目录实 验 三 血 清 ( 血 浆 ) 脂 蛋 白 的 测 定 ……………………………………………… 1实 验 四 蛋 白 质 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ……………………………………………… 4实 验 六 肝 糖 原 的 提 取 、 鉴 定 与 定 量 ( 操 作 考 核 )………………………………… 10实 验 七 质 粒 DNA 的 提 取 、 定 量 、 酶 切 与 PCR 鉴 定 ……………………………… 16实 验 九 总 RNA 的 提 取 、 定 量 与 RT-PCR………………………………………… 26实 验 十 生 物 化 学 自 主 设 计 性 实 验 …………………………………………………… 32
实 验 三血 清 ( 血 浆 ) 脂 蛋 白 的 测 定目 的 :掌 握 磷 钨 酸 镁 沉 淀 法 测 定 高 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 HDL-C 的 基 本 原 理 , 熟 悉 磷 钨 酸 镁 沉 淀法 测 定 HDL-C 的 手 工 法 操 作 过 程 。 了 解 磷 钨 酸 镁 沉 淀 法 测 定 HDL-C 对 判 断 高 脂 血 症 、 预 防 动脉 粥 样 硬 化 和 冠 心 病 的 重 要 生 理 意 义 。原 理 :在 脂 蛋 白 中 既 有 蛋 白 质 又 有 胆 固 醇 , 还 有 磷 脂 的 复 合 体 , 较 难 定 量 。 由 于 其 中 的 胆 固 醇含 量 较 为 稳 定 , 因 此 目 前 以 测 定 脂 蛋 白 中 胆 固 醇 总 量 的 方 法 作 为 脂 蛋 白 的 定 量 依 据 , 即 测 定HDL、LDL 或 VLDL 中 的 胆 固 醇 , 并 分 别 称 为 高 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 (HDL-C)、 低 密 度 脂 蛋 白 -胆 固 醇 (LDL-C) 或 极 低 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 (VLDL-C)。测 定 血 清 HDL-C 时 , 通 常 需 根 据 各 种 蛋 白 的 密 度 、 颗 粒 大 小 、 电 荷 等 , 采 用 超 速 离 心 法 、色 谱 法 、 电 泳 法 、 化 学 或 免 疫 沉 淀 法 将 HDL 与 其 他 脂 蛋 白 分 离 开 , 然 后 测 定 HDL 组 分 中 胆 固醇 的 含 量 。 美 国 疾 病 控 制 与 预 防 中 心 (CDC) 测 定 HDL-C 的 参 考 方 法 为 超 速 离 心 法 。 此 法 主要 用 于 靶 值 的 确 定 及 各 种 HDL-C 检 测 方 法 学 评 价 , 但 因 需 特 殊 仪 器 , 对 技 术 操 作 要 求 高 , 一般 实 验 室 难 以 开 展 。 色 谱 法 和 电 泳 法 因 仪 器 、 操 作 要 求 高 等 种 种 原 因 临 床 常 规 实 验 室 也 较 少应 用 , 多 用 于 脂 蛋 白 的 研 究 。临 床 实 验 测 定 HDL-C 的 方 法 大 致 分 为 以 下 三 类 。 第 一 类 为 化 学 沉 淀 法 。 常 用 的 沉 淀 剂 为聚 阴 离 子 / 多 阴 离 子 , 如 磷 钨 酸 (PTA)、 硫 酸 葡 聚 糖 (DS)、 肝 素 或 非 离 子 多 聚 体 如 聚 乙 二 醇(PEG) 与 某 些 两 价 阳 离 子 (Mg 2+ 、Ca 2+ 、Mn 2+ ) 联 合 使 用 。 最 早 为 美 国 国 立 卫 生 研 究 院 (NIH)所 采 用 的 肝 素 - 锰 沉 淀 法 (HM 法 ), 后 多 采 用 硫 酸 葡 聚 糖 - Mg 2+ (DS- Mg 2+ 法 )。 欧 洲 则 多 采 用磷 钨 酸 - 镁 沉 淀 法 (PTA- Mg 2+ 法 ) 和 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 (PEG 法 )。1995 年 中 华 医 学 会 检 验 分 会曾 在 国 内 推 荐 PTA- Mg 2+ 法 作 为 HDL-C 测 定 的 常 规 方 法 。 但 此 类 方 法 常 因 含 apoB 的 脂 蛋 白 组 分 ,沉 淀 不 完 全 而 导 致 结 果 假 性 偏 高 。 第 二 类 采 用 简 便 的 磁 珠 DS- Mg 2+ 法 , 省 去 了 离 心 步 骤 , 但需 要 特 殊 装 置 和 试 剂 而 不 适 于 推 广 应 用 。 第 三 类 为 匀 相 测 定 法 , 即 直 接 测 定 法 。 其 特 点 为 :标 本 用 量 少 , 不 需 沉 淀 处 理 , 可 用 于 自 动 生 化 分 析 仪 测 定 , 在 准 确 度 和 精 密 度 方 面 基 本 达 到美 国 国 家 胆 固 醇 教 育 计 划 (NCEP) 的 分 析 目 标 , 因 此 在 短 短 的 数 年 里 迅 速 为 临 床 实 验 室 采 用 。磷 钨 酸 - 镁 沉 淀 法 测 定 高 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 : 采 用 大 分 子 多 阴 离 子 化 合 物 ( 磷 钨 酸 盐 )与 两 价 阳 离 子 ( 镁 离 子 ) 作 学 沉 淀 剂 沉 淀 血 清 中 的 LDL、VLDL 和 Lp(a) 后 , 上 清 液 中 只 含 有HDL, 然 后 用 酶 法 测 定 其 中 的 胆 固 醇 含 量 , 即 血 清 中 胆 固 醇 酯 可 被 胆 固 醇 酯 酶 水 解 为 游 离 胆固 醇 和 游 离 脂 肪 酸 (FFA), 胆 固 醇 在 胆 固 醇 氧 化 酶 的 氧 化 作 用 下 生 成 △4- 胆 甾 烯 酮 和 过 氧 化氢 , 过 氧 化 氢 在 4- 氨 基 安 替 比 林 和 酚 存 在 时 , 经 过 氧 化 物 酶 催 化 , 反 应 生 成 苯 醌 亚 胺 的 红色 醌 类 化 合 物 , 其 颜 色 深 浅 与 标 本 中 胆 固 醇 含 量 成 正 比 。主 要 器 材 :1. 试 管2. 加 样 枪3. 水 浴 箱1