.HDL-C 测 定加 入 物 (ul) 空 白 管 标 准 管 测 定 管上 清 液 — — 40标 准 液 — 40 —蒸 馏 水 40 — —酶 试 剂 2000 2000 2000各 管 混 匀 后 ,37℃ 水 浴 10min, 于 波 长 500nm 处 以 空 白 管 调 零 , 测 定 各 管 吸 光 度 。计 算 :HDL-C(mmol/L)= 测 定 管 吸 光 度 / 标 准 管 吸 光 度 × 胆 固 醇 标 准 液 浓 度 ×2参 考 范 围血 清 HDL-C:0.9~2.0mmol/L临 床 意 义 :HDL 是 一 种 抗 动 脉 粥 样 硬 化 的 脂 蛋 白 , 是 冠 心 病 的 保 护 因 素 , 冠 心 病 的 发 病 率 与 血 清 HDL水 平 呈 负 相 关 ,HDL-C 低 于 0.9mmol/L 是 冠 心 病 的 危 险 因 素 , 其 增 高 被 认 为 是 冠 心 病 的 “ 负 ”危 险 因 素 。HDL-C 下 降 多 见 于 脑 血 管 病 、 糖 尿 病 、 肝 炎 、 肝 硬 化 等 。高 TG( 总 胆 固 醇 ) 血 症 常 伴 有 低 HDL-C; 肥 胖 者 、 吸 烟 者 的 HDL-C 也 常 偏 低 , 但 饮 酒 和长 期 体 力 活 动 会 使 之 升 高 。2

注 意 事 项 :1. 血 清 在 室 温 条 件 下 , 各 类 型 脂 蛋 白 之 间 还 会 发 生 脂 质 交 换 , 游 离 的 胆 固 醇 也 会 不 断 酯化 , 所 以 要 及 时 测 定 , 否 则 应 该 冰 冻 保 存 , 但 是 只 能 冰 冻 一 次 , 解 冻 后 应 立 即 测 定 。2. 离 心 过 程 中 应 该 防 止 温 度 升 高 使 沉 淀 不 完 全 , 室 温 应 为 15~25℃ 之 间 , 且 离 心 后 立即 吸 取 上 清 液 进 行 测 定 , 否 则 结 果 偏 高 。3. 血 清 严 重 混 浊 时 , 可 以 将 血 清 以 生 理 盐 水 1:1 稀 释 后 再 沉 淀 , 测 定 值 乘 以 稀 释 倍 数即 为 实 际 值 。思 考 题 :1. 临 床 实 验 室 测 定 HDL-C 的 方 法 有 哪 些 ?2. 温 度 和 pH 值 是 如 何 影 响 磷 钨 酸 - 镁 沉 淀 法 测 定 HDL-C?3. 简 述 检 测 HDL-C 的 临 床 意 义 。3

实 验 四蛋 白 质 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳目 的 :掌 握 SDS-PAGE 的 基 本 原 理 , 学 会 使 用 该 方 法 来 分 析 所 表 达 的 蛋 白 质 , 蛋 白 质 大 小 、 形状 和 所 带 电 荷 不 同 , 在 SDS-PAGE 中 的 迁 移 率 就 不 同 , 因 此 可 采 用 该 方 法 来 推 算 所 表 达 的蛋 白 质 的 分 子 量 。原 理 :聚 丙 烯 酰 胺 , 即 丙 烯 酰 胺 和 少 量 交 联 剂 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 , 在 催 化 剂 过 硫 酸 铵 作 用 下 聚 合形 成 凝 胶 。 反 应 液 中 还 加 有 四 甲 基 乙 二 胺 用 来 引 发 和 控 制 聚 合 反 应 。 反 应 液 顶 覆 盖 一 层 水 层 ,保 证 凝 胶 表 面 平 坦 , 同 时 起 到 隔 离 大 气 中 氧 气 的 作 用 , 因 为 氧 气 可 抑 制 聚 合 反 应 。在 蛋 白 质 溶 液 中 加 入 SDS, 这 种 阴 离 子 去 污 剂 能 够 与 蛋 白 质 相 结 合 , 破 坏 蛋 白 质 内 部 、分 子 之 间 以 及 其 他 物 质 的 非 共 价 键 , 使 蛋 白 质 变 性 而 破 坏 原 有 的 空 间 构 象 。 按 照 1.4gSDS/1g蛋 白 质 结 合 , 形 成 SDS- 蛋 白 质 复 合 物 。 由 于 SDS 带 负 电 , 使 各 种 蛋 白 质 的 SDS- 多 肽 复 合物 都 带 上 相 同 密 度 的 负 电 荷 , 它 的 量 大 大 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 的 电 荷 量 , 因 而 掩 盖 了 不 同种 类 的 蛋 白 质 原 有 的 电 荷 差 别 ; 同 时 , 不 同 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 形 状 也 相 似 , 都 呈 长 椭 圆形 。 因 此 , 在 自 由 电 泳 时 , 它 们 的 泳 动 率 基 本 相 同 , 而 在 某 一 适 宜 浓 度 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电泳 介 质 中 电 泳 时 , 由 于 凝 胶 的 分 子 筛 作 用 , 电 泳 迁 移 率 就 取 决 于 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 的 大 小 ,也 可 以 说 是 取 决 于 蛋 白 质 分 子 量 的 大 小 。SDS—PAGE 可 分 为 圆 盘 状 和 垂 直 板 状 、 连 续 系 统 和 不 连 续 系 统 。 本 实 验 采 用 垂 直 板 状不 连 续 系 统 。 所 谓 “ 不 连 续 ” 是 指 电 泳 体 系 由 两 种 或 两 种 以 上 的 缓 冲 液 、pH 和 凝 胶 孔 径 等 所组 成 。1. 样 品 的 浓 缩 效 应在 不 连 续 电 泳 系 统 中 , 含 有 上 、 下 槽 缓 冲 液 (Tris—Gly,pH8.3)、 浓 缩 胶 缓 冲 液 (Tris—HCl,pH6.8)、 分 离 胶 缓 冲 液 (Tris—HCl,pH8.8), 两 种 凝 胶 的 浓 度 ( 即 孔 径 ) 也 不 相 同 。 在 这 种 条 件下 , 缓 冲 系 统 中 的 HCl 几 乎 全 部 解 离 成 Cl - , 两 槽 中 的 Gly (pI=6.0,pK a=9.7) 只 有 很 少 部 分解 离 成 Gly 的 负 离 子 , 而 酸 性 蛋 白 质 也 可 解 离 出 负 离 子 。 这 些 离 子 在 电 泳 时 都 向 正 极 移 动 。C1 - 速 度 最 快 ( 先 导 离 子 ), 其 次 为 蛋 白 质 ,Gly 负 离 子 最 慢 ( 尾 随 离 子 )。 由 于 C1 - 很 快 超 过 蛋白 离 子 , 因 此 在 其 后 面 形 成 一 个 电 导 较 低 、 电 位 梯 度 较 陡 的 区 域 , 该 区 电 位 梯 度 最 高 , 这 是在 电 泳 过 程 中 形 成 的 电 位 梯 度 的 不 连 续 性 , 导 致 蛋 白 质 和 Gly 离 子 加 快 移 动 , 结 果 使 蛋 白 质在 进 入 分 离 胶 之 前 , 快 、 慢 离 子 之 间 浓 缩 成 一 薄 层 , 有 利 于 提 高 电 泳 的 分 辨 率 。2. 分 子 筛 效 应蛋 白 质 离 子 进 入 分 离 胶 后 , 条 件 有 很 大 变 化 。 由 于 其 pH 升 高 ( 电 泳 进 行 时 常 超 过 9.0),使 Gly 解 离 成 负 离 子 的 效 应 增 加 ; 同 时 因 凝 胶 的 浓 度 升 高 , 蛋 白 质 的 泳 动 受 到 影 响 , 迁 移率 急 剧 下 降 。 此 两 项 变 化 , 使 Gly 的 移 动 超 过 蛋 白 质 , 上 述 的 高 电 压 梯 度 不 复 存 在 , 蛋 白质 便 在 一 个 较 均 一 的 pH 和 电 压 梯 度 环 境 中 , 按 其 分 子 的 大 小 移 动 。 分 离 胶 的 孔 径 有 一 定 的大 小 , 对 不 同 相 对 分 子 质 量 的 蛋 白 质 来 说 , 通 过 时 受 到 的 阻 滞 程 度 不 同 , 即 使 净 电 荷 相 等 的颗 粒 , 也 会 由 于 这 种 分 子 筛 的 效 应 , 把 不 同 大 小 的 蛋 白 质 相 互 分 开 。4

根 据 经 验 得 知 , 当 蛋 白 质 分 子 量 在 11.7-165KD 之 间 时 , 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 的 电 泳 迁 移率 与 蛋 白 质 分 子 量 的 对 数 成 线 性 关 系 , 符 合 直 线 方 程 式 ;lgMW=-bX+K(MW 为 蛋 白 质 的分 子 量 ,X 为 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 电 泳 的 相 对 迁 移 率 ,K 和 b 均 为 常 数 ), 将 已 知 分 子 量 的 标准 蛋 白 质 在 SDS-PAGE 中 电 泳 迁 移 率 对 分 子 量 的 对 数 作 图 , 即 可 得 到 一 条 标 准 曲 线 。 只 要测 得 未 知 分 子 量 的 蛋 白 质 在 相 同 条 件 下 的 电 泳 迁 移 率 , 就 能 根 据 标 准 曲 线 求 得 其 分 子 量 。仪 器 与 主 要 试 剂 :1. 主 要 器 材 :电 泳 仪 、 垂 直 电 泳 仪 、 进 样 器 、 镊 子 、 注 射 器 、 烧 杯 、 旋 涡 器 、 离 心 机2. 主 要 试 剂 :(1) 低 分 子 量 标 准 蛋 白 质 液 10l;(2) 菌 体 培 养 液 一 支 1.5ml宿 主 菌 :BL21;经 IPTG 诱 导 表 达 的 蛋 白 :F-box 蛋 白 ( 泛 素 相 关 蛋 白 ), 分 子 量 略 小 于 50KD。(3) 2× 蛋 白 质 样 品 缓 冲 液 , 组 成 如 下 :Tris 0.15gβ- 巯 基 乙 醇 1.0ml溴 酚 蓝 0.02g甘 油2.0mlSDS 0.4g蒸 馏 水7.0ml3. 试 剂 配 制 :30% 丙 烯 酰 胺 称 29g 丙 烯 酰 胺 ,1g 甲 叉 丙 烯 酰 胺 , 溶 于 蒸 馏 水 并 定 容 至100ml, 滤 纸 过 滤 后 置 棕 色 玻 璃 瓶 内 室 温 保 存10% 过 硫 酸 铵 1g 过 硫 酸 铵 溶 于 蒸 馏 水 定 容 至 10mlTEMEDN,N,N’,N’- 四 甲 基 乙 二 胺 , 棕 色 瓶 保 存上 胶 缓 冲 液1.0 mol/l Tris·Cl (pH6.8)。Tris12.1g, SDS0.4g 溶 于 60ml蒸 馏 水 , 用 盐 酸 调 pH6.8, 定 容 至 100ml下 胶 缓 冲 液1.5 mol/l Tris·Cl (pH8.8)。Tris18.2g, SDS0.4g 溶 于 60ml蒸 馏 水 , 用 盐 酸 调 pH8.8, 定 容 至 100ml1× 甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液 25mmol/L Tris(3.02g),250mmol/L 甘 氨 酸 (18.8g),0.1%SDS(1g), 加 蒸 馏 水 至 1000ml染 色 液0.5g 考 马 斯 亮 蓝 R250,90ml 甲 醇 ,20ml 冰 乙 酸 , 加 水 至 200ml脱 色 液与 染 色 液 成 分 相 似 , 无 考 马 斯 亮 蓝 R250实 验 方 法 :1. 安 装 电 泳 槽 凝 胶 装 置先 将 二 块 玻 璃 板 洗 干 净 , 干 燥 , 嵌 入 胶 带 的 凹 槽 中 , 装 在 电 极 槽 上 , 拧 紧 外 螺 丝 , 使 其 夹 紧( 不 能 过 紧 以 防 玻 璃 破 裂 ), 放 入 制 胶 架 固 定 , 留 待 灌 胶 。5

