本科生化实验补å 讲义 - 南方医科大学精品课程

B. 样 品 匀 浆 时 加 的 试 剂 量 太 少C. 匀 浆 样 品 时 未 在 室 温 放 置 5 分 钟 。D. 吸 取 水 相 时 混 了 有 机 相E.RNA 沉 淀 未 完 全 溶 解 。RNA 降 解A. 组 织 取 出 后 没 有 马 上 处 理 或 冷 冻B. 待 提 取 RNA 的 样 品 没 有 保 存 于 -60 至 -70℃, 而 保 存 在 了 -5 至-20℃C. 细 胞 在 胰 酶 处 理 时 过 度D. 溶 液 或 离 心 管 未 经 RNase 去 除 处 理DNA 污 染A. 样 品 匀 浆 时 加 的 试 剂 量 太 少B. 样 品 中 含 有 有 机 溶 剂 ( 如 乙 醇 ,DMSO 等 ), 强 缓 冲 液 或 碱 性 溶 液二 、 逆 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)原 理 :提 取 组 织 或 细 胞 中 的 总 RNA, 以 其 中 的 mRNA 作 为 模 板 , 采 用 Oligo(dT) 或 随 机 引物 利 用 逆 转 录 酶 反 转 录 成 cDNA。 再 以 cDNA 为 模 板 进 行 PCR 扩 增 , 而 获 得 目 的 基 因 或 检测 基 因 表 达 。RT-PCR 使 RNA 检 测 的 灵 敏 性 提 高 了 几 个 数 量 级 , 使 一 些 极 为 微 量 RNA 样 品分 析 成 为 可 能 。 该 技 术 主 要 用 于 : 分 析 基 因 的 转 录 产 物 、 获 取 目 的 基 因 、 合 成 cDNA 探 针 、构 建 RNA 高 效 转 录 系 统 。( 一 ) 反 转 录 酶 的 选 择1. Money 鼠 白 血 病 病 毒 (MMLV) 反 转 录 酶 : 有 强 的 聚 合 酶 活 性 ,RNA 酶 H 活 性 相对 较 弱 。 最 适 作 用 温 度 为 37℃。2. 禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 (AMV) 反 转 录 酶 : 有 强 的 聚 合 酶 活 性 和 RNA 酶 H 活 性 。 最 适作 用 温 度 为 42℃。3.Thermus thermophilus、Thermus flavus 等 嗜 热 微 生 物 的 热 稳 定 性 反 转 录 酶 : 在 Mn 2+ 存在 下 , 允 许 高 温 反 转 录 RNA, 以 消 除 RNA 模 板 的 二 级 结 构 。4.MMLV 反 转 录 酶 的 RNase H- 突 变 体 : 商 品 名 为 Superscript 和 SuperScriptⅡ。 此 种 酶较 其 它 酶 能 多 将 更 大 部 分 的 RNA 转 换 成 cDNA, 这 一 特 性 允 许 从 含 二 级 结 构 的 、 低 温 反 转录 很 困 难 的 mRNA 模 板 合 成 较 长 cDNA。( 二 ) 合 成 cDNA 引 物 的 选 择1. 随 机 六 聚 体 引 物 : 当 特 定 mRNA 由 于 含 有 使 反 转 录 酶 终 止 的 序 列 而 难 于 拷 贝 其 全 长序 列 时 , 可 采 用 随 机 六 聚 体 引 物 这 一 不 特 异 的 引 物 来 拷 贝 全 长 mRNA。 用 此 种 方 法 时 , 体系 中 所 有 RNA 分 子 全 部 充 当 了 cDNA 第 一 链 模 板 ,PCR 引 物 在 扩 增 过 程 中 赋 予 所 需 要 的 特29