本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

第 一 链 cDNA2 μl上 游 引 物 (10pmol/L) 2 μl下 游 引 物 (10pmol/L) 2 μldNTP(2mmol/L)4 μl10×PCR buffer5 μlTaq 酶 (2U/μl) 1 μl(2) 加 入 适 量 的 ddH 2 O, 使 总 体 积 达 50 μl。 轻 轻 混 匀 , 离 心 。(3) 设 定 PCR 程 序 。 在 适 当 的 温 度 参 数 下 扩 增 28-32 个 循 环 。 为 了 保 证 实 验 结 果 的 可靠 与 准 确 , 可 在 PCR 扩 增 目 的 基 因 时 , 加 入 一 对 内 参 ( 如 G-3-PD) 的 特 异 性 引 物 , 同 时 扩增 内 参 DNA, 作 为 对 照 。(4) 电 泳 鉴 定 : 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 , 紫 外 灯 下 观 察 结 果 。(5) 结 果 分 析 : 采 用 凝 胶 图 像 分 析 系 统 , 对 电 泳 条 带 扫 描 分 析 。注 意 事 项 :1. 在 实 验 过 程 中 要 防 止 RNA 的 降 解 , 保 持 RNA 的 完 整 性 。 在 总 RNA 的 提 取 过 程 中 ,注 意 避 免 mRNA 的 断 裂 。2. 为 了 防 止 非 特 异 性 扩 增 , 必 须 设 阴 性 对 照 。3. 内 参 的 设 定 : 主 要 为 了 用 于 靶 RNA 的 定 量 。 常 用 的 内 参 有 G-3-PD(3- 磷 酸 甘 油 醛脱 氢 酶 )、β-Actin(β- 肌 动 蛋 白 ) 等 。 其 目 的 在 于 避 免 RNA 定 量 误 差 、 加 样 误 差 以 及 各PCR 反 应 体 系 中 扩 增 效 率 不 均 一 各 孔 间 的 温 度 差 等 所 造 成 的 误 差 。4. PCR 不 能 进 入 平 台 期 , 出 现 平 台 效 应 与 所 扩 增 的 目 的 基 因 的 长 度 、 序 列 、 二 级 结 构以 及 目 标 DNA 起 始 的 数 量 有 关 。 故 对 于 每 一 个 目 标 序 列 出 现 平 台 效 应 的 循 环 数 , 均 应 通 过单 独 实 验 来 确 定 。5. 防 止 DNA 的 污 染 :(1) 采 用 DNA 酶 处 理 RNA 样 品 。(2) 在 可 能 的 情 况 下 , 将 PCR 引 物 置 于 基 因 的 不 同 外 显 子 , 消 除 基 因 和 mRNA 的 共 线性 。附 注 :(1)-actin 引 物 序 列 :sense5-ACCATGGATGATGATATCGCC-3antisense 5-GTGCCAGATTTTCTCCATGTC-3片 段 长 度 264(71-334)(2) 目 的 基 因 GAPDH 引 物 序 列sense 5' ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG 3'antisense 5' CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG 3'片 段 长 度 :480(103-582)31