本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

实 验 四蛋 白 质 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳目 的 :掌 握 SDS-PAGE 的 基 本 原 理 , 学 会 使 用 该 方 法 来 分 析 所 表 达 的 蛋 白 质 , 蛋 白 质 大 小 、 形状 和 所 带 电 荷 不 同 , 在 SDS-PAGE 中 的 迁 移 率 就 不 同 , 因 此 可 采 用 该 方 法 来 推 算 所 表 达 的蛋 白 质 的 分 子 量 。原 理 :聚 丙 烯 酰 胺 , 即 丙 烯 酰 胺 和 少 量 交 联 剂 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 , 在 催 化 剂 过 硫 酸 铵 作 用 下 聚 合形 成 凝 胶 。 反 应 液 中 还 加 有 四 甲 基 乙 二 胺 用 来 引 发 和 控 制 聚 合 反 应 。 反 应 液 顶 覆 盖 一 层 水 层 ,保 证 凝 胶 表 面 平 坦 , 同 时 起 到 隔 离 大 气 中 氧 气 的 作 用 , 因 为 氧 气 可 抑 制 聚 合 反 应 。在 蛋 白 质 溶 液 中 加 入 SDS, 这 种 阴 离 子 去 污 剂 能 够 与 蛋 白 质 相 结 合 , 破 坏 蛋 白 质 内 部 、分 子 之 间 以 及 其 他 物 质 的 非 共 价 键 , 使 蛋 白 质 变 性 而 破 坏 原 有 的 空 间 构 象 。 按 照 1.4gSDS/1g蛋 白 质 结 合 , 形 成 SDS- 蛋 白 质 复 合 物 。 由 于 SDS 带 负 电 , 使 各 种 蛋 白 质 的 SDS- 多 肽 复 合物 都 带 上 相 同 密 度 的 负 电 荷 , 它 的 量 大 大 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 的 电 荷 量 , 因 而 掩 盖 了 不 同种 类 的 蛋 白 质 原 有 的 电 荷 差 别 ; 同 时 , 不 同 蛋 白 质 的 SDS 复 合 物 形 状 也 相 似 , 都 呈 长 椭 圆形 。 因 此 , 在 自 由 电 泳 时 , 它 们 的 泳 动 率 基 本 相 同 , 而 在 某 一 适 宜 浓 度 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电泳 介 质 中 电 泳 时 , 由 于 凝 胶 的 分 子 筛 作 用 , 电 泳 迁 移 率 就 取 决 于 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 的 大 小 ,也 可 以 说 是 取 决 于 蛋 白 质 分 子 量 的 大 小 。SDS—PAGE 可 分 为 圆 盘 状 和 垂 直 板 状 、 连 续 系 统 和 不 连 续 系 统 。 本 实 验 采 用 垂 直 板 状不 连 续 系 统 。 所 谓 “ 不 连 续 ” 是 指 电 泳 体 系 由 两 种 或 两 种 以 上 的 缓 冲 液 、pH 和 凝 胶 孔 径 等 所组 成 。1. 样 品 的 浓 缩 效 应在 不 连 续 电 泳 系 统 中 , 含 有 上 、 下 槽 缓 冲 液 (Tris—Gly,pH8.3)、 浓 缩 胶 缓 冲 液 (Tris—HCl,pH6.8)、 分 离 胶 缓 冲 液 (Tris—HCl,pH8.8), 两 种 凝 胶 的 浓 度 ( 即 孔 径 ) 也 不 相 同 。 在 这 种 条 件下 , 缓 冲 系 统 中 的 HCl 几 乎 全 部 解 离 成 Cl - , 两 槽 中 的 Gly (pI=6.0,pK a=9.7) 只 有 很 少 部 分解 离 成 Gly 的 负 离 子 , 而 酸 性 蛋 白 质 也 可 解 离 出 负 离 子 。 这 些 离 子 在 电 泳 时 都 向 正 极 移 动 。C1 - 速 度 最 快 ( 先 导 离 子 ), 其 次 为 蛋 白 质 ,Gly 负 离 子 最 慢 ( 尾 随 离 子 )。 由 于 C1 - 很 快 超 过 蛋白 离 子 , 因 此 在 其 后 面 形 成 一 个 电 导 较 低 、 电 位 梯 度 较 陡 的 区 域 , 该 区 电 位 梯 度 最 高 , 这 是在 电 泳 过 程 中 形 成 的 电 位 梯 度 的 不 连 续 性 , 导 致 蛋 白 质 和 Gly 离 子 加 快 移 动 , 结 果 使 蛋 白 质在 进 入 分 离 胶 之 前 , 快 、 慢 离 子 之 间 浓 缩 成 一 薄 层 , 有 利 于 提 高 电 泳 的 分 辨 率 。2. 分 子 筛 效 应蛋 白 质 离 子 进 入 分 离 胶 后 , 条 件 有 很 大 变 化 。 由 于 其 pH 升 高 ( 电 泳 进 行 时 常 超 过 9.0),使 Gly 解 离 成 负 离 子 的 效 应 增 加 ; 同 时 因 凝 胶 的 浓 度 升 高 , 蛋 白 质 的 泳 动 受 到 影 响 , 迁 移率 急 剧 下 降 。 此 两 项 变 化 , 使 Gly 的 移 动 超 过 蛋 白 质 , 上 述 的 高 电 压 梯 度 不 复 存 在 , 蛋 白质 便 在 一 个 较 均 一 的 pH 和 电 压 梯 度 环 境 中 , 按 其 分 子 的 大 小 移 动 。 分 离 胶 的 孔 径 有 一 定 的大 小 , 对 不 同 相 对 分 子 质 量 的 蛋 白 质 来 说 , 通 过 时 受 到 的 阻 滞 程 度 不 同 , 即 使 净 电 荷 相 等 的颗 粒 , 也 会 由 于 这 种 分 子 筛 的 效 应 , 把 不 同 大 小 的 蛋 白 质 相 互 分 开 。4