本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

限 制 性 内 切 酶 (TaKaRa): Hind III (15U/μl), EcoR I (12U/μl)酶 的 贮 存 缓 冲 液 : Hind III EcoR I10mM Tris-HCl 10mM Tris-HCl400mM KCl100mM KCl0.1mM EDTA 0.1mM EDTA1mM DTT 1mM DTT0.01% BSA 0.15% Triton X-10050% 甘 油 (pH 7.5) 0.01% BSA50% 甘 油 (pH 7.5)10 × Buffer: 100mM Tris-HCl(pH 7.5)100mM MgCl 210mM DTT500mM NaCl无 菌 去 离 子 水实 验 方 法 :在 0.5ml Eppendorf 管 中 按 顺 序 依 次 加 入 下 述 试 剂 , 混 匀 后 即 成 酶 切 反 应 体 系 :无 菌 去 离 子 水 :11μl10 × buffer 2μl质 粒 DNA5μl( 共 500ng)Hind III (15U/μl)1μlEcoR I (12U/μl)1μl共20μl将 反 应 管 置 37℃ 水 浴 1~3h反 应 结 束 后 取 10μl 反 应 产 物 以 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 检 测 并 观 察 结 果 , 酶 切 产 物 应 为不 同 大 小 的 两 个 片 段 。( 四 ) 质 粒 DNA 的 PCR 鉴 定主 要 试 剂 :2. DNA 模 板 : 质 粒 DNA( 含 靶 基 因 片 段 )3. 引 物 : A: 5’ GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’B: 5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC3’4. Taq 酶 :5U/μl5. 4×dNTP: 10mM each6. 10×buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3)7. MgCl 2 : 25mM8. 灭 菌 去 离 子 水实 验 方 法 :1. 准 备 PCR 反 应 溶 液 ( 最 好 于 冰 上 进 行 ):19