2. 凝 胶 的 制 备由 冰 箱 中 取 出 储 液 平 衡 到 室 温 后 开 始 配 胶 , 在 50ml 烧 杯 内 按 下 列 配 方 ( 一 块 胶 ) 配 制SDS-PAGE 分 离 胶 ( 下 胶 ):( 此 配 方 建 议 更 改 为 现 行 的 , 与 仪 器 装 置 配 套 的 数 据 )SDS-PAGE 配 方30% 丙 烯 酰 胺 缓 冲 液 H 2 O 10% 过 硫 酸 铵 TEMED 总 体 积mlmlmlllml下 胶10%3.3 2.6 4 100 4 10上 胶 5% 0.83 0.68 3.4 50 5 53. 灌 胶迅 速 将 配 好 的 丙 烯 酰 胺 溶 液 ( 分 离 胶 ) 灌 入 两 片 玻 璃 板 的 间 隙 中 , 留 出 灌 注 浓 缩 胶 所需 的 空 间 ( 梳 子 齿 长 再 加 1 厘 米 ), 用 细 管 小 心 地 在 丙 烯 酰 胺 溶 液 上 覆 盖 上 一 层 蒸 馏 水 , 防止 因 氧 气 扩 散 进 入 凝 胶 而 抑 制 聚 合 反 应 。 待 分 离 胶 聚 合 完 全 后 ( 约 30min), 倾 出 覆 盖 水 层 。再 按 上 表 配 置 5% 浓 缩 胶 ( 上 胶 ) 立 即 混 合 , 在 已 聚 合 的 分 离 胶 上 直 接 灌 注 后 , 立 即在 上 胶 溶 液 中 插 入 干 净 的 梳 子 , 两 边 平 直 , 小 心 避 免 气 泡 混 入 , 将 凝 胶 垂 直 放 置 于 室 温 下10-15min, 待 浓 缩 胶 凝 固 后 , 将 梳 子 小 心 拔 出 , 然 后 用 水 冲 洗 加 样 槽 以 除 去 未 聚 合 的 丙 烯 酰胺 , 用 针 头 把 加 样 槽 之 间 的 胶 齿 弄 直 , 将 凝 胶 装 置 从 制 胶 架 中 取 出 , 放 入 电 泳 槽 盒 中 , 并 在电 泳 槽 内 加 入 Tris- 甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液 。4. 样 品 处 理(1) 待 测 蛋 白 质 样 品 处 理经 37℃ 培 养 过 夜 的 大 肠 杆 菌 菌 液 1.5ml, 6000rpm 离 心 10min, 弃 上 清 加 入 TE 缓 冲液 (0.1molTris,10mmol/L EDTA)50l, 将 菌 体 再 旋 涡 器 悬 浮 , 再 加 入 2× 样 品 缓 冲 液 50l混 匀 , 在 100℃ 水 浴 中 煮 沸 5min。(2) 标 准 蛋 白 质 样 品 ( 蛋 白 质 Marker) 的 处 理将 已 分 装 好 的 10l 标 准 蛋 白 质 样 品 中 加 入 10l 样 品 缓 冲 液 , 混 匀 , 在 100℃ 水 浴 中 煮沸 5min。5. 加 样待 样 品 冷 却 后 , 用 微 量 进 样 器 ( 或 加 样 枪 接 上 小 吸 管 ), 吸 取 10~30l 样 品 , 按 号 依 次加 入 样 品 槽 , 因 样 品 液 内 有 甘 油 , 可 使 样 品 沉 降 在 凝 胶 面 上 。6. 电 泳加 样 完 毕 , 将 上 槽 ( 黑 色 电 极 ) 接 负 极 , 下 槽 ( 红 色 电 极 ) 接 正 极 , 打 开 直 流 电 源 ,先 把 电 压 调 至 8v/cm(80v), 待 染 料 前 沿 进 入 分 离 胶 成 狭 窄 带 时 , 将 电 压 提 高 到 12v/cm(120v), 电 泳 1.5-3h 后 , 直 到 溴 酚 蓝 指 示 剂 迁 移 到 接 近 凝 胶 底 部 时 立 即 停 止 电 泳 。7. 剥 胶从 电 泳 槽 上 卸 下 凝 胶 板 , 放 置 在 纸 巾 上 , 用 刮 勺 ( 或 取 胶 器 ) 撬 开 玻 璃 板 。8. 染 色 以 及 脱 色6

将 电 泳 后 的 凝 胶 板 轻 轻 取 下 , 放 入 染 色 液 中 染 色 ,20min~1h 后 , 把 染 色 液 倒 回 瓶 中 ,加 入 脱 色 液 , 脱 色 4-8h, 其 间 更 换 脱 色 液 3-4 次 。 可 将 凝 胶 浸 于 水 中 或 固 定 在 20% 甘 油 中 或抽 干 , 干 燥 后 成 胶 片 保 存 或 拍 照 。蛋 白 质 分 子 量 计 算电 泳 迁 移 率 的 计 算 :按 下 列 公 式 计 算 蛋 白 质 样 品 的 相 对 迁 移 率 (MR)相 对 迁 移 率 (MR)=( 蛋 白 质 样 品 移 动 距 离 / 脱 色 后 胶 长 )×( 染 色 前 胶 长 / 指 示 剂 移 动距 离 )根 据 蛋 白 质 迁 移 率 按 上 述 直 线 方 程 式 即 可 计 算 出 蛋 白 质 分 子 量 。注 意 事 项 :1. 丙 烯 酰 胺 时 有 毒 试 剂 , 操 作 时 务 必 小 心 , 切 勿 接 触 皮 肤 或 溅 入 眼 内 , 操 作 后 注 意 洗 手 。2. 制 胶 过 程封 槽 → 制 备 分 离 胶 ( 下 胶 )→ 快 速 倒 入 玻 璃 夹 层 , 至 短 玻 璃 上 端 约 3cm 停 止 → 用 滴 管小 心 快 速 加 入 蒸 馏 水 约 2ml 封 胶 → 分 离 胶 凝 聚 后 ( 约 30min), 甩 干 水 → 配 制 浓 缩 胶 ( 上 胶 )→ 快 速 倒 入 → 插 梳 子 → 浓 缩 胶 凝 聚 后 拔 梳 子 ( 约 20min)→ 电 泳 槽 内 灌 入 1× 甘 氨 酸 缓 冲 液800ml→ 把 胶 柱 弄 直 。3. 样 品 处 理 及 电 泳 过 程0.5ml 菌 液 →6000rpm 离 心 10min 收 集 菌 体 → 弃 上 清 → 加 50l TE 缓 冲 液 菌 体 悬 浮 → 加50l 2× 蛋 白 样 品 缓 冲 液 , 混 匀 →100℃ 水 浴 煮 沸 15min→ 冷 却 后 取 10-30l 上 样 → 电 泳 4-6h( 浓 缩 胶 90V 约 30min~1h, 分 离 胶 120V 约 1-2h)→ 倒 出 电 泳 缓 冲 液 , 用 水 冲 洗 电 泳 槽 →小 心 撬 开 玻 璃 , 剥 胶 → 用 考 马 斯 亮 蓝 R250 染 色 20min~1h→ 加 约 200ml 脱 色 液 脱 色 过 夜 →弃 去 脱 色 液 , 用 水 冲 洗 凝 胶 观 察 结 果 。附 一 :低 分 子 量 标 准 蛋 白 质 液 的 组 成蛋 白 质分 子 量(Da)兔 磷 酸 化 酶 B 97,200牛 血 清 白 蛋 白 66,409鸡 卵 清 蛋 白 44,287牛 碳 酸 苷 酶 29,000胰 蛋 白 酶 抑 制 剂鸡 蛋 清 溶 菌 酶20,10014,300附 二 :分 离 胶 (Resolving gels) 和 浓 缩 胶 (stacking gels) 的 常 用 配 方7

附 三 :SDS-PAGE 电 泳 常 见 问 题 及 解 答Q:“ 微 笑 ”( 两 边 翘 起 中 间 凹 下 ) 形 带 原 因 ?A: 主 要 是 由 于 凝 胶 的 中 间 部 分 凝 固 不 均 匀 所 致 , 多 出 现 于 较 厚 的 凝 胶 中 。处 理 办 法 : 待 其 充 分 凝 固 再 作 后 续 实 验 。Q:“ 皱 眉 ”( 两 边 向 下 中 间 鼓 起 ) 形 带 原 因 ?A: 主 要 出 现 在 蛋 白 质 垂 直 电 泳 槽 中 , 一 般 是 两 板 之 间 的 底 部 间 隙 气 泡 未 排 除 干 净 。处 理 办 法 : 可 在 两 板 间 加 入 适 量 缓 冲 液 , 以 排 除 气 泡 。Q: 为 什 么 带 出 现 拖 尾 现 象 ?A: 主 要 是 样 品 融 解 效 果 不 佳 或 分 离 胶 浓 度 过 大 引 起 的 。处 理 办 法 : 加 样 前 离 心 ; 选 择 适 当 的 样 品 缓 冲 液 , 加 适 量 样 品 促 溶 剂 ; 电 泳 缓 冲 液 时 间 过 长 ,8

重 新 配 制 ; 降 低 凝 胶 浓 度 。Q: 为 什 么 溴 酚 蓝 不 能 起 到 指 示 作 用 ?A: 我 们 在 实 验 中 常 会 遇 到 溴 酚 蓝 已 跑 出 板 底 , 但 蛋 白 质 却 还 未 跑 下 来 的 现 象 。 主 要 与 缓 冲液 和 分 离 胶 的 浓 度 有 关 。处 理 办 法 : 更 换 正 确 pH 值 的 Buffer; 降 低 分 离 胶 的 浓 度 。Q: 为 什 么 电 泳 的 条 带 很 粗 ?A: 电 泳 中 条 带 很 粗 是 常 见 的 事 , 主 要 是 未 浓 缩 好 的 原 因 。处 理 办 法 : 适 当 增 加 浓 缩 胶 的 长 度 ; 保 证 浓 缩 胶 贮 液 的 pH 正 确 (6.7); 适 当 降 低 电 压 ;Q: 为 什 么 电 泳 电 压 很 高 而 电 流 却 很 低 呢 ?A: 这 种 现 象 一 般 初 学 者 易 出 现 。 比 如 电 压 50v 以 上 , 可 电 流 却 在 5mA 以 下 。 主 要 是 由 于电 泳 槽 没 有 正 确 装 配 , 电 流 未 形 成 通 路 。 包 括 :a. 内 外 槽 装 反 ;b. 外 槽 液 过 少 ;c. 电 泳 槽 底部 的 绝 缘 体 未 去 掉 ( 比 如 倒 胶 用 的 橡 胶 皮 )。处 理 办 法 : 电 泳 槽 正 确 装 配 即 可 。9

实 验 六肝 糖 原 的 提 取 、 鉴 定 与 定 量( 生 物 化 学 实 验 操 作 考 核 卷 )姓 名 , 学 号 , 专 业 , 级 班 组 , 月 日目 的 要 求 :1. 掌 握 组 织 样 品 的 制 备 方 法 , 了 解 其 注 意 事 项 。2. 了 解 肝 糖 原 提 取 、 糖 原 和 葡 萄 糖 鉴 定 与 蒽 酮 比 色 测 定 糖 原 含 量 的 原 理 和 注 意 事 项 ,掌 握 其 操 作 方 法 。3. 正 确 操 作 使 用 刻 度 吸 管 和 可 调 微 量 取 液 器 。4. 熟 练 运 用 溶 液 混 匀 的 各 种 方 法 ( 视 具 体 情 况 , 采 用 合 适 的 混 匀 方 法 )。5. 正 确 掌 握 溶 液 转 移 的 操 作 。6. 正 确 操 作 使 用 分 光 光 度 计 。实 验 原 理 :( 一 ) 肝 糖 原 的 提 取 、 鉴 定糖 原 储 存 于 细 胞 内 , 采 用 研 磨 匀 浆 等 方 法 可 使 细 胞 破 碎 , 低 浓 度 的 三 氯 醋 酸 能 使 蛋 白 质变 性 , 破 坏 肝 组 织 中 的 酶 且 沉 淀 蛋 白 质 , 而 糖 原 仍 稳 定 地 保 存 于 上 清 液 中 , 从 而 使 用 糖 原 与蛋 白 质 等 其 它 成 分 分 离 开 来 。 糖 原 不 溶 于 乙 醇 而 溶 于 热 水 , 故 先 用 95% 乙 醇 将 滤 液 中 糖 原沉 淀 , 再 溶 于 热 水 中 。糖 原 水 溶 液 呈 乳 样 光 泽 , 遇 碘 呈 红 棕 色 。 这 是 糖 原 中 葡 萄 糖 长 链 形 成 的 螺 旋 中 , 依 靠 分子 间 引 力 吸 附 碘 分 子 后 呈 现 的 颜 色 。 糖 原 还 可 被 酸 水 解 为 葡 萄 糖 , 利 用 呈 色 反 应 和 葡 萄 糖 的还 原 性 , 可 判 定 肝 组 织 中 糖 原 的 存 在 。CuSO 4 十 2NaOH ═ Na 2 SO 4 +Cu(OH) 2 ↓2Cu(OH) 2 十 C 6 H1 2 O 6 ═ 2CuOH 十 氧 化 型 葡 萄 糖 +H 2 O2CuOH ═ Cu 2 O↓( 红 色 )+H 2 OCu(OH) 2 ═ CuO↓( 黑 色 )+H 2 O( 二 ) 肝 糖 原 的 定 量糖 原 在 浓 酸 中 可 水 解 成 为 葡 萄 糖 , 浓 硫 酸 能 使 葡 萄 糖 进 一 步 脱 水 生 成 糠 醛 衍 生 物 ——5-羟 甲 基 呋 喃 甲 醛 , 此 化 合 物 再 与 蒽 酮 脱 水 缩 合 生 成 蓝 色 的 化 合 物 。 该 物 质 在 620nm 处 有 最大 吸 收 。 糖 含 量 在 (10100)g 范 围 内 , 溶 液 颜 色 的 深 浅 与 可 溶 性 糖 含 量 成 正 比 。 利 用 此 反 应与 同 样 处 理 的 已 知 葡 萄 糖 含 量 标 准 溶 液 比 色 , 通 过 标 准 对 照 法 ( 直 接 比 较 法 ) 即 可 计 算 出 样品 中 糖 原 的 含 量 。 糖 原 在 浓 碱 溶 液 中 非 常 稳 定 , 故 在 显 色 之 前 , 肝 组 织 先 置 于 浓 碱 中 加 热 ,以 破 坏 其 它 成 分 , 而 保 留 肝 糖 原 。实 验 材 料 :( 一 ) 仪 器1. 普 通 离 心 机 , 室 温 100℃ 恒 温 水 浴 箱 (×2),722 型 分 光 光 度 计 , 精 度 为 10mg 级 电10

