本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

与 水 有 一 定 程 度 的 互 溶 , 大 约 10%~15% 的 水 溶 解 在 酚 相 中 , 因 而 损 失 了 这 部 分 水 相 中 的DNA, 而 氯 仿 的 变 性 作 用 不 如 酚 效 果 好 , 但 氯 仿 与 水 不 相 混 溶 , 不 会 带 走 DNA. 所 以 在 抽 提过 程 中 , 混 合 使 用 酚 与 氯 仿 效 果 最 好 . 经 酚 第 一 次 抽 提 后 的 水 相 中 有 残 留 的 酚 , 由 于 酚 与 氯仿 是 互 溶 的 , 可 用 氯 仿 第 二 次 变 性 蛋 白 质 , 此 时 一 起 将 酚 带 走 . 也 可 以 在 第 二 次 抽 提 时 , 将酚 与 氯 仿 混 合 (1:1) 使 用 .10. 为 什 么 用 酚 与 氯 仿 抽 提 DNA 时 , 还 要 加 少 量 的 异 戌 醇 ?在 抽 提 DNA 时 , 为 了 混 合 均 匀 , 必 须 剧 烈 振 荡 容 器 数 次 , 这 时 在 混 合 液 内 易 产 生 气 泡 ,气 泡 会 阻 止 相 互 间 的 充 分 作 用 . 加 入 异 戌 醇 能 降 低 分 子 表 面 张 力 , 所 以 能 减 少 抽 提 过 程 中的 泡 沫 产 生 . 一 般 采 用 氯 仿 与 异 戌 醇 为 24:1 之 比 . 也 可 以 采 用 酚 , 氯 仿 与 异 戌 醇 之 比 为25:24:1( 不 必 先 配 制 , 可 在 临 用 前 把 一 份 酚 加 入 一 份 24:1 的 氯 仿 互 异 戌 醇 即 成 ), 同 时 异 戌醇 有 助 于 分 相 , 使 离 心 后 的 上 层 水 相 , 中 层 变 性 蛋 白 相 以 及 下 层 有 机 溶 剂 相 维 持 稳 定 .11. 为 什 么 要 用 pH8 的 Tris 水 溶 液 饱 和 酚 ? 呈 粉 红 色 的 酚 可 否 使 用 ? 如 何 保 存 酚 不 被 空 气 氧化 ?因 为 酚 与 水 有 一 定 的 互 溶 . 苯 酚 用 水 饱 和 的 目 的 是 使 其 抽 提 DNA 过 程 中 , 不 致 吸 收样 品 中 含 有 DNA 的 水 分 , 减 少 DNA 的 损 失 . 用 Tris 调 节 至 pH 为 8 是 因 为 DNA 在 此 条 件下 比 较 稳 定 . 在 中 性 或 碱 性 条 件 下 (pH5~7),RNA 比 DNA 更 容 易 游 离 到 水 相 , 所 以 可 获 得RNA 含 量 较 少 的 DNA 样 品 .保 存 在 冰 箱 中 的 酚 , 容 易 被 空 气 氧 化 而 变 成 粉 红 色 , 这 样 的 酚 容 易 降 解 DNA, 一 般 不可 以 使 用 . 为 了 防 止 酚 的 氧 化 , 可 加 入 巯 基 乙 醇 和 8- 羟 基 喹 啉 至 终 浓 度 为 0.1%。8- 羟 基 喹啉 是 带 有 淡 黄 色 的 固 体 粉 末 , 不 仅 能 抗 氧 化 , 并 在 一 定 程 度 上 能 抑 制 Dnase 的 活 性 , 它 是金 属 离 子 的 弱 螯 合 剂 。 用 Tris pH8.0 水 溶 液 饱 和 后 的 酚 , 最 好 分 装 在 棕 色 小 试 剂 瓶 里 , 上 面盖 一 层 Tris 水 溶 液 或 TE 缓 冲 液 , 隔 绝 空 气 , 以 装 满 盖 紧 盖 子 为 宜 , 如 有 可 能 , 可 充 氮气 , 防 止 与 空 气 接 触 而 被 氧 化 。 平 时 保 存 在 4℃ 或 -20℃ 冰 箱 中 , 使 用 时 , 打 开 盖 子 吸 取后 迅 速 加 盖 , 这 样 可 使 酚 不 变 质 , 可 用 数 月 。25