本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

根 据 经 验 得 知 , 当 蛋 白 质 分 子 量 在 11.7-165KD 之 间 时 , 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 的 电 泳 迁 移率 与 蛋 白 质 分 子 量 的 对 数 成 线 性 关 系 , 符 合 直 线 方 程 式 ;lgMW=-bX+K(MW 为 蛋 白 质 的分 子 量 ,X 为 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 电 泳 的 相 对 迁 移 率 ,K 和 b 均 为 常 数 ), 将 已 知 分 子 量 的 标准 蛋 白 质 在 SDS-PAGE 中 电 泳 迁 移 率 对 分 子 量 的 对 数 作 图 , 即 可 得 到 一 条 标 准 曲 线 。 只 要测 得 未 知 分 子 量 的 蛋 白 质 在 相 同 条 件 下 的 电 泳 迁 移 率 , 就 能 根 据 标 准 曲 线 求 得 其 分 子 量 。仪 器 与 主 要 试 剂 :1. 主 要 器 材 :电 泳 仪 、 垂 直 电 泳 仪 、 进 样 器 、 镊 子 、 注 射 器 、 烧 杯 、 旋 涡 器 、 离 心 机2. 主 要 试 剂 :(1) 低 分 子 量 标 准 蛋 白 质 液 10l;(2) 菌 体 培 养 液 一 支 1.5ml宿 主 菌 :BL21;经 IPTG 诱 导 表 达 的 蛋 白 :F-box 蛋 白 ( 泛 素 相 关 蛋 白 ), 分 子 量 略 小 于 50KD。(3) 2× 蛋 白 质 样 品 缓 冲 液 , 组 成 如 下 :Tris 0.15gβ- 巯 基 乙 醇 1.0ml溴 酚 蓝 0.02g甘 油2.0mlSDS 0.4g蒸 馏 水7.0ml3. 试 剂 配 制 :30% 丙 烯 酰 胺 称 29g 丙 烯 酰 胺 ,1g 甲 叉 丙 烯 酰 胺 , 溶 于 蒸 馏 水 并 定 容 至100ml, 滤 纸 过 滤 后 置 棕 色 玻 璃 瓶 内 室 温 保 存10% 过 硫 酸 铵 1g 过 硫 酸 铵 溶 于 蒸 馏 水 定 容 至 10mlTEMEDN,N,N’,N’- 四 甲 基 乙 二 胺 , 棕 色 瓶 保 存上 胶 缓 冲 液1.0 mol/l Tris·Cl (pH6.8)。Tris12.1g, SDS0.4g 溶 于 60ml蒸 馏 水 , 用 盐 酸 调 pH6.8, 定 容 至 100ml下 胶 缓 冲 液1.5 mol/l Tris·Cl (pH8.8)。Tris18.2g, SDS0.4g 溶 于 60ml蒸 馏 水 , 用 盐 酸 调 pH8.8, 定 容 至 100ml1× 甘 氨 酸 电 泳 缓 冲 液 25mmol/L Tris(3.02g),250mmol/L 甘 氨 酸 (18.8g),0.1%SDS(1g), 加 蒸 馏 水 至 1000ml染 色 液0.5g 考 马 斯 亮 蓝 R250,90ml 甲 醇 ,20ml 冰 乙 酸 , 加 水 至 200ml脱 色 液与 染 色 液 成 分 相 似 , 无 考 马 斯 亮 蓝 R250实 验 方 法 :1. 安 装 电 泳 槽 凝 胶 装 置先 将 二 块 玻 璃 板 洗 干 净 , 干 燥 , 嵌 入 胶 带 的 凹 槽 中 , 装 在 电 极 槽 上 , 拧 紧 外 螺 丝 , 使 其 夹 紧( 不 能 过 紧 以 防 玻 璃 破 裂 ), 放 入 制 胶 架 固 定 , 留 待 灌 胶 。5