子 天 平 (×1)2. 剪 刀 (×1), 镊 子 (×1), 研 钵 (×1)3. 试 管 架 (×1),10ml 离 心 管 (×2),(100×15)mm 试 管 (×6)4. 刻 度 吸 量 管 (2ml×1,5 ml×2),1000μl 微 量 可 调 取 液 器 (×1)5. 100ml 容 量 瓶 (×1)6. 白 瓷 反 应 板 (×1)( 二 ) 实 验 样 品 和 试 剂1. 鸡 肝 。2. 95% 乙 醇 。3. 0.31mol/L(5%) 三 氯 醋 酸 溶 液 : 称 取 未 潮 解 的 三 氯 醋 酸 (C 2 HCl 3 O 2 ,163.39)5g, 加 蒸 馏水 溶 解 至 100 ml。4. 0.15mol/L NaCl 溶 液 : 称 取 8.8g NaCl 加 蒸 馏 水 溶 解 至 1000 ml。5. 12mol/L HCl: 浓 HCl 原 液 (36%38%)。6. 12.5mol/L(50%)NaOH: 称 取 NaOH 50g, 用 蒸 馏 水 溶 解 至 100ml。7. 碘 试 剂 : 碘 l00mg 和 K1 200mg 溶 于 50ml 蒸 馏 水 中 。8. 班 氏 试 剂 : 称 取 柠 檬 酸 钠 (C 5 H 5 Na 3 O 7·5H 2 O,294.10)173g 和 无 水 碳 酸 钠 (Na 2 C0 3 ,105.99)100g 溶 于 蒸 馏 水 800ml 中 , 加 热 促 溶 。 冷 却 , 慢 慢 倾 人 17.3% 硫 酸 铜 (CuSO 4·5H 2 O,249.68) l00ml, 边 加 边 摇 。 再 加 蒸 馏 水 至 1000ml, 混 匀 , 如 混 浊 可 过 滤 取 滤 液 。 此 试 剂 可长 期 保 存 。9. 5.35mol/L(30%)KOH 溶 液 : 称 取 KOH 30g, 加 蒸 馏 水 溶 解 至 100 ml。11. 标 准 葡 萄 糖 液 (50mg/L): 称 取 已 干 燥 恒 重 的 无 水 葡 萄 糖 25mg, 加 蒸 馏 水 溶 解 至 500ml。12. 17mol/L(90%)H 2 SO 4 : 量 取 蒸 馏 水 30ml, 加 浓 H 2 SO 4 500 ml。13. 蒽 酮 显 色 剂 : 称 取 蒽 酮 0.20g, 用 17mol/L H 2 SO 4 溶 解 至 100 ml。 此 试 剂 不 稳 定 ,以 当 日 配 制 为 宜 , 冰 箱 保 存 可 用 45 天 。实 验 方 法 :吸 取 1ml 量 溶 液 时 使 用 可 调 微 量 取 液 器 , 吸 取 1ml 以 上 量 溶 液 时 使 用 刻 度 吸 量 管 。( 一 ) 肝 糖 原 的 提 取 与 鉴 定 操 作 流 程 如 下 。鸡 肝 约 1 g, 剪 碎+5%CCl 3 COOH 1 ml研 磨 至 乳 状+5%CCl 3 COOH 3 ml研 磨 成 肝 匀 浆全 部 转 入 离 心 管 中 , 离 心 3 分 钟 (4000 r / min)沉 淀 ( 弃 去 )上 清11

+5 ml 95% 乙 醇 , 混 匀 , 静 置 10 分 钟离 心 5 分 钟 (4000 r / min)上 清 ( 弃 去 ) 沉 淀+ 蒸 镏 水 2 ml沸 水 浴 2 分 钟 , 溶 解 沉 淀鉴 定 方 法 1鉴 定 方 法 2白 瓷 板 孔 穴 中加 碘 试 剂 0.1ml(2 滴 ) 加 碘 试 剂 0.1ml(2 滴 )糖 原 溶 液 0.1ml(2 滴 )糖 原 溶 液 1ml+ 浓 HCl 0.2ml沸 水 浴 15 分 钟 , 冷 却+50%NaOH 0.2ml呈 色 对 比 糖 原 水 解 液 0.1ml(2 滴 ) 糖 原 水 解 液混 匀+ 班 氏 试 剂 0.2ml(4 滴 )沸 水 浴 2 分 钟 , 观 察 颜 色 变 化注 意 事 项1. 肝 糖 原 提 取 一 步 , 向 上 清 液 中 加 入 5ml95% 乙 醇 后 , 务 必 注 意 混 匀 。 由 于 上 清 液 为水 溶 液 , 比 重 大 于 95% 乙 醇 , 溶 液 分 成 两 层 。 加 之 上 清 液 已 3ml 多 , 总 量 接 近 9ml, 混 匀操 作 比 较 困 难 , 最 好 用 倾 倒 混 匀 , 也 可 用 滴 管 或 吸 量 管 吸 、 吹 混 匀 , 或 用 玻 璃 棒 搅 拌 混 匀 。2. 糖 原 中 葡 萄 糖 螺 旋 链 吸 附 碘 产 生 的 颜 色 与 葡 萄 糖 残 基 数 的 多 少 有 关 。 葡 萄 糖 残 基 在20 个 以 下 的 会 使 碘 呈 现 红 色 ,2030 个 之 间 使 碘 呈 现 紫 色 ,60 个 以 上 的 会 使 碘 呈 现 蓝 色 。淀 粉 中 分 枝 链 较 长 , 故 呈 蓝 色 , 而 肝 糖 原 分 枝 中 的 葡 萄 糖 残 基 在 20 个 以 下 ( 通 常 812 个 葡萄 糖 残 基 ), 吸 附 碘 后 呈 现 红 棕 色 。3. 糖 原 水 解 液 中 葡 萄 糖 的 鉴 定 一 步 , 加 班 氏 试 剂 不 能 过 量 , 否 则 反 应 液 呈 黑 色 浑 浊 ,观 察 不 到 应 有 的 结 果 。( 二 ) 肝 糖 原 定 量 测 定 操 作 流 程 如 下鸡 肝 0.07~0.15 g+30%KOH 1.5ml沸 水 浴 15 分 钟冷 却 , 全 部 转 入 100 ml 容 量 瓶 中加 水 至 标 线 , 仔 细 混 匀 , 此 为 糖 原 消 化 液12

取 干 净 试 管 3 支 , 按 下 表 操 作 。试 剂 (ml) 空 白 管 标 准 管 样 品 管蒸 馏 水 1.0 — —标 准 葡 萄 糖 溶 液 (0.05mg/ml) — 1.0 —糖 原 消 化 液 — — 1.00.2% 蒽 酮 溶 液 2.5 2.5 2.5混 匀 , 沸 水 浴 10 分 钟 , 冷 却 。 在 分 光 光 度 计 620 nm 波 长 处 , 用 空 白 管 溶 液 调 零 , 测定 其 余 各 管 溶 液 的 吸 光 度 (A)。计 算 :A 样 品 100 100肝 糖 原 (g/100 g 肝 组 织 ) = ×0.05××A 标 准 肝 组 织 重 (g) 1000 ×1.11考 核 操 作 内 容 :1. 吸 量 管 操 作 (5 分 );2. 可 调 式 微 量 取 液 器 操 作 (5 分 );3. 溶 液 混 匀 操 作 ( 视 具 体 情 况 , 采 用 合 适 的 混 匀 方 法 )(5 分 );4. 溶 液 转 移 操 作 (5 分 );5. 分 光 光 度 计 比 色 操 作 (5 分 )。操 作 标 准 :下 面 每 1 项 操 作 满 分 记 5 分 , 操 作 共 计 25 分 。( 一 ) 吸 量 管 操 作1. 执 管 : 要 求 右 手 拿 吸 量 管 , 左 手 拿 橡 皮 球 , 只 能 用 食 指 而 不 能 用 拇 指 按 压 吸 量 管 上口 来 调 节 吸 取 液 量 的 刻 度 ; 吸 液 、 排 液 整 个 操 作 过 程 吸 量 管 应 始 终 保 持 垂 直 。2. 坐 姿 : 要 求 腰 、 背 保 持 竖 直 , 看 刻 度 时 眼 睛 保 持 平 视 。3. 吸 取 溶 液 : 吸 量 管 插 入 液 面 深 度 约 0.5cm, 不 能 一 插 到 底 , 也 不 能 插 入 过 浅 而 吸 进空 气 致 使 溶 液 进 入 橡 皮 球 内 ; 调 控 吸 量 管 吸 取 液 量 的 刻 度 时 , 吸 量 管 尖 应 离 开 液 面 靠 在 容 器内 壁 上 。4. 排 出 液 体 : 吸 量 管 尖 应 靠 上 受 纳 容 器 内 壁 , 让 管 内 溶 液 自 然 流 出 。 不 能 用 橡 皮 球 吹压 , 而 且 在 流 净 后 吸 量 管 尖 停 靠 受 纳 容 器 内 壁 至 少 3 秒 。( 二 ) 可 调 式 微 量 取 液 器 操 作1. 设 定 容 量 值 : 转 动 加 样 器 的 调 节 旋 钮 , 反 时 针 方 向 转 动 旋 钮 , 可 提 高 设 定 取 液 量 。顺 时 针 方 向 转 动 旋 钮 , 可 降 低 设 定 取 液 量 。 在 调 整 设 定 移 液 量 的 旋 钮 时 , 不 要 用 力 过 猛 , 并应 注 意 使 取 液 器 显 示 的 数 值 不 超 过 其 可 调 范 围 。2. 吸 液 :(1) 选 择 合 适 的 吸 头 安 放 在 取 液 套 筒 上 , 稍 加 扭 转 压 紧 吸 嘴 使 之 与 套 筒 之 间 无 空 气 间13

隙 ;(2) 把 按 钮 压 至 第 一 停 点 , 垂 直 握 持 加 样 器 , 使 吸 头 浸 入 液 面 下 2~3 毫 米 处 , 然 后 缓 慢 平稳 地 松 开 按 钮 , 吸 入 液 体 , 等 一 秒 钟 , 然 后 将 吸 头 提 离 液 面 , 贴 壁 停 留 2-3 秒 , 使 管 尖 外 侧的 液 滴 滑 落 。3. 放 液 :(1) 将 吸 头 口 贴 到 容 器 内 壁 底 部 并 保 持 100°~40° 倾 斜 ;(2) 平 稳 地 把 按 钮 压 到 第 一 停 点 , 等 一 秒 钟 后 再 把 按 钮 压 到 第 二 停 点 以 排 出 剩 余 液 体 ;(3) 压 住 按 钮 , 同 时 提 起 加 样 器 , 使 吸 头 贴 容 器 壁 擦 过 , 再 松 开 按 钮 。 按 吸 头 弹 射 器除 去 吸 头 。4. 压 放 按 钮 时 保 持 平 稳 ; 加 样 器 不 得 倒 转 ; 吸 头 中 有 液 体 时 不 可 将 加 样 器 平 放 。 取 液 器吸 嘴 为 一 次 性 使 用 。 实 验 完 毕 , 将 取 液 器 读 数 调 至 最 大 量 程 值 , 竖 立 放 于 支 架 上 。( 三 ) 溶 液 的 混 匀 ( 操 作 流 程 中 下 划 实 线 的 3 处 )1. 肝 糖 原 的 提 取 与 鉴 定 操 作 中 , 肝 匀 浆 上 清 液 中 加 5ml95% 乙 醇 后 的 混 匀 最 好 用 倾 倒混 匀 , 也 可 用 滴 管 或 吸 量 管 吸 、 吹 混 匀 , 或 用 玻 璃 棒 搅 拌 混 匀 。2. 肝 糖 原 定 量 测 定 中 , 肝 组 织 消 化 液 沸 水 浴 后 全 部 转 入 100 ml 容 量 瓶 , 加 水 至 刻 线 后的 混 匀 应 采 用 倒 转 混 匀 。3. 肝 糖 原 定 量 测 定 中 , 加 蒽 酮 溶 液 后 的 混 匀 , 可 将 试 管 倾 斜 约 45º 再 作 旋 转 混 匀 。 因蒽 酮 溶 液 ( 浓 硫 酸 配 制 ) 比 重 大 于 样 品 水 溶 液 很 多 , 一 加 入 便 沉 于 管 底 ( 加 试 剂 的 顺 序 一 定不 能 颠 倒 ), 不 倾 斜 试 管 旋 转 混 匀 不 了 。( 四 ) 溶 液 的 转 移 ( 操 作 流 程 中 下 划 波 纹 线 的 两 处 )1. 在 研 钵 中 研 磨 后 的 肝 匀 浆 转 入 试 管 离 心 可 用 滴 管 或 取 液 器 吸 取 转 移 , 如 果 采 用 倒 入 ,不 能 洒 落 管 外 , 应 尽 量 转 移 干 净 。2. 肝 组 织 沸 水 浴 后 的 消 化 液 转 入 100 ml 容 量 瓶 前 应 冷 却 ; 转 入 时 用 玻 璃 棒 引 入 , 玻 璃棒 头 插 入 容 量 瓶 靠 瓶 颈 磨 口 下 约 1cm 处 , 玻 璃 棒 上 端 不 要 靠 上 瓶 口 边 沿 , 引 入 时 试 管 口 靠玻 璃 棒 的 位 置 靠 近 容 量 瓶 口 , 不 要 离 开 瓶 口 太 高 , 以 免 消 化 液 沾 染 玻 璃 棒 较 长 ; 转 入 过 程 中 ,溶 液 不 要 沾 染 到 容 量 瓶 磨 砂 口 上 , 更 不 能 滴 洒 到 容 量 瓶 外 面 ; 应 用 蒸 馏 水 洗 消 化 管 3 遍 以 上 ,洗 液 一 并 全 部 转 入 容 量 瓶 。( 五 ) 分 光 光 度 计 操 作1. 波 长 选 择 , 仪 器 调 零 , 空 白 调 零 , 灵 敏 度 挡 选 择 等 操 作 正 确 。2. 手 拿 比 色 杯 毛 面 。3. 比 色 溶 液 不 能 洒 落 比 色 杯 外 或 试 管 外 。4. 比 色 过 程 操 作 正 确 。实 验 结 束 后 , 器 材 按 要 求 清 洗 干 净 、 器 材 与 试 剂 瓶 归 回 原 位 和 台 面 卫 生 满 分 5 分实 验 报 告 结 果 要 求1. 肝 糖 原 的 提 取 、 鉴 定鉴 定 方 法 1 和 鉴 定 方 法 2 中 最 后 的 “ 呈 色 对 比 ” 和 “ 观 察 颜 色 变 化 ”, 结 果 一 定 要 明 确表 达 是 “ 有 变 化 ” 或 “ 没 有 变 化 ”, 有 变 化 的 话 还 要 具 体 写 出 变 成 什 么 颜 色 了 。 而 且 要 作 出14

明 确 结 论 :“ 有 糖 原 ” 或 “ 没 有 糖 原 ”, 如 果 颜 色 转 变 成 红 色 不 很 明 显 , 可 以 写 “ 有 少 量 糖 原 ”、“ 有 极 少 量 糖 原 ” 或 “ 有 微 量 糖 原 ” 等 , 但 不 能 写 “ 可 能 有 少 量 糖 原 ”、“ 可 能 有 极 少 量 糖原 ” 或 “ 可 能 有 微 量 糖 原 ” 等 带 “ 可 能 ” 的 结 论 。 在 这 里 结 论 “ 没 有 糖 原 ” 不 是 说 绝 对 没 有糖 原 , 而 只 是 说 用 这 种 鉴 定 方 法 鉴 定 不 出 有 糖 原 的 存 在 。2. 肝 糖 原 的 定 量 测 定测 定 数 据 应 记 入 结 果 栏 内 , 计 算 过 程 应 先 写 出 计 算 公 式 , 再 代 入 测 定 数 据 进 行 计 算 ,结 果 保 留 小 数 点 后 3 位 。 如 果 是 直 接 列 式 计 算 , 至 少 前 面 要 出 现 过 有 记 载 计 算 糖 原 的 公 式 ,否 则 必 须 适 当 扣 分 ; 如 果 只 列 出 计 算 公 式 和 有 测 定 数 据 的 记 录 , 没 有 将 测 定 数 据 代 入 公 式 的计 算 过 程 而 直 接 写 出 结 果 的 可 结 合 其 它 情 况 酌 情 扣 分 。实 验 报 告 评 分按 平 时 实 验 报 告 要 求 评 分监 考 记 录 表月 日每 项 操 作 满 分 5 分 , 当 场 记 分姓 名 吸 量 管 操 作 取 液 器 操 作 混 匀 ( 下 划 实 线 2 处 ) 溶 液 转 移 ( 下 划 波 纹 线 2 处 ) 比 色 操 作 卫 生15

