Dokument_1.pdf - KLUEDO - Universität Kaiserslautern

INHALTSVERZEICHNIS II
2.7 Zelllinien ................................................................................................................................ 48
2.7.1 COS-7 .............................................................................................................................. 48
2.7.2 LNCaP.............................................................................................................................. 49
2.7.3 MCF-7 .............................................................................................................................. 49
2.7.4 MCF-7-Luciferase (MVLN-C15)........................................................................................ 50
2.7.5 T-47D ............................................................................................................................... 50
2.7.6 T-47D-Luciferase.............................................................................................................. 50
2.7.7 Saccharomyces cerevisiae PKGhAR................................................................................ 50
2.7.8 Saccharomyces cerevisiae hER ....................................................................................... 51
3 PROBLEMSTELLUNG ...................................................................................52
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION .................................................................54
4.1 Endogene Reportergenassays............................................................................................. 54
4.1.1 Bestimmung des endogenen Reporters TRPM-2 mittels kompetitiver RT-PCR................ 54
4.1.1.1 Konstruktion eines internen exogenen Standards zur Quantifizierung des endogenen
Reportergens TRPM-2 ................................................................................................ 57
4.1.1.2 Etablierung und Validierung eines endogenen TRPM-2-Reportergenassays zur
Bestimmung von androgenem/antiandrogenem Potential in T-47D-Zellen.................. 61
4.1.1.3 Untersuchungen des androgenen/antiandrogenen Potentials ausgewählter
Verbindungen mittels endogenen TRPM-2-Reportergenassays in T-47D-Zellen ........ 69
4.1.1.4 Etablierung und Validierung eines endogenen TRPM-2-Reportergenassays zur
Bestimmung von estrogenem/antiestrogenem Potential in MCF-7-Zellen ................... 74
4.1.1.5 Untersuchungen des estrogenen/antiestrogenen Potentials ausgewählter
Verbindungen mittels endogenen TRPM-2-Reportergenassays in MCF-7-Zellen ....... 81
4.1.2 Bestimmung des endogenen Reporters pS2 mittels kompetitiver RT-PCR ...................... 86
4.1.2.1 Etablierung und Validierung eines endogenen pS2-Reportergenassays zur
Bestimmung von estrogenem/antiestrogenem Potential in MCF-7-Zellen ................... 86
4.1.2.2 Untersuchungen des estrogenen/antiestrogenen Potentials ausgewählter
Verbindungen mittels endogenen pS2-Reportergenassays in MCF-7-Zellen .............. 93
4.1.3 Weiterführende Validierung des PSA-Assays................................................................... 95
4.1.4 Zusammenfassung: endogene Reportergenassays........................................................ 102
4.2 Transgene Reportergenassays in Säugerzellen............................................................... 109
4.2.1 Transienter Transaktivierungsassay in COS-7-Zellen zur Identifizierung von
androgenem/antiandrogenem Potential.......................................................................... 111
4.2.2 Stabil transfizierter Transaktivierungsassay in T-47D-Zellen zur Identifizierung von
antiandrogenem Potential............................................................................................... 114
4.2.3 Stabil transfizierter Transaktivierungsassay in MCF-7-Zellen zur Identifizierung von
estrogenem/antiestrogenem Potential ............................................................................ 115