本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

根 据 这 些 特 性 可 以 很 容 易 地 在 体 外 进 行 DNA 的 重 组 操 作 。 一 般 典 型 的 限 制 性 内 切 酶 反 应是 底 物 DNA 在 含 有 Mg 2+ ,Na + 的 缓 冲 液 ( 如 pH=7.5) 中 , 加 入 限 制 性 内 切 酶 , 在 37℃ 保 温 。在 适 当 条 件 下 ( 包 括 温 度 ,pH, 离 子 强 度 ),1 小 时 内 完 全 酶 解 ,1μg DNA 所 需 限 制 性 内 切酶 的 量 , 定 义 为 一 个 活 性 单 位 。 影 响 酶 切 反 应 的 因 素 有 : 底 物 DNA 的 纯 度 , 反 应 系 统 , 反应 体 积 , 时 间 和 温 度 。聚 合 酶 链 式 反 应 (polymerase chain reaction, PCR) 是 一 种 最 常 用 的 体 外 基 因 扩 增 技 术 ,其 工 作 的 基 本 原 理 是 以 拟 扩 增 的 DNA 分 子 为 模 板 , 以 一 对 分 别 与 模 板 5’ 末 端 和 3’ 末 端 相 互补 的 寡 核 苷 酸 为 引 物 , 在 特 殊 的 耐 热 DNA 聚 合 酶 的 作 用 下 , 按 照 半 保 留 复 制 的 机 制 沿 着 模板 链 延 伸 直 至 完 成 新 的 DNA 合 成 。 通 过 多 次 循 环 反 应 , 前 一 循 环 的 产 物 DNA 可 继 续 作 为 后一 循 环 的 模 板 DNA 参 与 DNA 的 合 成 , 使 得 目 的 DNA 片 段 的 量 按 2 n 方 式 呈 指 数 级 递 增 , 所 以该 反 应 称 为 链 式 反 应 。 组 成 PCR 反 应 体 系 的 基 本 成 分 包 括 : 模 板 DNA、 特 异 性 引 物 、 耐 热DNA 聚 合 酶 、dNTP 以 及 含 Mg 2+ 的 缓 冲 溶 液 。PCR 包 括 三 个 基 本 反 应 步 骤 :1 变 性 : 将 反 应 系 统 加 热 至 95℃, 使 模 板 DNA 完 全 变 性成 为 单 链 , 同 时 引 物 自 身 和 引 物 之 间 局 部 双 链 也 得 以 消 除 ;2 退 火 : 将 温 度 下 降 至 适 当 温 度 ,两 个 引 物 分 别 结 合 到 靶 DNA 两 条 单 链 的 3’ 末 端 ;3 延 伸 : 将 温 度 升 至 72℃,DNA 聚 合 酶 催化 dNTP 加 到 引 物 的 3’ 末 端 , 引 物 沿 着 靶 DNA 链 由 3’ 端 向 5’ 端 延 伸 。 上 述 三 个 步 骤 为 一 个 循环 , 新 合 成 的 DNA 分 子 继 续 作 为 下 一 轮 合 成 的 模 板 , 经 数 小 时 的 多 次 循 环 (25~40 次 ) 后 ,靶 DNA 片 段 的 扩 增 倍 数 可 达 10 6 ~10 9 。PCR 成 功 的 关 键 往 往 在 于 寡 核 苷 酸 引 物 的 正 确 设 计 。 要 保 证 PCR 能 准 确 、 特 异 、 有 效地 对 靶 DNA 进 行 扩 增 , 通 常 引 物 设 计 要 遵 守 以 下 几 条 原 则 :1 引 物 长 度 :15~25 个 核 苷 酸 ;2GC 含 量 为 40%~60%;3Tm 值 高 于 55℃;4 引 物 与 模 板 非 特 异 性 配 对 位 点 的 碱 基 配 对率 小 于 70%;5 两 条 引 物 间 配 对 碱 基 数 小 于 5 个 ;6 引 物 自 身 配 对 ( 特 别 是 引 物 的 3’ 末 端 )形 成 的 茎 环 结 构 、 茎 的 碱 基 对 数 不 大 于 3。 由 于 影 响 引 物 设 计 的 因 素 比 较 多 , 实 际 应 用 中 基本 是 利 用 专 门 的 引 物 设 计 软 件 进 行 引 物 设 计 。主 要 仪 器 :离 心 机 , 紫 外 分 光 光 度 计 , 恒 温 水 浴 锅 , 水 平 电 泳 槽 , 电 泳 仪 , 紫 外 检 测 仪 , 凝 胶 成像 系 统 , 基 因 扩 增 仪 (PCR 仪 )( 一 ) 质 粒 DNA 的 提 取主 要 试 剂 : 溶 液 I: 50 mmol/L 葡 萄 糖10 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)2 毫 克 / 毫 升 溶 菌 酶17