实 验 七质 粒 DNA 的 提 取 、 定 量 、 酶 切 与 PCR 鉴 定目 的 :采 用 碱 变 性 法 , 学 习 小 规 模 制 备 质 粒 DNA 的 技 术 ; 了 解 紫 外 吸 收 检 测 DNA 浓 度 与 纯 度的 原 理 , 掌 握 测 定 方 法 ; 学 习 水 平 式 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 , 检 测 质 粒 DNA 的 构 型 、 分 子 量 的 大小 ; 学 习 体 外 构 建 或 鉴 定 重 组 DNA 分 子 时 , 根 据 目 的 基 因 及 载 体 选 择 合 适 的 限 制 性 内 切 酶 ;学 习 PCR 的 基 本 原 理 与 实 验 技 术 , 了 解 引 物 设 计 的 一 般 要 求 。原 理 :碱 变 性 抽 提 质 粒 DNA 是 基 于 染 色 体 DNA 与 质 粒 DNA 的 变 性 与 复 性 的 差 异 而 达 到 分 离目 的 。 在 pH 值 高 达 12.6 的 碱 性 条 件 下 , 染 色 体 DNA 的 氢 键 断 裂 , 双 螺 旋 结 构 解 开 而 变 性 。质 粒 DNA 的 大 部 分 氢 键 也 断 裂 , 但 超 螺 旋 共 价 闭 合 环 状 的 两 条 互 补 链 不 会 完 全 分 离 , 当 以pH4.8 的 NaAc 高 盐 缓 冲 液 去 调 节 其 pH 值 至 中 性 时 , 变 性 的 质 粒 DNA 又 恢 复 原 来 的 构 型 ,保 存 在 溶 液 中 , 而 染 色 体 DNA 不 能 复 性 而 形 成 缠 连 的 网 状 结 构 , 通 过 离 心 , 染 色 体 DNA与 不 稳 定 的 大 分 子 RNA、 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 等 一 起 沉 淀 下 来 而 被 除 去 。核 酸 的 最 大 吸 收 波 长 为 260nm, 蛋 白 质 为 280nm, 在 波 长 260nm 时 ,1OD 值 相 当 于 双 链DNA 浓 度 为 50μg/ml, 单 链 DNA 和 RNA 浓 度 为 40μg/ml, 单 链 寡 核 苷 酸 的 含 量 为 33μg/ml,可 以 据 此 来 计 算 核 酸 样 品 的 浓 度 , 还 可 通 过 测 定 在 260nm 和 280nm 的 OD 值 的 比 值(OD 260 /OD 280 ), 估 计 核 酸 的 纯 度 。 纯 净 DNA 的 比 值 为 1.8, RNA 为 2.0。 若 比 值 高 于 1.8 说明 DNA 样 品 中 的 RNA 尚 未 除 尽 , 若 样 品 中 含 有 酚 和 蛋 白 质 将 导 致 比 值 降 低 。270nm 存 在 高吸 收 表 明 有 酚 的 干 扰 。 紫 外 分 光 光 度 法 只 能 用 于 测 定 浓 度 大 于 0.25μg/ml 的 核 酸 溶 液 , 在 测定 的 浓 度 为 5~90μg/ml 范 围 内 , 该 方 法 较 为 可 靠 , 对 浓 度 更 小 的 样 品 , 可 采 用 荧 光 分 光 光 度法 。琼 脂 糖 是 从 海 藻 中 提 取 出 来 的 一 种 线 状 高 聚 物 , 可 作 为 电 泳 支 持 物 , 适 用 于 分 离 大 小 范围 在 0.2-50kb 的 DNA 片 段 。DNA 分 子 的 迁 移 率 与 分 子 量 的 对 数 值 成 反 比 关 系 。 观 察 其 迁移 距 离 , 与 标 准 DNA 片 段 进 行 对 照 , 就 可 获 知 该 样 品 分 子 量 大 小 。 在 质 粒 抽 提 过 程 中 , 由于 各 种 因 素 的 影 响 , 使 质 粒 DNA 呈 现 超 螺 旋 的 共 价 闭 合 环 状 、 开 环 状 分 子 、 线 状 分 子 三 种不 同 的 构 型 , 这 三 种 分 子 有 不 同 的 迁 移 率 。 在 一 般 情 况 下 , 超 螺 旋 型 迁 移 速 度 最 快 , 其 次 为线 状 分 子 , 最 慢 的 为 开 环 状 分 子 。 用 荧 光 染 料 溴 化 乙 锭 (ethidium bromide, EB ) 进 行 检 测 ,溴 化 乙 锭 嵌 入 碱 基 对 之 间 形 成 荧 光 络 合 物 , 在 紫 外 线 激 发 下 发 出 红 色 荧 光 。限 制 性 内 切 酶 及 其 它 DNA 修 饰 酶 是 分 子 生 物 学 在 DNA 操 作 时 常 用 的 工 具 , 限 制 性 核酸 内 切 酶 是 应 用 最 多 的 一 类 酶 , 它 分 为 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 型 ,Ⅱ 型 最 常 用 , 通 常 所 用 的 限 制 性 内 切酶 多 指 此 型 。Ⅱ 型 限 制 性 内 切 酶 是 一 类 位 点 特 异 性 酶 , 识 别 双 链 DNA 分 子 上 特 异 的 核 苷 酸 序列 , 一 般 识 别 4~6 个 核 苷 酸 :EcoR Ⅰ:5’-G↓AATTC-3’;BamH Ⅰ: G↓GAATC;Hind Ⅲ:A↓AGCTT;Msp Ⅰ:C↓CGG。 不 同 的 限 制 性 内 切 酶 切 割 双 链 DNA 的 方 式 不 同 。16

根 据 这 些 特 性 可 以 很 容 易 地 在 体 外 进 行 DNA 的 重 组 操 作 。 一 般 典 型 的 限 制 性 内 切 酶 反 应是 底 物 DNA 在 含 有 Mg 2+ ,Na + 的 缓 冲 液 ( 如 pH=7.5) 中 , 加 入 限 制 性 内 切 酶 , 在 37℃ 保 温 。在 适 当 条 件 下 ( 包 括 温 度 ,pH, 离 子 强 度 ),1 小 时 内 完 全 酶 解 ,1μg DNA 所 需 限 制 性 内 切酶 的 量 , 定 义 为 一 个 活 性 单 位 。 影 响 酶 切 反 应 的 因 素 有 : 底 物 DNA 的 纯 度 , 反 应 系 统 , 反应 体 积 , 时 间 和 温 度 。聚 合 酶 链 式 反 应 (polymerase chain reaction, PCR) 是 一 种 最 常 用 的 体 外 基 因 扩 增 技 术 ,其 工 作 的 基 本 原 理 是 以 拟 扩 增 的 DNA 分 子 为 模 板 , 以 一 对 分 别 与 模 板 5’ 末 端 和 3’ 末 端 相 互补 的 寡 核 苷 酸 为 引 物 , 在 特 殊 的 耐 热 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下 , 按 照 半 保 留 复 制 的 机 制 沿 着 模板 链 延 伸 直 至 完 成 新 的 DNA 合 成 。 通 过 多 次 循 环 反 应 , 前 一 循 环 的 产 物 DNA 可 继 续 作 为 后一 循 环 的 模 板 DNA 参 与 DNA 的 合 成 , 使 得 目 的 DNA 片 段 的 量 按 2 n 方 式 呈 指 数 级 递 增 , 所 以该 反 应 称 为 链 式 反 应 。 组 成 PCR 反 应 体 系 的 基 本 成 分 包 括 : 模 板 DNA、 特 异 性 引 物 、 耐 热DNA 聚 合 酶 、dNTP 以 及 含 Mg 2+ 的 缓 冲 溶 液 。PCR 包 括 三 个 基 本 反 应 步 骤 :1 变 性 : 将 反 应 系 统 加 热 至 95℃, 使 模 板 DNA 完 全 变 性成 为 单 链 , 同 时 引 物 自 身 和 引 物 之 间 局 部 双 链 也 得 以 消 除 ;2 退 火 : 将 温 度 下 降 至 适 当 温 度 ,两 个 引 物 分 别 结 合 到 靶 DNA 两 条 单 链 的 3’ 末 端 ;3 延 伸 : 将 温 度 升 至 72℃,DNA 聚 合 酶 催化 dNTP 加 到 引 物 的 3’ 末 端 , 引 物 沿 着 靶 DNA 链 由 3’ 端 向 5’ 端 延 伸 。 上 述 三 个 步 骤 为 一 个 循环 , 新 合 成 的 DNA 分 子 继 续 作 为 下 一 轮 合 成 的 模 板 , 经 数 小 时 的 多 次 循 环 (25~40 次 ) 后 ,靶 DNA 片 段 的 扩 增 倍 数 可 达 10 6 ~10 9 。PCR 成 功 的 关 键 往 往 在 于 寡 核 苷 酸 引 物 的 正 确 设 计 。 要 保 证 PCR 能 准 确 、 特 异 、 有 效地 对 靶 DNA 进 行 扩 增 , 通 常 引 物 设 计 要 遵 守 以 下 几 条 原 则 :1 引 物 长 度 :15~25 个 核 苷 酸 ;2GC 含 量 为 40%~60%;3Tm 值 高 于 55℃;4 引 物 与 模 板 非 特 异 性 配 对 位 点 的 碱 基 配 对率 小 于 70%;5 两 条 引 物 间 配 对 碱 基 数 小 于 5 个 ;6 引 物 自 身 配 对 ( 特 别 是 引 物 的 3’ 末 端 )形 成 的 茎 环 结 构 、 茎 的 碱 基 对 数 不 大 于 3。 由 于 影 响 引 物 设 计 的 因 素 比 较 多 , 实 际 应 用 中 基本 是 利 用 专 门 的 引 物 设 计 软 件 进 行 引 物 设 计 。主 要 仪 器 :离 心 机 , 紫 外 分 光 光 度 计 , 恒 温 水 浴 锅 , 水 平 电 泳 槽 , 电 泳 仪 , 紫 外 检 测 仪 , 凝 胶 成像 系 统 , 基 因 扩 增 仪 (PCR 仪 )( 一 ) 质 粒 DNA 的 提 取主 要 试 剂 : 溶 液 I: 50 mmol/L 葡 萄 糖10 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)2 毫 克 / 毫 升 溶 菌 酶17

溶 液 II: 200 mmol/L NaOH1% SDS溶 液 III: 3 mol/L NaAc (pH4.8) 溶 液TE 缓 冲 液 :10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.51 mmol/L EDTA实 验 方 法 :1. 将 大 肠 杆 菌 菌 落 挑 取 一 环 接 种 在 含 有 2 毫 升 加 入 抗 菌 素 的 LB 液 体 培 养 基 的 10 毫 升试 管 里 ,37℃ 振 培 过 夜 ,16~18 小 时2. 转 移 以 上 菌 液 1.5 毫 升 于 EP 管 中 ,8000rpm 离 心 30 秒3. 小 心 去 除 上 清 , 并 用 吸 水 纸 吸 干 残 余 液 体 , 再 将 沉 淀 物 在 振 荡 器 上 振 匀4. 加 入 溶 液 I 100μl, 盖 紧 EP 管 盖 , 翻 转 数 次 , 冰 上 放 置 10 分 钟5. 加 入 溶 液 II 200μl, 温 和 翻 转 EP 管 5 次 ( 可 观 察 到 溶 液 逐 步 由 混 浊 变 为 透 明 ), 冰 上放 置 5 分 钟6. 加 入 溶 液 III 150μl, 将 EP 管 盖 紧 后 来 回 翻 转 2~3 次 , 混 匀 后 冰 上 放 置 20 分 钟7. 12000rpm 离 心 15 分 钟8. 将 上 清 转 移 到 另 一 个 EP 管 中 ( 吸 取 时 不 可 吸 入 底 部 的 沉 淀 )。 加 入 等 体 积 的 酚 和 氯 仿 :异 戊 醇 各 抽 提 一 次9. 加 入 1 毫 升 预 冷 的 无 水 乙 醇 和 1/10 体 积 的 NaAc(3 mol/L,pH5.2), 盖 紧 , 并 翻 转 EP管 数 次 混 匀10. 置 于 -20℃ 冰 箱 1~2 小 时11. 15000rpm 离 心 15 分 钟 , 去 除 上 清 , 收 集 管 底 白 色 沉 淀12. 70% 乙 醇 洗 涤 一 次 , 空 气 干 燥 或 真 空 抽 干13. 将 沉 淀 溶 于 50μl TE 缓 冲 液 或 去 离 子 水 , 完 全 溶 解 后 ,-20℃ 保 存14. 取 样 5μl, 在 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 , 观 察 DNA 条 带 。( 二 ) 紫 外 吸 收 检 测 DNA 的 浓 度 和 纯 度主 要 试 剂 : 提 取 的 质 粒 DNA实 验 方 法 :1. 分 光 光 度 计 先 用 水 在 260nm 和 280nm 两 个 波 长 下 校 零 。2. 取 质 粒 DNA 样 品 5μl, 用 水 稀 释 50~100 倍 , 转 入 分 光 光 度 计 的 石 英 比 色 杯 中 。3. 在 260nm 和 280nm 分 别 读 出 样 品 OD 值 。 根 据 260nm 时 1 OD 单 位 的 双 链 DNA =50μg/ml 和 稀 释 倍 数 , 可 以 计 算 出 样 品 DNA 的 浓 度 。4. 若 OD 260 /OD 280 大 于 1.8, 说 明 仍 有 RNA, 可 以 考 虑 用 RNA 酶 处 理 样 品 , 若 小 于 1.8,说 明 样 品 中 含 有 蛋 白 质 或 酚 , 应 再 用 酚 / 氯 仿 抽 提 , 以 乙 醇 沉 淀 纯 化 DNA。( 三 ) 质 粒 DNA 的 双 酶 切 鉴 定主 要 试 剂 :纯 化 的 质 粒 DNA(100ng/μl)18

