Real-Time PCRs anvendelse til diagnostik af endometritis - Elbo

More documents

Recommendations

Info

Sammendrag Formålet med undersøgelsen var at evaluere den diagnostiske styrke af Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) til direkte påvisning af Streptococcus equi subspecies zooepidemicus og Streptococcus equi subspecies equi fra prøvemateriale fra hoppers endometrium uden en forudgående bakteriologisk dyrkning (BU). Prøvematerialet bestod af 53 sæt prøver af følgende: En endometriesvaberprøve, en lav-volumen uterusskylleprøve og en endometriebiopsi. Prøverne var udtaget parrede, hvilket muliggjorde sammenligning af prøvetyperne indenfor og imellem hopperne. Samtlige 159 prøver blev undersøgt for tilstedeværelse af Streptococcus equi subspecies zooepidemicus og Streptococcus equi subspecies equi, ved hjælp af SYBR ® Green Real-Time PCR og et primersæt specifikt for det bakterielle superoxid dismutase A gen, sodA. Resultaterne viste 34 % positive svaberprøver, 38 % positive skylleprøver og 15 % positive biopsier. Til sammenligning var resultaterne for BU 17 % positive svaberprøver, 28 % positive skylleprøver og 15 % positive biopsier. Korrelation mellem Real-Time PCR og BU positive resultater var lav, hvilket gav sensitiviteter på mellem 0,25 - 0,56. Det kan konkluderes, at Real-Time PCR forøgede andelen af positive svaberprøver statistisk signifikant (p = 0,05) sammenlignet med BU. Andelen af positive skylleprøver blev numerisk, men ikke signifikant øget. Andelen af positive prøver var statistisk signifikant lavere for biopsier sammenlignet med de øvrige prøvetyper uafhængigt af påvisningsmetoden. Summary The aim was to investigate the diagnostic performance of Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) for direct detection of Streptococcus equi subspecies zooepidemicus and Streptococcus equi subspecies equi from sample material from mare endometrium without prior bacteriological culturing (BC). The sample material consisted of 53 sets of samples as follows, an endometrial swab, a low-volume uterine flush and an endometrial biopsy. The paired sampling enabled comparison of the different types of samples within and between mares. All 159 samples were examined for the presence of Streptococcus equi subspecies zooepidemicus and Streptococcus equi subspecies equi by means of SYBR ® Green Real-Time PCR and primers specific for the bacterial superoxide dismutase gene, sodA. The results showed that 34 % of the swabs, 38 % uterine flushes and 15 % of the biopsies were positive. In comparison the results from BC of swabs, uterine flushes and biopsies were 17 %, 28 % and 15 % respectively. The correlation between Real-Time PCR positive results and BC positive results were low, and sensitivities ranged from 0.25–0.56. The Real-Time PCR resulted in statistically significant (p = 0.05) increased number of positive swabs compared to BC. The number of positive uterine flushes was numerically but not significantly higher. On the biopsy material the number of positive samples was statistical significantly lower compared to the other types of samples independent of test method. bOLETTE SKIvE1 MORTEN RøNN PETERSEN2 ANDERS MIKI bOJESEN3 1DYRLÆGE, RÄvEKULLEvÄGEN 10, 423 72 SÄvE, GÖTEbORG, SvERIGE 2DYRLÆGE, PH.D., INSTITUT FOR PRODUKTIONSDYR OG HESTE/ FAGGRUPPEN FOR REPRODUKTION OG ObSTETRIK, DET bIOvIDENSKAbELIGE FAKULTET vED KøbENHAvNS UNIvERSITET, LIFE KU 3DYRLÆGE, PH.D, LEKTOR, INSTITUT FOR vETERIÆR SYGDOMSbIOLOGI/ FAGGRUPPEN FOR MIKRObIOLOGI, DET bIOvIDENSKAbELIGE FAKULTET vED KøbENHAvNS UNIvERSITET, LIFE KU Indledning Bakteriel endometritis udgør et problem både for hesteavlen som industri og for den private hoppeejer. Lidelsen er anerkendt som en vigtig årsag til subfertilitet eller infertilitet hos hopper (1,2). Diagnosen stilles på baggrund af anamnese, kliniske tegn/undersøgelse og dyrkning af prøvemateriale fra hoppens endometrium på blodagarplader ofte suppleret med en udstrygning af prøvemateriale til evaluering af cytologi for at bekræfte eller afkræfte et inflammatorisk respons (2-7). Escherichia coli (E. coli) og ß-hæmolytiske streptokokker er de hyppigst isolerede bakterier fra patologiske tilstande i uterus (1,6), hvor det dominerende agens er Streptococcus equi subspecies zooepidemicus (1,8). Dyrkningsbaserede undersøgelser er tidskrævende, og resultaterne er ikke altid entydige. Der er tilfælde af falsk negative, især blandt kronisk inficerede hopper (2, 5). Det er derfor interessant at undersøge, om en molekylærbiologisk metode som Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) kan bruges til at påvise Streptococcus equi subspecies zooepidemicus og Streptococcus equi subspecies equi direkte fra klinisk prøvemateriale for derved at øge sensitiviteten, specificiteten og hastigheden, hvormed agens kan DVT 01 2012 21 >
