Untersuchungen zur Molekularbiologie von Escherichia coli ...

Inhaltsverzeichnis
4.3.10 Transformation von E. coli-Stämmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3.11 Konjugation von E. coli-Stämmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3.12 DNA-Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3.13 Hybridisierungsanalysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4 Konstruktion von Plasmiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4.1 pGEM-T Easy npt-Ptet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4.2 pASK75-1943 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.4.3 pASK75-1960 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.4.4 pASK75-4711/1960 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.4.5 pFuseA-npt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.4.6 pGEM-T Easy 673, 463, 445 und 235 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.5 Genetische Manipulationen von E. coli-Stämmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.5.1 Transposon-Mutagenese von E. coli Nissle 1917 . . . . . . . . . . . . . . 45
4.5.2 Herstellung von E. coli-Deletionsmutanten . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5.3 Promotoraustausch in E. coli-Stämmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.5.4 Herstellung von Reportergenfusionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.6 Induktion von clbA, clbB, clbQ und clbR in der Zellkultur . . . . . . . . . . . . . 49
4.7 Bestimmung der Promotoraktivitäten von clbA, clbB, clbQ und clbR mittels lux-
Reportergenfusionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.8 Computergestützte Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5 Ergebnisse 51
5.1 Untersuchung des multizellulären Phänotyps von E. coli Nissle 1917 . . . . . . 51
5.1.1 Inaktivierung von csgBA, csgD und yaiC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1.2 Einfluss der Mutationen auf den Morphotyp . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.3 Transposon-Mutagenese des Stammes E. coli Nissle 1917 . . . . . . . . . 53
5.2 Charakterisierung eines Polyketidsynthase-Genclusters in E. coli Nissle 1917 . . 61
5.2.1 Das PKS/NRPS-Gencluster im chromosomalen Kontext . . . . . . . . . 61
5.2.2 Verbreitung der PKS/NRPS-Gene in E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
5.2.3 Nachweis eines zytopathischen Effektes des Polyketids auf eukaryotische
Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
5.2.4 Sequenzanalyse der asnW-Insel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5.2.5 Deletion der asnW-Insel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
5.2.6 Reduktion der Größe von pBACpks11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
5.2.7 Transkriptionsanalyse der asnW-Insel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5.2.8 Induktion der Polyketid-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
5.2.9 Verwendung von Luziferase-Fusionen zur Untersuchung der Transkriptionsaktivität
im PKS/NRPS-Gencluster . . . . . . . . . . . . . . . . 79
6 Diskussion 91
6.1 Untersuchung des rdar-Morphotyps von E. coli Nissle 1917 . . . . . . . . . . . . 91
6.1.1 Biofilmbildung bei E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
6.1.2 Transposon-Mutagenese zur Identifizierung eines übergeordneten rdar-
Regulators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
6.1.3 Regulation von Curli- und Zelluloseexpression in E. coli Nissle 1917 . . 97
6.2 Analyse des PKS/NRPS-Genclusters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
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