限 制 性 内 切 酶 (TaKaRa): Hind III (15U/μl), EcoR I (12U/μl)酶 的 贮 存 缓 冲 液 : Hind III EcoR I10mM Tris-HCl 10mM Tris-HCl400mM KCl100mM KCl0.1mM EDTA 0.1mM EDTA1mM DTT 1mM DTT0.01% BSA 0.15% Triton X-10050% 甘 油 (pH 7.5) 0.01% BSA50% 甘 油 (pH 7.5)10 × Buffer: 100mM Tris-HCl(pH 7.5)100mM MgCl 210mM DTT500mM NaCl无 菌 去 离 子 水实 验 方 法 :在 0.5ml Eppendorf 管 中 按 顺 序 依 次 加 入 下 述 试 剂 , 混 匀 后 即 成 酶 切 反 应 体 系 :无 菌 去 离 子 水 :11μl10 × buffer 2μl质 粒 DNA5μl( 共 500ng)Hind III (15U/μl)1μlEcoR I (12U/μl)1μl共20μl将 反 应 管 置 37℃ 水 浴 1~3h反 应 结 束 后 取 10μl 反 应 产 物 以 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 检 测 并 观 察 结 果 , 酶 切 产 物 应 为不 同 大 小 的 两 个 片 段 。( 四 ) 质 粒 DNA 的 PCR 鉴 定主 要 试 剂 :2. DNA 模 板 : 质 粒 DNA( 含 靶 基 因 片 段 )3. 引 物 : A: 5’ GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’B: 5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC3’4. Taq 酶 :5U/μl5. 4×dNTP: 10mM each6. 10×buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3)7. MgCl 2 : 25mM8. 灭 菌 去 离 子 水实 验 方 法 :1. 准 备 PCR 反 应 溶 液 ( 最 好 于 冰 上 进 行 ):19

(1) 2×Premix 的 配 制无 菌 去 离 子 水5840μl10×buffer2000μl4×dNTP400μl ( 终 浓 度 :0.4mM)MgCl 21600μl ( 终 浓 度 : 4mM)Taq 酶160μl ( 终 浓 度 约 0.1U/μl)共 10ml , 混 匀 , 按 需 分 装 ,-20℃ 保 存(2) 准 备 PCR 反 应 溶 液 :取 0.2 ml PCR 反 应 管 一 只 , 用 微 量 加 样 枪 按 下 述 顺 序 分 别 加 入 各 试 剂 ( 注 意 每 换 一 种试 剂 换 一 个 新 吸 头 ):灭 菌 去 离 子 水19μl2×Premix25μl引 物 12μl引 物 22μl质 粒 DNA2μl ( 约 3ng)共 50μl 混 匀如 配 好 的 反 应 液 较 多 沾 到 管 壁 上 , 可 将 PCR 反 应 管 置 台 式 离 心 机 中 瞬 时 离 心 , 使 反应 液 集 中 于 管 底 , 然 后 将 反 应 管 放 到 基 因 扩 增 仪 (PCR 仪 ) 上 。2. PCR 扩 增 反 应 条 件 :94℃ × 5 min94℃ 30sec30 个 循 环 50℃ 30sec72℃ 60sec72℃ × 5min3. 结 果 检 测本 实 验 所 扩 增 的 产 物 DNA 片 段 长 度 400 多 bp, 可 取 1μl~5μl 产 物 以 1% 琼 脂 糖 凝 胶电 泳 进 行 检 测 。 具 体 操 作 方 法 见 后 。( 五 ) 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳主 要 试 剂 :1. 提 取 的 质 粒 DNA, 酶 切 产 物2. 5×TBE:54gTris; 27.5g 硼 酸 ; EDTA (0.5mol/L, pH 8.0) 20ml, 加 水 至 1L, 用 前 稀 释10 倍3. 溴 化 乙 锭 (EB):10mg/ml 溶 液 或 其 他 核 酸 染 料 物 质4. 溴 酚 蓝 或 加 样 缓 冲 液 (loading buffer)实 验 方 法 :1. 称 取 1g 琼 脂 糖 于 100ml 0.5×TBE 中 , 加 热 溶 解 , 冷 却 至 65℃ 左 右 再 加 入 终 浓 度 为0.5%-1.0% 的 EB( 或 其 他 核 酸 染 料 物 质 )。20

2. 将 电 泳 胶 模 置 于 制 胶 架 中 , 梳 子 置 于 适 当 位 置 , 将 冷 却 至 65℃ 左 右 的 琼 脂 糖 溶 液 慢慢 倒 在 胶 模 上 , 厚 度 约 3 mm。 静 置 , 待 胶 凝 固 后 将 胶 模 从 制 胶 架 中 取 出 , 放 入 电 泳槽 内 , 倒 入 适 量 电 泳 缓 冲 液 ( 一 般 液 面 高 出 凝 胶 1 cm), 小 心 拔 出 梳 子 。3. 将 5μg 提 取 的 质 粒 DNA 样 品 和 酶 切 产 物 , 分 别 与 溴 酚 蓝 指 示 剂 ( 或 loading buffer)混 匀 , 加 入 凝 胶 点 样 孔 内 , 防 止 产 生 气 泡 和 样 品 溢 出 。4. 将 电 泳 槽 通 电 ,80V 恒 压 电 泳 30 分 钟 。5. 电 泳 完 毕 , 关 掉 电 泳 仪 , 小 心 取 出 凝 胶 置 于 紫 外 灯 下 观 察 结 果 。注 意 事 项 :1. 防 止 紫 外 线 对 人 皮 肤 及 眼 睛 的 损 伤 , 避 免 直 接 照 射 皮 肤 与 眼 睛 。2. EB 是 强 诱 变 剂 , 有 致 癌 性 , 操 作 时 要 带 手 套 , 防 止 污 染 。 所 有 含 有 EB 的 溶 液 在 弃置 前 应 当 进 行 净 化 处 理 。附 注 一 :实 验 所 用 的 相 关 材 料 信 息备 选 一1. 质 粒 DNA 提 取 所 用 菌 液 样 品(1) 宿 主 菌 :DH5;(2) 载 体 :pET-28a(+);(3) 插 入 片 段 基 因 : 泛 素 化 基 因 FBOX(1.6Kb)。2. 质 粒 DNA 酶 切 鉴 定(1) 所 用 的 限 制 性 内 切 酶 :EcoR I 和 Hind III;(2) 酶 切 产 物 : 插 入 片 段 (1600bp) 及 载 体 (5300bp)。备 选 二1. 质 粒 DNA 提 取 所 用 菌 液 样 品(1) 宿 主 菌 :DH5;(2) 载 体 :pMD18-T;(3) 插 入 片 段 基 因 : 抑 癌 基 因 CHD5 启 动 子 区 的 一 段 区 域 (400bp)。2. 质 粒 DNA 酶 切 鉴 定(1) 所 用 的 限 制 性 内 切 酶 :EcoR I 和 Hind III;(2) 酶 切 产 物 : 插 入 片 段 (400bp) 及 载 体 (2.7kb)。3.PCR 实 验 相 关 说 明(1)PCR 引 物 : 为 通 用 引 物 , 序 列 见 前 。(2)PCR 扩 增 片 段 大 小 为 400 多 bp。附 注 二 :质 粒 图 谱1. pET-28a(+) 载 体21

2. pMD18-T 载 体22

附 注 三 :1. 溶 液 Ⅰ—— 溶 菌 液溶 菌 酶 : 它 是 糖 苷 水 解 酶 , 能 水 解 菌 体 细 胞 壁 的 主 要 化 学 成 分 肽 聚 糖 中 的 β-1,4糖 苷 键 , 因 而 具 有 溶 菌 的 作 用 。 当 溶 液 中 PH 小 于 8 时 , 溶 菌 酶 作 用 受 到 抑 制 。葡 萄 糖 : 增 加 溶 液 的 粘 度 , 维 持 渗 透 压 , 防 止 DNA 受 机 械 切 力 作 用 降 解 。EDTA 的 作 用 :(1) 螯 合 Mg 2+ Ca 2+ 等 金 属 离 子 , 抑 制 脱 氧 核 酸 酶 对 DNA 的 降 解 作 用 (DNase 作 用时 需 要 一 定 的 金 属 离 子 作 辅 基 )。(2) EDTA 的 存 在 , 有 利 于 溶 菌 酶 的 作 用 , 因 为 溶 菌 酶 的 反 应 要 求 有 较 低 的 离 子 强度 的 环 境 。2. 溶 液 Ⅱ——NaOH-SDS 液 :NaOH: 核 酸 在 pH 大 于 5, 小 于 9 的 溶 液 中 , 是 稳 定 的 。 但 当 pH>12 或 pH

DNA 溶 液 是 DNA 以 水 合 状 态 稳 定 存 在 , 当 加 入 乙 醇 时 , 乙 醇 会 夺 DNA 周 围 的 水 分子 , 使 DNA 失 水 而 易 于 聚 合 . 一 般 实 验 中 , 是 加 2 倍 体 积 的 无 水 乙 醇 与 DNA 相 混 合 , 其 乙 醇的 最 终 含 量 占 67% 左 右 . 因 而 也 可 改 用 95% 乙 醇 来 替 代 无 水 乙 醇 ( 因 为 无 水 乙 醇 的 价 格 远远 比 95% 乙 醇 昂 贵 ). 但 是 加 95% 的 乙 醇 使 总 体 积 增 大 , 而 DNA 在 溶 液 中 有 一 定 程 度 的 溶解 , 因 而 DNA 损 失 也 增 大 , 尤 其 用 多 次 乙 醇 沉 淀 时 , 就 会 影 响 收 得 率 . 折 中 的 做 法 初 次 沉 淀DNA 时 可 用 95% 乙 醇 代 替 无 水 乙 醇 , 最 后 的 沉 淀 步 骤 要 使 用 无 水 乙 醇 . 也 可 以 用 0.6 倍 体积 的 异 丙 醇 选 择 性 沉 淀 DNA. 一 般 在 室 温 下 放 置 15-30 分 钟 即 可 .5. 在 用 无 水 乙 醇 沉 淀 DNA 时 , 为 什 么 一 定 要 加 NaAc 或 NaCl 至 最 终 浓 度 达 0.1~0.25mol/L?在 pH 为 8 左 右 的 DNA 溶 液 中 ,DNA 分 子 是 带 负 电 荷 的 , 加 一 定 浓 度 的 NaAc 或 NaCl, 使Na 2+ 中 和 DNA 分 子 上 的 负 电 荷 , 减 少 DNA 分 子 之 间 的 同 性 电 荷 相 斥 力 , 易 于 互 相 聚 合 而 形成 DNA 钠 盐 沉 淀 , 当 加 入 的 盐 溶 液 浓 度 太 低 时 , 只 有 部 分 DNA 形 成 DNA 钠 盐 而 聚 合 , 这 样就 造 成 DNA 沉 淀 不 完 全 , 当 加 入 的 盐 溶 液 浓 度 太 高 时 , 其 效 果 也 不 好 . 在 沉 淀 的 DNA 中 , 由于 过 多 的 盐 杂 质 存 在 , 影 响 DNA 的 酶 切 等 反 应 , 必 须 要 进 行 洗 涤 或 重 沉 淀 .6. 加 核 糖 核 酸 酶 降 解 核 糖 核 酸 后 , 为 什 么 再 要 用 SDS 与 KAc 来 处 理 ?加 进 去 的 RNase 本 身 是 一 种 蛋 白 质 , 为 了 纯 化 DNA, 又 必 须 去 除 之 , 加 SDS 可 使 它 们成 为 SDS- 蛋 白 复 合 物 沉 淀 , 再 加 KAc 使 这 些 复 合 物 转 变 为 溶 解 度 更 小 的 钾 盐 形 式 的SDS- 蛋 白 质 复 合 物 , 使 沉 淀 更 加 完 全 . 也 可 用 饱 和 酚 , 氯 仿 抽 提 再 沉 淀 , 去 除 RNase。 在溶 液 中 , 有 人 以 KAc 代 替 NaAc, 也 可 以 收 到 较 好 的 效 果 。7. 为 什 么 在 保 存 或 抽 提 DNA 过 程 中 , 一 般 采 用 TE 缓 冲 液 ?在 基 因 操 作 实 验 中 , 选 择 缓 冲 液 的 主 要 原 则 是 考 虑 DNA 的 稳 定 性 及 缓 冲 液 成 分 不 产生 干 扰 作 用 。 磷 酸 盐 缓 冲 系 统 (pKa=7.2) 和 硼 酸 系 统 (pKa=9.24) 等 虽 然 也 都 符 合 细 胞 内环 境 的 生 理 范 围 , 可 作 DNA 的 保 存 液 , 但 在 转 化 实 验 时 , 磷 酸 根 离 子 的 种 类 及 数 量 将 与 Ca 2+产 生 Ca 3 (PO 4 ) 2 沉 淀 ; 在 DNA 反 应 时 , 不 同 的 酶 对 辅 助 因 子 的 种 类 及 数 量 要 求 不 同 , 有 的 要求 高 离 子 浓 度 , 有 的 则 要 求 低 盐 浓 度 , 采 用 Tris-HCL(pKa=8.0) 的 缓 冲 系 统 , 由 于 缓 冲 液 是TrisH + /Tris, 不 存 在 金 属 离 子 的 干 扰 作 用 , 故 在 提 取 或 保 存 DNA 时 , 大 都 采 用 Tris-HCl 系 统 ,而 TE 缓 冲 液 中 的 EDTA 更 能 稳 定 DNA 的 活 性 .8. 如 何 选 择 聚 乙 二 醇 (6000) 的 浓 度 来 沉 淀 DNA?采 用 PEG(6000) 沉 淀 DNA, 大 小 不 同 的 DNA 分 子 所 用 的 PEG 的 浓 度 也 不 同 ,PEG的 浓 度 低 , 选 择 性 沉 淀 DNA 分 子 量 大 , 大 分 子 所 需 PEG 的 浓 度 只 需 1% 左 右 , 小 分 子 所 需PEG 浓 度 高 达 20%. 本 实 验 选 择 性 沉 淀 4.3Kb 的 pBR322 质 粒 DNA, 每 毫 升 加 入 0.4 毫 升的 30%PEG, 其 最 终 PEG 浓 度 为 12%.PEG 选 择 性 沉 淀 DNA 的 分 辩 率 大 约 100bp.9. 抽 提 DNA 去 除 蛋 白 质 时 , 怎 样 使 用 酚 与 氯 仿 较 好 ?酚 与 氯 仿 是 非 极 性 分 子 , 水 是 极 性 分 子 , 当 蛋 白 水 溶 液 与 酚 或 氯 仿 混 合 时 , 蛋 白 质 分子 之 间 的 水 分 子 就 被 酚 或 氯 仿 挤 去 使 蛋 白 失 去 水 合 状 态 而 变 性 . 经 过 离 心 , 变 性 蛋 白 质 的密 度 比 水 的 密 度 为 大 , 因 而 与 水 相 分 离 , 沉 淀 在 水 相 下 面 , 从 而 与 溶 解 在 水 相 中 的 DNA 分开 . 而 酚 与 氯 仿 有 机 溶 剂 比 重 更 大 , 保 留 在 最 下 层 .作 为 表 面 变 性 的 酚 与 氯 仿 , 在 去 除 蛋 白 质 的 作 用 中 , 各 有 利 弊 , 酚 的 变 性 作 用 大 , 但 酚24