ORIGINALARTIKEL påvises. Forkortelse for begge subspecies er fremover S. equi. Baggrund Diagnostiske udfordringer Aerob dyrkning af endometriesvaberprøver er blevet anvendt i årtier og er stadig en meget hyppig benyttet metode til påvisning af bakterier ved endometritis. Flere forfattere fremhæver imidlertid problematikken omkring falsk negative resultater ved denne diagnostiske metode bl.a. pga. det begrænsede areal af endometriet, svaberen kommer i kontakt med (3-7,9). Fx vil infektioner, der lokaliserer sig i foci i endometriet, som E.coli har en tendens til, være svære at diagnosticere (5,10). Det er desuden blevet vist, at S. equi subsp. zooepidemicus kan lejre sig under endometriets luminale epithel og i de uterine krypter (11). Svaberprøven har således vist sig mindre velegnet til diagnosticering af kronisk endometritis hos subfertile omløberhopper, hvor en lav-volumen skylleprøve fra uterus har vist sig at øge sensitiviteten af BU til det dobbelte sammenlignet med svaberprøven (5). Kontamineringsrisikoen ved udtagelse af skylleprøven er reduceret betydelig, efter det er blevet muligt at anvende en dækket metode (12). Ved tolkningen af skylleprøver benyttes både BU og cytologi for at øge metodens sensitivitet og specificitet. LeBlanc et al. benytter yderligere parametre som skyllevæskens klarhed og pH, for at mindske risikoen for falsk positive ved den semidækkede metode (5). Ved kroniske infektioner synes det ikke hensigtsmæssigt kun at lægge vægt på tilstedeværelsen af neutrofile granulocytter, da det inflammatoriske respons kan være forsvundet eller meget svagt til stede hos subfertile omløberhopper, især i forbindelse med E.coli infektioner (5,12). Nielsen sammenlignede eksfoliativ cytologi, dyrkning fra svaberprøver og dyrkning fra endometriebiopsier og konkluderede, at dyrkning fra en biopsi kombineret med eksfoliativ cytologi begge er væsentligt mere sensitive metoder (hhv. 0,82 og 0,77) ved diagnosticering af endometritis end dyrkning fra en svaberprøve (0,34). Neutrofile granulocytter i 22 DVT 01 2012 endometriebiopsien blev i det studie anvendt som »gold standard« (6). Et andet studie, som sammenlignede BU fra hhv. dækkede svaberprøver, semidækkede skylleprøver og biopsier, fandt ikke en signifikant forskel mellem svaberprøvens og biopsiens evne til at påvise bakterier. Derimod havde skylleprøven en signifikant større andel dyrkningspositive (13). Der skal dog tages forbehold, da der i det pågældende studie ikke sammenlignes med en »gold standard«, og antallet af falsk positive er ikke estimeret. Materialer og metoder Dette studie bygger på materiale fra endometriet af 30 hopper, hvoraf der fra 23 af disse er udtaget materiale i to omgange med fire ugers mellemrum i efteråret 2008. Der er udtaget en dobbeltdækket endometriesvaberprøve, en semidækket lav-volumen uterusskylleprøve og en endometriebiopsi fra hver enkelt hoppe hver gang (13). Af de inkluderede hopper var 24 blevet behandlet for endometritis med antibiotika i løbet af avlssæsonen 2008. Antallet af inseminationer pr. hoppe i avlssæson 2008 fremgår af tabel 1. Svaberprøven blev umiddelbart efter udtagning placeret i et rør med ca. 3 ml sterilt 0,9 % isotonisk NaCl. Ved ankomst til KU LIFE blev vatpinden brugt til udsæd på en blodagarplade og siden kasseret. Glasset blev herefter opbevaret ved -20 o C. Til skylleprøven deponeredes 60–120 ml sterilt 0,9 % NaCl i uterus. Ca. 50 ml blev opsamlet og efterfølgende centrifugeret. Supernatanten blev kasseret, det bundfældede materiale genopslemmet og en mindre mængde blev sået ud på en blodagarplade. Resten blev fordelt i to eppendorfrør og opbevaret ved -20 o C. Der blev foretaget udsæd med biopsien på en blodagarplade, hvorefter biopsien blev fikseret i formalin i ét døgn og derefter overført til et reagensglas med låg indeholdende 70 % ethanol og opbevaret ved stuetemperatur. For yderligere detaljer vedrørende udtagelsesprocedurer, henvises til Harpøth (13). DNA blev ekstraheret fra prøvematerialet ved hjælp af en kombination af enzymatisk behandling og kogning. Metoden varierede alt efter, hvilket materiale der skulle ekstraheres DNA fra. Real-Time PCR teknikken var baseret på SYBR ® Green I, hvor frie fluorescensmolekyler ved inkorporering i dobbeltstrenget DNA øger deres emission ca. 2000 gange, TABEL 1: Tabellen viser de 30 hoppers fordeling hvad angår antallet af inseminationer i avlssæsonen 2008 (13). Antal inseminationer 0 1 2 3 ≥ 4 ej oplyst Antal hopper 2 3 7 9 8 1 TABEL 2: viser resultaterne fra de tre SYBR Green Real-Time PCR forsøg på de kliniske prøver med primere sodA-Alber. Prøverne er inddelt i postive og negative, med angivelse af antal, prævalens og 95 % konfidensinterval (KI) for prævalensen. Frekvens, N Prævalens (p) 95 % KI på p Real-Time positive Real-Time negative Total Svaberprøver (A) a Skylleprøver (B) b Biopsier (C) c 18 34 % [21; 47] 35 66 % [53; 79] 53 100 % 20 38 % [25; 51] 33 62 % [49; 75] 53 100 % 8 15 % [5; 25] 45 85 % [75; 95] 53 100 %
Page 1: ORIGINALARTIKEL Real-Time PCRs anve
Page 5 and 6: ORIGINALARTIKEL Kun 15 % af prøver

Real-Time PCRs anvendelse til diagnostik af endometritis - Elbo

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?