本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

1. 紫 外 分 光 光 度 计 、 微 量 加 样 枪 、 灭 菌 超 薄 PCR 反 应 管2. Trizol 试 剂3. 氯 仿4. 异 丙 醇5. 75℅ 乙 醇6. 无 RNase 的 水 或 0.5℅SDS ( 溶 液 均 需 用 DEPC 处 理 过 的 水 配 制 )实 验 方 法 :( 一 )RNA 提 取1. 匀 浆 处 理 :a. 组 织 将 组 织 在 液 氮 中 磨 碎 , 每 50-100mg 组 织 加 入 1ml Trizol, 用 匀 浆 仪 进 行 匀 浆 处理 。 样 品 体 积 不 应 超 过 Trizol 体 积 10℅。b. 单 层 培 养 细 胞 直 接 在 培 养 板 中 加 入 Trizol 裂 解 细 胞 , 每 10cm 2 面 积 加 1ml, 用 移液 器 吸 打 几 次 。Trizol 的 用 量 应 根 据 培 养 板 面 积 而 定 , 不 取 决 于 细 胞 数 。Trizol 加 量 不 足 可 能导 致 提 取 的 RNA 有 DNA 污 染 。c. 细 胞 悬 液 离 心 收 集 细 胞 , 每 5-10×10 6 动 物 、 植 物 、 酵 母 细 胞 或 1×10 7 细 菌 细 胞 加 入1ml Trizol, 反 复 吸 打 。 加 Trizol 之 前 不 要 洗 涤 细 胞 以 免 mRNA 降 解 。 一 些 酵 母 和 细 菌 细 胞 需用 匀 浆 仪 处 理 。( 注 意 : 匀 浆 一 定 要 彻 底 , 是 提 取 高 质 量 RNA 的 前 提 ; 细 胞 数 量 与 Trizol 的 比 例 ,细 胞 的 数 量 不 能 过 多 。)2. 将 匀 浆 样 品 在 室 温 (15-30℃) 放 置 5 min, 使 核 酸 蛋 白 复 合 物 完 全 分 离 。3. 可 选 步 骤 : 如 样 品 中 含 有 较 多 蛋 白 质 , 脂 肪 , 多 糖 或 胞 外 物 质 ( 肌 肉 , 植 物 结 节 部 分等 ) 可 于 2-8 ℃ 10000×g 离 心 10 min, 取 上 清 。 离 心 得 到 的 沉 淀 中 包 括 细 胞 外 膜 , 多 糖 ,高 分 子 量 DNA, 上 清 中 含 有 RNA。 处 理 脂 肪 组 织 时 , 上 层 有 大 量 油 脂 应 去 除 。 取 澄 清 的 匀浆 液 进 行 下 一 步 操 作 。4. 每 使 用 1ml Trizol 加 入 0.2ml 氯 仿 , 剧 烈 振 荡 15s, 室 温 放 置 3 min。( 注 意 : 此 步 振 荡 非 常 重 要 , 建 议 在 旋 涡 振 荡 器 上 进 行 。)5. 2-8℃10000×g 离 心 15 min。 样 品 分 为 三 层 : 底 层 为 黄 色 ( 红 或 绿 ) 有 机 相 , 上 层 为无 色 水 相 和 一 个 中 间 层 。RNA 主 要 在 水 相 中 , 水 相 体 积 约 为 所 用 Trizol 试 剂 的 60℅。6. 把 水 相 转 移 到 新 管 中 ( 如 要 分 离 DNA 和 蛋 白 质 可 保 留 有 机 相 ), 用 异 丙 醇 沉 淀 水 相中 的 RNA。 每 使 用 1ml Trizol 加 入 0.5ml 异 丙 醇 , 室 温 放 置 10 min。7. 2-8℃10000g 离 心 10 min, 离 心 前 看 不 出 RNA 沉 淀 , 离 心 后 在 管 侧 和 管 底 出 现 胶 状 沉淀 。 移 去 上 清 。8. 用 75℅ 乙 醇 洗 涤 RNA 沉 淀 。 每 使 用 1ml Trizol 至 少 加 1ml 75℅ 乙 醇 。2-8℃ 不 超 过7500g 离 心 5 min, 弃 上 清 。9. 室 温 放 置 干 燥 或 真 空 抽 干 RNA 沉 淀 , 不 要 晾 得 过 干 , 否 则 不 易 溶 解 , 大 约 晾 5-10min。加 入 25-200l 无 RNase 的 水 ,-70℃ 保 存 。( 二 ) 紫 外 吸 收 检 测 RNA 的 浓 度 和 纯 度27