与 水 有 一 定 程 度 的 互 溶 , 大 约 10%~15% 的 水 溶 解 在 酚 相 中 , 因 而 损 失 了 这 部 分 水 相 中 的DNA, 而 氯 仿 的 变 性 作 用 不 如 酚 效 果 好 , 但 氯 仿 与 水 不 相 混 溶 , 不 会 带 走 DNA. 所 以 在 抽 提过 程 中 , 混 合 使 用 酚 与 氯 仿 效 果 最 好 . 经 酚 第 一 次 抽 提 后 的 水 相 中 有 残 留 的 酚 , 由 于 酚 与 氯仿 是 互 溶 的 , 可 用 氯 仿 第 二 次 变 性 蛋 白 质 , 此 时 一 起 将 酚 带 走 . 也 可 以 在 第 二 次 抽 提 时 , 将酚 与 氯 仿 混 合 (1:1) 使 用 .10. 为 什 么 用 酚 与 氯 仿 抽 提 DNA 时 , 还 要 加 少 量 的 异 戌 醇 ?在 抽 提 DNA 时 , 为 了 混 合 均 匀 , 必 须 剧 烈 振 荡 容 器 数 次 , 这 时 在 混 合 液 内 易 产 生 气 泡 ,气 泡 会 阻 止 相 互 间 的 充 分 作 用 . 加 入 异 戌 醇 能 降 低 分 子 表 面 张 力 , 所 以 能 减 少 抽 提 过 程 中的 泡 沫 产 生 . 一 般 采 用 氯 仿 与 异 戌 醇 为 24:1 之 比 . 也 可 以 采 用 酚 , 氯 仿 与 异 戌 醇 之 比 为25:24:1( 不 必 先 配 制 , 可 在 临 用 前 把 一 份 酚 加 入 一 份 24:1 的 氯 仿 互 异 戌 醇 即 成 ), 同 时 异 戌醇 有 助 于 分 相 , 使 离 心 后 的 上 层 水 相 , 中 层 变 性 蛋 白 相 以 及 下 层 有 机 溶 剂 相 维 持 稳 定 .11. 为 什 么 要 用 pH8 的 Tris 水 溶 液 饱 和 酚 ? 呈 粉 红 色 的 酚 可 否 使 用 ? 如 何 保 存 酚 不 被 空 气 氧化 ?因 为 酚 与 水 有 一 定 的 互 溶 . 苯 酚 用 水 饱 和 的 目 的 是 使 其 抽 提 DNA 过 程 中 , 不 致 吸 收样 品 中 含 有 DNA 的 水 分 , 减 少 DNA 的 损 失 . 用 Tris 调 节 至 pH 为 8 是 因 为 DNA 在 此 条 件下 比 较 稳 定 . 在 中 性 或 碱 性 条 件 下 (pH5~7),RNA 比 DNA 更 容 易 游 离 到 水 相 , 所 以 可 获 得RNA 含 量 较 少 的 DNA 样 品 .保 存 在 冰 箱 中 的 酚 , 容 易 被 空 气 氧 化 而 变 成 粉 红 色 , 这 样 的 酚 容 易 降 解 DNA, 一 般 不可 以 使 用 . 为 了 防 止 酚 的 氧 化 , 可 加 入 巯 基 乙 醇 和 8- 羟 基 喹 啉 至 终 浓 度 为 0.1%。8- 羟 基 喹啉 是 带 有 淡 黄 色 的 固 体 粉 末 , 不 仅 能 抗 氧 化 , 并 在 一 定 程 度 上 能 抑 制 Dnase 的 活 性 , 它 是金 属 离 子 的 弱 螯 合 剂 。 用 Tris pH8.0 水 溶 液 饱 和 后 的 酚 , 最 好 分 装 在 棕 色 小 试 剂 瓶 里 , 上 面盖 一 层 Tris 水 溶 液 或 TE 缓 冲 液 , 隔 绝 空 气 , 以 装 满 盖 紧 盖 子 为 宜 , 如 有 可 能 , 可 充 氮气 , 防 止 与 空 气 接 触 而 被 氧 化 。 平 时 保 存 在 4℃ 或 -20℃ 冰 箱 中 , 使 用 时 , 打 开 盖 子 吸 取后 迅 速 加 盖 , 这 样 可 使 酚 不 变 质 , 可 用 数 月 。25

实 验 九总 RNA 的 提 取 、 定 量 与 RT-PCR一 、 总 RNA 的 提 取 与 定 量目 的 :从 细 胞 中 分 离 RNA 是 分 子 生 物 学 实 验 经 常 进 行 的 操 作 之 一 , 所 提 取 RNA 的 质 量 是 进 行其 它 实 验 的 基 础 , 如 Northern 杂 交 , 目 的 基 因 cDNA 的 克 隆 , 荧 光 定 量 , 文 库 构 建 等 。原 理 :在 哺 乳 动 物 中 , 平 均 每 个 细 胞 内 大 约 含 有 10 -5 g RNA, 其 中 rRNA 占 总 量 的 80%-85%,tRNA 和 核 内 小 分 子 RNA 占 10-15%, 而 mRNA 只 占 1-5%。rRNA 由 28S、18S、5S 等 几 类 组成 , 这 些 RNA 分 子 根 据 密 度 和 分 子 大 小 , 通 过 密 度 梯 度 离 心 、 凝 胶 电 泳 、 离 子 交 换 层 析 进行 分 离 。mRNA 分 子 种 类 繁 多 , 分 子 量 大 小 不 均 一 , 在 细 胞 中 含 量 少 , 绝 大 多 数 mRNA 分 子( 除 血 红 蛋 白 、 有 些 组 蛋 白 mRNA 以 外 ), 在 3’ 端 存 在 20-250 个 多 聚 腺 苷 酸 (polyA)。 利 用 此特 点 , 用 oligo(dT) 亲 和 层 析 柱 分 离 mRNA。RNA 分 离 的 方 法 有 : 异 硫 氰 酸 胍 氯 化 铯 超 速 离 心 法 , 盐 酸 胍 - 有 机 溶 剂 法 , 氯 化 锂 - 尿素 法 , 蛋 白 酶 K- 细 胞 质 RNA 提 取 法 等 、 异 硫 氰 酸 胍 - 酚 - 氯 仿 一 步 法 等 。 目 前 常 用 的 是 Trizol法 。Trizol 试 剂 适 用 于 从 细 胞 和 组 织 中 快 速 分 离 RNA。TRIzol 的 主 要 成 分 是 异 硫 氰 酸 胍 和酚 。 异 硫 氰 酸 胍 属 于 解 偶 剂 , 是 一 类 强 力 的 蛋 白 质 变 性 剂 , 可 溶 解 蛋 白 质 主 要 作 用 是 裂 解 细胞 , 使 细 胞 中 的 蛋 白 , 核 酸 物 质 解 聚 得 到 释 放 。 酚 虽 可 有 效 的 变 性 蛋 白 质 , 但 是 它 不 能 完 全抑 制 RNA 酶 活 性 , 因 此 Trizol 中 还 加 入 了 8- 羟 基 喹 啉 、β- 巯 基 乙 醇 等 来 抑 制 内 源 和 外 源RNase。 在 加 入 氯 仿 离 心 后 , 溶 液 分 为 水 相 和 有 机 相 ,RNA 选 择 性 地 进 入 无 DNA 和 蛋 白 质的 水 相 中 。 取 出 水 相 用 异 丙 醇 沉 淀 可 回 收 RNA; 用 乙 醇 沉 淀 中 间 层 可 回 收 DNA; 用 异 丙 醇沉 淀 有 机 相 可 回 收 蛋 白 质 。Trizol 试 剂 可 用 于 小 量 样 品 (50~100mg 组 织 、5×106 细 胞 ) 也 适 用 于 大 量 样 品 (≥1g组 织 、>10 7 细 胞 )。 对 人 , 动 物 , 植 物 组 织 , 细 菌 均 适 用 , 整 个 提 取 过 程 在 一 小 时 内 即 可 完成 。 分 离 的 总 RNA 无 蛋 白 质 和 DNA 污 染 , 可 用 于 Northern blot,dot blot,ployA 筛 选 , 体 外翻 译 ,RNase 保 护 分 析 和 分 子 克 隆 。 在 用 于 RT-PCR 时 如 果 两 条 引 物 存 在 于 一 个 单 一 外 显 子 内 ,建 议 用 无 RNase 的 DNaseⅠ 处 理 RNA 样 品 , 避 免 出 现 假 阳 性 。 共 纯 化 的 DNA 可 用 作 标 准 , 比较 不 同 样 品 RNA 的 得 率 , 也 可 用 于 PCR 和 酶 切 。 蛋 白 质 可 用 于 western blotting。核 酸 的 最 大 吸 收 波 长 为 260nm, 蛋 白 质 为 280nm, 在 波 长 260nm 时 ,1OD 值 相 当 于 双链 DNA 浓 度 为 50μg/ml, 单 链 DNA 和 RNA 浓 度 为 40μg/ml, 单 链 寡 核 苷 酸 的 含 量 为 33μg/ml,可 以 据 此 来 计 算 核 酸 样 品 的 浓 度 , 还 可 通 过 测 定 在 260nm 和 280nm 的 OD 值 的 比 值(OD 260 /OD 280 ), 估 计 核 酸 的 纯 度 。 纯 净 DNA 的 比 值 为 1.8, RNA 为 2.0。 若 样 品 中 含 有 酚 和蛋 白 质 将 导 致 比 值 降 低 。270nm 存 在 高 吸 收 表 明 有 酚 的 干 扰 。 紫 外 分 光 光 度 法 只 能 用 于 测定 浓 度 大 于 0.25μg/ml 的 核 酸 溶 液 , 对 浓 度 更 小 的 样 品 , 可 采 用 荧 光 分 光 光 度 法 。仪 器 和 主 要 试 剂 :26

1. 紫 外 分 光 光 度 计 、 微 量 加 样 枪 、 灭 菌 超 薄 PCR 反 应 管2. Trizol 试 剂3. 氯 仿4. 异 丙 醇5. 75℅ 乙 醇6. 无 RNase 的 水 或 0.5℅SDS ( 溶 液 均 需 用 DEPC 处 理 过 的 水 配 制 )实 验 方 法 :( 一 )RNA 提 取1. 匀 浆 处 理 :a. 组 织 将 组 织 在 液 氮 中 磨 碎 , 每 50-100mg 组 织 加 入 1ml Trizol, 用 匀 浆 仪 进 行 匀 浆 处理 。 样 品 体 积 不 应 超 过 Trizol 体 积 10℅。b. 单 层 培 养 细 胞 直 接 在 培 养 板 中 加 入 Trizol 裂 解 细 胞 , 每 10cm 2 面 积 加 1ml, 用 移液 器 吸 打 几 次 。Trizol 的 用 量 应 根 据 培 养 板 面 积 而 定 , 不 取 决 于 细 胞 数 。Trizol 加 量 不 足 可 能导 致 提 取 的 RNA 有 DNA 污 染 。c. 细 胞 悬 液 离 心 收 集 细 胞 , 每 5-10×10 6 动 物 、 植 物 、 酵 母 细 胞 或 1×10 7 细 菌 细 胞 加 入1ml Trizol, 反 复 吸 打 。 加 Trizol 之 前 不 要 洗 涤 细 胞 以 免 mRNA 降 解 。 一 些 酵 母 和 细 菌 细 胞 需用 匀 浆 仪 处 理 。( 注 意 : 匀 浆 一 定 要 彻 底 , 是 提 取 高 质 量 RNA 的 前 提 ; 细 胞 数 量 与 Trizol 的 比 例 ,细 胞 的 数 量 不 能 过 多 。)2. 将 匀 浆 样 品 在 室 温 (15-30℃) 放 置 5 min, 使 核 酸 蛋 白 复 合 物 完 全 分 离 。3. 可 选 步 骤 : 如 样 品 中 含 有 较 多 蛋 白 质 , 脂 肪 , 多 糖 或 胞 外 物 质 ( 肌 肉 , 植 物 结 节 部 分等 ) 可 于 2-8 ℃ 10000×g 离 心 10 min, 取 上 清 。 离 心 得 到 的 沉 淀 中 包 括 细 胞 外 膜 , 多 糖 ,高 分 子 量 DNA, 上 清 中 含 有 RNA。 处 理 脂 肪 组 织 时 , 上 层 有 大 量 油 脂 应 去 除 。 取 澄 清 的 匀浆 液 进 行 下 一 步 操 作 。4. 每 使 用 1ml Trizol 加 入 0.2ml 氯 仿 , 剧 烈 振 荡 15s, 室 温 放 置 3 min。( 注 意 : 此 步 振 荡 非 常 重 要 , 建 议 在 旋 涡 振 荡 器 上 进 行 。)5. 2-8℃10000×g 离 心 15 min。 样 品 分 为 三 层 : 底 层 为 黄 色 ( 红 或 绿 ) 有 机 相 , 上 层 为无 色 水 相 和 一 个 中 间 层 。RNA 主 要 在 水 相 中 , 水 相 体 积 约 为 所 用 Trizol 试 剂 的 60℅。6. 把 水 相 转 移 到 新 管 中 ( 如 要 分 离 DNA 和 蛋 白 质 可 保 留 有 机 相 ), 用 异 丙 醇 沉 淀 水 相中 的 RNA。 每 使 用 1ml Trizol 加 入 0.5ml 异 丙 醇 , 室 温 放 置 10 min。7. 2-8℃10000g 离 心 10 min, 离 心 前 看 不 出 RNA 沉 淀 , 离 心 后 在 管 侧 和 管 底 出 现 胶 状 沉淀 。 移 去 上 清 。8. 用 75℅ 乙 醇 洗 涤 RNA 沉 淀 。 每 使 用 1ml Trizol 至 少 加 1ml 75℅ 乙 醇 。2-8℃ 不 超 过7500g 离 心 5 min, 弃 上 清 。9. 室 温 放 置 干 燥 或 真 空 抽 干 RNA 沉 淀 , 不 要 晾 得 过 干 , 否 则 不 易 溶 解 , 大 约 晾 5-10min。加 入 25-200l 无 RNase 的 水 ,-70℃ 保 存 。( 二 ) 紫 外 吸 收 检 测 RNA 的 浓 度 和 纯 度27

1. 紫 外 分 光 光 度 计 先 用 水 在 260nm 和 280nm 两 个 波 长 下 校 零 。2. 取 RNA 样 品 5μl, 用 水 稀 释 50~100 倍 , 转 入 分 光 光 度 计 的 石 英 比 色 杯 中 。3. 在 260nm 和 280nm 分 别 读 出 样 品 OD 值 。 根 据 260nm 时 1 OD 单 位 的 单 链 RNA =40μg/ml 和 稀 释 倍 数 , 可 以 计 算 出 样 品 RNA 的 浓 度 和 产 量 。4. 若 OD 260 /OD 280 小 于 2, 说 明 可 能 有 DNA 片 段 污 染 , 可 以 考 虑 用 无 RNase 的 DNase 处 理样 品 , 若 小 于 1.8, 说 明 样 品 中 还 可 能 含 有 蛋 白 质 或 酚 , 应 再 用 酚 / 氯 仿 抽 提 , 以 乙 醇 沉 淀 纯化 RNA。注 意 事 项 :1. 从 少 量 样 品 (1-10mg 组 织 或 10 2 -10 4 细 胞 ) 中 提 取 RNA 是 可 加 入 少 许 糖 原 以 促 进 RNA沉 淀 。 例 如 加 1ml Trizol 匀 浆 样 品 , 沉 淀 RNA 前 加 5-10g RNase-free 糖 原 。 糖 原 会 与 RNA 一同 沉 淀 出 来 , 糖 原 浓 度 不 高 于 4mg/ml 是 不 影 响 第 一 链 的 合 成 , 也 不 影 响 PCR 反 应 。2. 匀 浆 后 加 氯 仿 之 前 样 品 可 在 -60~-70℃ 保 存 至 少 一 个 月 。RNA 沉 淀 可 保 存 在 75% 酒精 中 2-8℃ 一 个 星 期 以 上 或 -5--20℃ 一 年 以 上 。3. 预 期 产 量 :1mg 组 织 或 1×10 6 细 胞 提 取 RNA 分 别 为 :肝 和 脾 6-10g, 肾 3-4g, 骨 骼 肌 和 脑 组 织 1-1.5g, 胎 盘 1-4g, 上 皮 细 胞 8-15g,成 纤 维 细 胞 5-7g。4. 蛋 白 聚 糖 和 多 糖 污 染 :沉 淀 RNA 的 过 程 中 作 以 下 改 进 可 去 除 这 些 污 染 , 步 骤 7 中 , 每 使 用 1ml Trizol 在 水 相 中加 0.25ml 异 丙 醇 和 0.25ml 高 盐 溶 液 (0.8mol/L 柠 檬 酸 钠 和 1.2mol/L NaCl) 混 合 离 心 , 按 之 前操 作 进 行 。 这 种 方 法 可 使 蛋 白 聚 糖 和 多 糖 留 在 溶 液 中 , 高 效 沉 淀 出 纯 RNA。 从 含 有 大 量 多糖 的 植 物 中 提 取 RNA 时 应 在 匀 浆 后 离 心 , 并 加 上 以 上 操 作 步 骤 。5. 预 防 RNase 污 染 措 施 :1) 经 常 更 换 新 手 套 , 皮 肤 上 常 带 有 的 细 菌 , 霉 菌 可 能 成 为 RNase 的 来 源 。2) 使 用 灭 过 菌 的 RNA 专 用 塑 料 制 品 避 免 交 叉 污 染 。3) RNA 在 Trizol 试 剂 中 时 不 会 被 RNase 污 染 , 但 提 取 后 继 续 处 理 过 程 中 应 使 用 不 含RNase 的 塑 料 和 玻 璃 器 皿 。 玻 璃 器 皿 可 在 150℃ 烘 烤 4 小 时 , 塑 料 制 品 可 在 0.5mol/L NaOH中 浸 泡 10 分 钟 , 然 后 用 水 彻 底 清 洗 , 高 压 灭 菌 , 即 可 去 除 RNase。4) 配 制 溶 液 应 使 用 无 RNase 的 水 ( 将 水 加 入 处 理 过 不 含 RNase 的 玻 璃 瓶 中 , 加 入 DEPC至 终 浓 度 0.01℅v/v, 放 置 过 夜 , 高 压 灭 菌 。 注 :DEPC 有 致 癌 之 嫌 , 需 小 心 操 作 。RNA 的 提 取 常 见 问 题 分 析问 题 解 析得 率 低A. 样 品 裂 解 或 匀 浆 处 理 不 彻 底B.RNA 沉 淀 未 完 全 溶 解A 260 /A 280

B. 样 品 匀 浆 时 加 的 试 剂 量 太 少C. 匀 浆 样 品 时 未 在 室 温 放 置 5 分 钟 。D. 吸 取 水 相 时 混 了 有 机 相E.RNA 沉 淀 未 完 全 溶 解 。RNA 降 解A. 组 织 取 出 后 没 有 马 上 处 理 或 冷 冻B. 待 提 取 RNA 的 样 品 没 有 保 存 于 -60 至 -70℃, 而 保 存 在 了 -5 至-20℃C. 细 胞 在 胰 酶 处 理 时 过 度D. 溶 液 或 离 心 管 未 经 RNase 去 除 处 理DNA 污 染A. 样 品 匀 浆 时 加 的 试 剂 量 太 少B. 样 品 中 含 有 有 机 溶 剂 ( 如 乙 醇 ,DMSO 等 ), 强 缓 冲 液 或 碱 性 溶 液二 、 逆 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)原 理 :提 取 组 织 或 细 胞 中 的 总 RNA, 以 其 中 的 mRNA 作 为 模 板 , 采 用 Oligo(dT) 或 随 机 引物 利 用 逆 转 录 酶 反 转 录 成 cDNA。 再 以 cDNA 为 模 板 进 行 PCR 扩 增 , 而 获 得 目 的 基 因 或 检测 基 因 表 达 。RT-PCR 使 RNA 检 测 的 灵 敏 性 提 高 了 几 个 数 量 级 , 使 一 些 极 为 微 量 RNA 样 品分 析 成 为 可 能 。 该 技 术 主 要 用 于 : 分 析 基 因 的 转 录 产 物 、 获 取 目 的 基 因 、 合 成 cDNA 探 针 、构 建 RNA 高 效 转 录 系 统 。( 一 ) 反 转 录 酶 的 选 择1. Money 鼠 白 血 病 病 毒 (MMLV) 反 转 录 酶 : 有 强 的 聚 合 酶 活 性 ,RNA 酶 H 活 性 相对 较 弱 。 最 适 作 用 温 度 为 37℃。2. 禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 (AMV) 反 转 录 酶 : 有 强 的 聚 合 酶 活 性 和 RNA 酶 H 活 性 。 最 适作 用 温 度 为 42℃。3.Thermus thermophilus、Thermus flavus 等 嗜 热 微 生 物 的 热 稳 定 性 反 转 录 酶 : 在 Mn 2+ 存在 下 , 允 许 高 温 反 转 录 RNA, 以 消 除 RNA 模 板 的 二 级 结 构 。4.MMLV 反 转 录 酶 的 RNase H- 突 变 体 : 商 品 名 为 Superscript 和 SuperScriptⅡ。 此 种 酶较 其 它 酶 能 多 将 更 大 部 分 的 RNA 转 换 成 cDNA, 这 一 特 性 允 许 从 含 二 级 结 构 的 、 低 温 反 转录 很 困 难 的 mRNA 模 板 合 成 较 长 cDNA。( 二 ) 合 成 cDNA 引 物 的 选 择1. 随 机 六 聚 体 引 物 : 当 特 定 mRNA 由 于 含 有 使 反 转 录 酶 终 止 的 序 列 而 难 于 拷 贝 其 全 长序 列 时 , 可 采 用 随 机 六 聚 体 引 物 这 一 不 特 异 的 引 物 来 拷 贝 全 长 mRNA。 用 此 种 方 法 时 , 体系 中 所 有 RNA 分 子 全 部 充 当 了 cDNA 第 一 链 模 板 ,PCR 引 物 在 扩 增 过 程 中 赋 予 所 需 要 的 特29

异 性 。 通 常 用 此 引 物 合 成 的 cDNA 中 96% 来 源 于 rRNA。2. Oligo(dT): 是 一 种 对 mRNA 特 异 的 方 法 。 因 绝 大 多 数 真 核 细 胞 mRNA 具 有 3’ 端Poly(A+) 尾 , 此 引 物 与 其 配 对 , 仅 mRNA 可 被 转 录 。 由 于 Poly(A+)RNA 仅 占 总 RNA 的 1-4%,故 此 种 引 物 合 成 的 cDNA 比 随 机 六 聚 体 作 为 引 物 和 得 到 的 cDNA 在 数 量 和 复 杂 性 方 面 均 要小 。3. 特 异 性 引 物 : 最 特 异 的 引 发 方 法 是 用 含 目 标 RNA 的 互 补 序 列 的 寡 核 苷 酸 作 为 引 物 ,若 PCR 反 应 用 二 种 特 异 性 引 物 , 第 一 条 链 的 合 成 可 由 与 mRNA 3’ 端 最 靠 近 的 配 对 引 物 起始 。 用 此 类 引 物 仅 产 生 所 需 要 的 cDNA, 导 致 更 为 特 异 的 PCR 扩 增 。仪 器 和 主 要 试 剂 :1. 基 因 扩 增 仪 ( 如 PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700)、 微 量 加 样 枪 、 灭 菌 超 薄 PCR反 应 管2.RNA 提 取 试 剂3. 第 一 链 cDNA 合 成 试 剂 盒4.dNTP mix: 含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2 mmol/L5.Taq DNA 聚 合 酶实 验 方 法 :1. 总 RNA 的 提 取 : 见 前 述 内 容 。2. cDNA 第 一 链 的 合 成 : 目 前 试 剂 公 司 有 多 种 cDNA 第 一 链 试 剂 盒 出 售 , 其 原 理 基 本 相同 , 但 操 作 步 骤 不 一 。 现 以 TAKARA 公 司 提 供 的 PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试 剂 盒 为 例 。(1) 在 0.2ml 微 量 离 心 管 中 , 加 入 以 下 :总 RNA 1-5 gdNTP1lRandom primer 1l补 充 适 量 的 DEPC H 2 O 使 总 体 积 达 10 l。 轻 轻 混 匀 、 离 心 。(2)PCR 仪 上 65℃ 加 热 5min, 立 即 将 微 量 离 心 管 插 入 冰 浴 中 至 少 1min。(3) 然 后 加 入 下 列 试 剂 的 混 合 物 :5×PrimeScript buffer 4 μlRNase inhibator 0.5 μlRTase1 μlRNase free H 2 O 4.5 μl轻 轻 混 匀 , 离 心 .(4) 30℃ 孵 育 10 min。(5) 42℃ 孵 育 60 min。(6) 于 70℃ 加 热 15 min 以 终 止 反 应 , 将 管 插 入 冰 中 。3.PCR:(1) 取 0.5ml PCR 管 , 依 次 加 入 下 列 试 剂 :30

第 一 链 cDNA2 μl上 游 引 物 (10pmol/L) 2 μl下 游 引 物 (10pmol/L) 2 μldNTP(2mmol/L)4 μl10×PCR buffer5 μlTaq 酶 (2U/μl) 1 μl(2) 加 入 适 量 的 ddH 2 O, 使 总 体 积 达 50 μl。 轻 轻 混 匀 , 离 心 。(3) 设 定 PCR 程 序 。 在 适 当 的 温 度 参 数 下 扩 增 28-32 个 循 环 。 为 了 保 证 实 验 结 果 的 可靠 与 准 确 , 可 在 PCR 扩 增 目 的 基 因 时 , 加 入 一 对 内 参 ( 如 G-3-PD) 的 特 异 性 引 物 , 同 时 扩增 内 参 DNA, 作 为 对 照 。(4) 电 泳 鉴 定 : 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 , 紫 外 灯 下 观 察 结 果 。(5) 结 果 分 析 : 采 用 凝 胶 图 像 分 析 系 统 , 对 电 泳 条 带 扫 描 分 析 。注 意 事 项 :1. 在 实 验 过 程 中 要 防 止 RNA 的 降 解 , 保 持 RNA 的 完 整 性 。 在 总 RNA 的 提 取 过 程 中 ,注 意 避 免 mRNA 的 断 裂 。2. 为 了 防 止 非 特 异 性 扩 增 , 必 须 设 阴 性 对 照 。3. 内 参 的 设 定 : 主 要 为 了 用 于 靶 RNA 的 定 量 。 常 用 的 内 参 有 G-3-PD(3- 磷 酸 甘 油 醛脱 氢 酶 )、β-Actin(β- 肌 动 蛋 白 ) 等 。 其 目 的 在 于 避 免 RNA 定 量 误 差 、 加 样 误 差 以 及 各PCR 反 应 体 系 中 扩 增 效 率 不 均 一 各 孔 间 的 温 度 差 等 所 造 成 的 误 差 。4. PCR 不 能 进 入 平 台 期 , 出 现 平 台 效 应 与 所 扩 增 的 目 的 基 因 的 长 度 、 序 列 、 二 级 结 构以 及 目 标 DNA 起 始 的 数 量 有 关 。 故 对 于 每 一 个 目 标 序 列 出 现 平 台 效 应 的 循 环 数 , 均 应 通 过单 独 实 验 来 确 定 。5. 防 止 DNA 的 污 染 :(1) 采 用 DNA 酶 处 理 RNA 样 品 。(2) 在 可 能 的 情 况 下 , 将 PCR 引 物 置 于 基 因 的 不 同 外 显 子 , 消 除 基 因 和 mRNA 的 共 线性 。附 注 :(1)-actin 引 物 序 列 :sense5-ACCATGGATGATGATATCGCC-3antisense 5-GTGCCAGATTTTCTCCATGTC-3片 段 长 度 264(71-334)(2) 目 的 基 因 GAPDH 引 物 序 列sense 5' ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG 3'antisense 5' CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG 3'片 段 长 度 :480(103-582)31

实 验 十生 物 化 学 自 主 设 计 性 实 验目 的 要 求 :引 导 学 生 自 主 学 习 生 命 科 学 专 业 知 识 , 提 高 学 生 综 合 设 计 实 验 、 分 析 解 决 问 题 和 实 践 操作 能 力 , 培 养 学 生 创 新 意 识 及 团 队 精 神 。1. 明 确 本 课 程 的 意 义 、 目 的 和 要 求 , 依 靠 自 己 的 努 力 , 综 合 运 用 所 学 的 知 识 和 技 能 ,在 老 师 指 导 下 独 立 地 、 保 质 保 量 地 完 成 课 程 任 务2. 各 小 组 发 挥 团 队 精 神 , 既 有 分 工 、 又 有 协 作 , 自 我 组 织 协 调 好 课 程 过 程 中 的 各 项 工作 。3. 课 程 结 束 后 , 每 个 小 组 完 成 一 篇 学 习 心 得 , 总 结 通 过 本 实 验 项 目 学 习 所 取 得 的 收 获和 体 会 , 存 在 的 不 足 之 处 , 以 便 不 断 完 善 该 课 程 。 另 外 , 在 网 上 也 开 设 了 该 课 程 的 论 坛 , 鼓励 大 家 在 上 面 发 表 感 想 体 会 , 也 可 以 在 课 程 进 行 中 互 相 交 流 。课 程 安 排 :1. 自 由 组 合 小 组 成 员 ( 四 人 一 小 组 , 原 则 上 专 业 内 组 合 )。2. 按 设 计 性 实 验 要 求 进 行 选 题 。3. 查 阅 资 料 , 讨 论 实 验 设 计 , 撰 写 实 验 设 计 书 , 上 交 。4. 实 验 设 计 书 评 分 ( 由 老 师 根 据 设 计 方 案 的 目 的 性 、 科 学 性 创 新 性 和 可 行 性 进 行 初 审 )5. 进 行 课 堂 报 告 , 对 实 验 方 案 进 行 论 证 ( 以 汇 报 、 提 问 、 答 辩 为 主 )。自 主 设 计 性 实 验 考 核 优 秀 者 ( 及 有 兴 趣 者 ) 可 参 加 以 下 课 程 及 比 赛 :1. 确 定 指 导 老 师 , 对 优 秀 设 计 书 进 行 修 改2. 参 加 春 季 生 化 实 验 选 修 课 程 , 开 展 实 验 , 对 实 验 操 作 评 比 ( 学 校 生 化 实 验 技 能 大 赛 )3. 评 出 的 优 秀 选 手 推 荐 参 加 省 生 化 技 能 大 赛 。4. 参 与 生 化 实 验 教 学 辅 助 工 作5. 进 入 本 科 生 创 新 教 育 基 地 , 开 展 课 外 课 题 研 究 。选 题 → 上 交 设 计 书 → 评 比 → 开 题 报 告 → 实 验 操 作 评 比 ( 校 赛 )→ 选 送 省 赛 → 辅 助 实 验 教 学及 创 新 基 地设 计 性 实 验 要 求 :( 一 ) 实 验 设 计 书 要 求要 求 每 组 学 生 认 真 查 阅 国 内 外 相 关 文 献 10 篇 左 右 , 要 求 在 设 计 书 中 列 出 的 参 考 文 献 不能 少 于 5 篇 , 选 择 研 究 题 目 、 拟 定 实 验 方 案 , 各 小 组 按 照 设 计 书 格 式 要 求 ( 见 附 一 ) 独 立 完 成实 验 设 计 书 , 于 规 定 时 间 上 交 实 验 设 计 书 ( 打 印 稿 与 电 子 稿 ), 由 评 阅 老 师 对 实 验 设 计 书 进行 评 定 。( 二 ) 课 堂 报 告 要 求各 小 组 选 派 一 人 用 PPT 形 式 在 全 班 汇 报 该 组 的 实 验 方 案 , 其 他 组 员 可 作 补 充 , 全 组 成 员听 取 和 答 复 老 师 、 其 他 小 组 的 提 问 和 建 议 。32

汇 报 地 点 : 生 物 化 学 实 验 室( 三 ) 具 体 要 求1. 设 计 实 验 题 目 的 选 定 和 文 献 查 阅1 根 据 布 置 题 目 、 关 键 词 及 所 学 知 识 自 选 一 个 设 计 实 验 题 目 ;2 通 过 各 种 检 索 工 具 和 方 法 查 找 相 关 文 献 , 特 别 是 英 文 文 献 检 索 , 对 文 献 进 行 总 结 , 写成 小 综 述 。2. 实 验 方 案 的 拟 定在 查 阅 参 考 资 料 和 写 作 小 综 述 的 基 础 上 , 运 用 所 学 过 的 理 论 知 识 和 基 础 实 验 知 识 , 拟 定实 验 设 计 方 案 。方 案 包 含 以 下 几 部 分 :1 实 验 原 理 ;2 所 需 试 剂 以 及 所 需 溶 液 的 配 制 方 法 ;3 所 需 要 的仪 器 设 备 ;4 实 验 步 骤 ;5 实 验 数 据 的 处 理 方 法 和 表 格 设 计 ;6 参 考 文 献 。实 验 设 计 方 案 拟 定 后 , 独 立 完 成 实 验 设 计 书 。3. 实 验 过 程 的 实 施实 验 设 计 书 经 指 导 老 师 进 行 审 阅 、 实 验 小 组 讨 论 , 再 进 行 修 改 完 善 定 稿 , 经 实 验 指 导 老师 签 字 , 方 可 进 入 实 验 室 按 实 验 设 计 方 案 进 行 实 验 。明 确 实 验 的 具 体 步 骤 和 注 意 事 项 , 独 立 完 成 实 验 , 认 真 详 细 记 录 实 验 过 程 中 出 现 的 实 验现 象 和 实 验 数 据 , 对 实 验 数 据 进 行 简 单 计 算 和 分 析 。4. 实 验 报 告 的 撰 写对 所 获 实 验 结 果 进 行 数 据 处 理 , 分 析 实 验 结 果 , 得 出 结 论 。 在 此 基 础 上 , 独 立 撰 写 论 文 。注 :3、4 项 暂 不 进 行 ( 考 核 优 秀 者 参 加 )( 四 ) 选 题 范 围1. 物 质 提 取 类如 从 柑 橘 皮 中 提 取 果 胶 ; 从 果 蔬 中 提 取 类 胡 萝 卜 素 ; 从 芦 荟 中 提 取 碳 水 化 合 物 ; 从 鸡 蛋清 中 提 取 某 蛋 白 等 。2. 物 质 检 验 类如 检 验 市 面 上 某 几 种 品 牌 牛 奶 是 否 掺 假 ; 检 验 市 面 上 某 几 种 食 品 是 否 含 有 防 腐 剂 等 。3. 物 质 含 量 测 定 类如 洗 衣 粉 磷 含 量 的 分 析 ; 比 较 几 种 饲 料 中 某 物 质 的 含 量 等 。4. 探 索 物 质 在 某 一 方 面 的 应 用如 探 索 蛋 白 酶 对 草 菇 保 鲜 的 影 响 机 理 ; 探 索 木 瓜 蛋 白 酶 在 食 物 色 氨 酸 测 定 上 的 应 用 等 。5. 比 较 不 同 品 牌 物 质 的 价 值如 对 不 同 品 牌 螺 旋 藻 片 营 养 成 分 测 定 和 营 养 价 值 的 评 价 测 定 ; 对 不 同 品 牌 饲 料 中 营 养 价值 比 较 等 。6. 其 他 感 兴 趣 的 方 面( 五 ) 注 意 事 项1. 每 组 只 能 上 交 一 份 实 验 设 计 书 。2. 实 验 方 案 要 求 具 有 一 定 的 科 学 性 、 实 用 性 、 创 造 性 和 安 全 性 , 具 有 较 强 的 实 际 意 义 ,以 创 新 及 紧 密 联 系 生 产 为 佳 , 同 时 在 实 验 室 内 的 可 操 作 性 强 。33

3. 实 验 方 案 中 所 用 试 剂 中 严 禁 使 用 剧 毒 、 危 险 药 品 , 实 验 用 品 中 严 禁 使 用 易 爆 装 置 。评 比 方 法 :分 三 部 分 计 分 , 第 一 部 分 得 分 为 实 验 设 计 书 评 分 , 第 二 部 分 课 堂 答 辩 得 分 , 为 汇 报 当 日过 程 中 的 报 告 、PPT 制 作 及 答 辩 等 评 分 。 第 三 部 分 个 人 贡 献 度 评 分 。1. 实 验 设 计 书 占 40%, 小 组 得 分 每 个 成 员 相 同 ;2. 课 堂 答 辩 占 40%, 小 组 得 分 每 个 成 员 相 同 , 但 小 组 中 汇 报 人 与 其 他 成 员 根 据 其 答 辩中 表 现 酌 情 加 分 。3. 个 人 贡 献 度 (20%)衡 量 每 位 同 学 在 整 个 课 程 过 程 中 的 参 与 程 度 , 包 括 查 阅 文 献 、 实 验 设 计 、 撰 写 论 文 、课 堂 报 告 等 方 面 。 本 部 分 成 绩 由 个 人 自 评 , 组 员 互 评 、 老 师 核 准 产 生 , 记 入 每 一 人 的 成 绩中 。张 1 王 2 李 3 赵 4查 阅 文 献(100)实 验 设 计(100)撰 写 论 文(100)课 堂 报 告(100)50 20 3020 50 3030 20 5050 20 30合 计 80×20% 110×20% 100×20% 110×20%★ 如 果 每 组 成 员 >4 人 或

附 一 :实 验 设 计 书 格 式 要 求一 、 排 版1、 页 面 设 置 : 页 边 距 上 下 左 右 各 用 2.4cm。2、 行 距 : 全 部 采 用 1.5 倍 行 距 。3、 页 码 : 每 页 下 端 居 中 , 全 部 采 用 阿 拉 伯 数 字 排 序 , 如 1,2,3 等 , 不 要 写 “ 第 1 页 ”或 “-1-” 等 。4、 页 眉 : 全 部 不 加 页 眉 。二 、 标 题1、 实 验 名 称 ( 居 中 、 三 号 宋 体 、 加 粗 )2、 小 组 成 员 资 料 ( 居 中 、 小 四 宋 体 ): 年 级 专 业 姓 名 学 号 ( 按 学 号 排 序 )三 、 摘 要1、“ 摘 要 ” 两 字 用 黑 体 加 粗 4 号 字 居 中 , 字 与 字 之 间 留 4 个 字 距 。 摘 要 正 文 用 宋 体 小4 号 字 。2、“ 关 键 词 ” 三 个 字 用 黑 体 加 粗 小 4 号 字 , 与 摘 要 正 文 左 对 齐 。3、 关 键 词 宋 体 小 4 号 字 , 各 关 键 词 之 间 空 2 个 字 距 , 且 不 加 标 点 符 号 。四 、 正 文(1、 前 言 ;2、 实 验 目 的 ;3、 实 验 原 理 ;4、 实 验 设 备 ;5、 实 验 材 料 及 试 剂 :a. 试剂 的 配 制 b. 材 料 的 处 理 ;6、 实 验 操 作 步 骤 ;7、 结 果 及 计 算 ;8、 注 意 事 项 ;9、 费 用 预 算 )1、 正 文 层 次 标 题 题 末 不 加 标 点 符 号 。 各 层 次 一 律 用 阿 拉 伯 字 连 续 编 号 , 如 :“1”,“2.1”,“3.1.2”, 一 律 左 顶 格 , 后 空 一 字 距 写 标 题 。 一 级 标 题 从 前 言 起 编 , 一 律 用 黑 体 加 粗4 号 字 , 左 顶 格 ; 二 级 标 题 用 黑 体 加 粗 小 4 号 字 , 左 顶 格 ; 三 级 标 题 用 楷 体 加 粗 小 4 号 字 ,左 顶 格 。2、 正 文 其 他 部 分 全 部 用 宋 体 小 4 号 字 。3、 图 题 放 图 下 方 居 中 , 用 阿 拉 伯 数 字 编 号 , 如 : 图 1, 图 号 后 不 加 任 何 符 号 , 空 1个 字 距 写 图 题 ; 表 题 放 表 上 方 居 中 , 用 阿 拉 伯 数 字 编 号 , 如 : 表 1, 表 号 后 不 加 任 何 符 号 ,空 1 个 字 距 写 表 题 。4、 文 中 的 拉 丁 学 名 采 用 右 斜 体 字 母 。五 、 参 考 文 献1、“ 参 考 文 献 ” 四 字 用 黑 体 加 粗 4 号 字 居 中 , 字 与 字 之 间 空 1 个 字 符 。2、 中 文 参 考 文 献 采 用 宋 体 小 4 号 字 , 英 文 参 考 文 献 采 用 Times New Roman 小 4 号 字 。六 、 附 录如 有 附 录 , 放 在 参 考 文 献 后 。“ 附 录 ” 两 字 用 黑 体 加 粗 4 号 字 居 中 , 字 与 字 之 间 留 4个 字 距 。附 二 :参 考 文 献 来 源35

1. 中 国 期 刊 网 (http://www.cnki.net)2. 中 国 期 刊 全 文 学 数 据 库3. 中 国 生 物 医 学 文 献 库36