GERSTEL Aktuell Nr. 42 - Gerstel GmbH & Co.KG
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Kundenzeitschrift der <strong>GERSTEL</strong> <strong>GmbH</strong> & <strong>Co</strong>. <strong>KG</strong> · Eberhard-<strong>Gerstel</strong>-Platz 1 · 45473 Mülheim an der Ruhr · Telefon + 49 2 08 - 7 65 03-0 · gerstel@gerstel.de<br />
ISSN 1618 - 5900<br />
<strong>Nr</strong>. <strong>42</strong> März 2010<br />
Trinkwasseranalytik<br />
Auf den<br />
Geruch<br />
gekommen<br />
Aroma- und Duftstoffanalyse<br />
Überdimensional gut<br />
Forensische Toxikologie<br />
Tödlicher Kaffeegenuss<br />
Auf Droge?<br />
Effiziente Matrixabtrennung<br />
für die LC-MS/MS-Analytik<br />
Metabolit-Profiling<br />
Spargelzeit
Jubiläum: 25 Jahre Innovation in der GC-Kaltaufgabe<br />
Nummer eins unter<br />
den PTV-Injektoren<br />
Die<br />
Gaschromatographie, 1940 von den Briten Martin und<br />
Synge ent-<br />
wickelt, ist eines der wichtigsten Instrumente zur Bestimmung flüchtiger<br />
Verbin-<br />
dungen (VOC/SVOC). Die Einführung der temperaturprogrammier-<br />
baren Probenaufgabe mit einem PTV-Injektor (Programmed<br />
Tempera-<br />
ture Vaporizer) Anfang der 1980er-Jahre führte zu<br />
einer Steigerung der<br />
Sensitivität und Präzision. Das von <strong>GERSTEL</strong><br />
entwickelte und pa-<br />
tentierte KaltAufgabeSystem (KAS) setzt von Anfang<br />
an Maßstäbe: Es hilft, die Nachweisgrenze signifikant zu senken und sowohl<br />
leichtflüchtige als auch schwerflüchtige Verbindungen diskriminierungsfrei<br />
auf die GC-Säule zu überführen und zu analysieren. Das KAS ist der weltweit am häufigsten<br />
eingesetzte PTV-Universalinjektor mit patentiertem septumfreiem Aufgabekopf.<br />
Mit Einführung des GC 5890 Anfang<br />
der 1980er-Jahre setzte sich Agilent<br />
Technologies, damals unter dem Namen<br />
Hewlett Packard firmierend, an die Weltspitze<br />
der GC-Hersteller. Der 5890 war<br />
der erste GC, der für den Einsatz von<br />
Fused-Silica-Kapillarsäulen ausgelegt<br />
worden war, einen Säulentypus, der die<br />
Gaschromatographie regelrecht revolutionierte:<br />
Dank des haarfeinen Säulendurchmessers<br />
sowie der variablen Säulenlänge<br />
ließ sich die Trennleistung steigern,<br />
zudem ermöglichte die Kapillar-<br />
GC signifikant kürzere Zykluszeiten.<br />
Um schließlich noch die Reproduzierbarkeit<br />
der Kapillar-GC-Analyse zu<br />
verbessern, entwickelte Agilent Technologies<br />
die elektronische Druckkontrolle<br />
(EPC), mit der sich ein konstanter<br />
Trägergasfluss auch bei sich ändern-<br />
den Temperaturen, das heißt im Verlauf<br />
eines aktivierten Temperaturprogramms,<br />
gewährleisten ließ. Der 5890 war der<br />
erste GC, bei dem Druck und Flussrate<br />
nicht mehr von Hand eingestellt werden<br />
mussten. Ein Meilenstein, war es doch<br />
fortan möglich, Methoden und Analysenergebnisse<br />
über Laborgrenzen hinweg<br />
zu übertragen.<br />
Die neuen, leistungsfähigeren Kapillarsäulen<br />
jedoch ließen sich nicht ohne<br />
Weiteres in bestehende GC-Systeme<br />
integrieren. Hierfür bedurfte es zunächst<br />
einer adäquaten Verbindungstechnik wie<br />
der GRAPHPACK-Verbindungstechnik,<br />
mit der sich <strong>GERSTEL</strong> weltweit<br />
einen Namen gemacht hat, sowie verbesserter<br />
Injektoren.<br />
Blick zurück: Die GC-Anwender<br />
hatten Anfang der 1980er-Jahre mit einer<br />
speziellen Herausforderung zu kämpfen,<br />
die unmittelbar mit dem Injektor beziehungsweise<br />
der Probenaufgabe in Verbindung<br />
stand: Die Injektion der meist<br />
kalten Probe erfolgte stets unmittelbar<br />
in den heißen Injektor, was man durchaus<br />
als suboptimal bezeichnen kann. Der<br />
Grund ist physikalischer Natur: Die hohe<br />
Eingangstemperatur des Injektors hatte<br />
zur Folge, dass die Probe schlagartig und<br />
unkontrolliert verdampfte. Eine präzise<br />
Analyse der flüchtigen Komponenten<br />
war eher schwierig, weil sich thermolabile<br />
Analyten spontan zersetzten und<br />
Hochsieder von Diskriminierung betroffen<br />
waren.<br />
Nachdem sich die Entwicklungsabteilungen<br />
vieler Unternehmen vergeblich<br />
um eine technische Innovation bemüht<br />
hatten, präsentierte <strong>GERSTEL</strong> 1984<br />
LEO kontra Ionensuppression<br />
Massenspektren unter optimalen Bedingungen aufzeichnen<br />
erfekte LC-Trennung, kombiniert mit hochef-<br />
Ionisierung und den bestmöglichen<br />
Pfizienter<br />
MS-Nachweisgrenzen – mit dem <strong>GERSTEL</strong>-LC/MS-<br />
EffluentOptimizer (LEO) verbinden Sie das Beste<br />
aus beiden Welten.<br />
Auch in der HPLC/MS zählt, was hinten<br />
herauskommt, und zwar buchstäblich. Bei<br />
Wahl und Einstellung des/der Eluenten geht<br />
der Applikateur einen Kompromiss zugunsten<br />
der Trennung ein. Der Effluent verfügt<br />
daher meist über ein mehr oder weniger großes<br />
Optimierungspotenzial, das sich ab sofort<br />
nutzen lässt und die massenselektive Detektion<br />
spürbar verbessert. In Zusammenarbeit<br />
mit der TeLA <strong>GmbH</strong>, einem auf die HPLC/MS-<br />
Analyse spezialisierten Auftragslabor aus Bremerhaven,<br />
hat <strong>GERSTEL</strong> ein Modul entwickelt,<br />
mit dem sich Zusammensetzung und Eigenschaft<br />
des Effluenten vor Eintritt in das MS<br />
in einem weiten Spektrum optimieren lässt:<br />
Der <strong>GERSTEL</strong>-LC/MS-EffluentOptimizer<br />
(LEO) wird mit wenigen Handgriffen zwischen<br />
die Transferleitung von HPLC und MS<br />
geschaltet. LEO ermöglicht es, weitere Flüssigkeiten<br />
und Reagenzien in den Effluenten<br />
zu dosieren, etwa um dessen pH-Wert oder<br />
seinen Salzgehalt zu verändern und so Rahmenbedingungen<br />
zu schaffen, welche die<br />
Ionisierung der Analyten im MS fördern und<br />
begünstigen. Der LEO ermöglicht ferner eine<br />
Nachsäulenderivatisierung sowie die Dosierung<br />
des Effluenten in das MS im Splitmodus.<br />
Die praktische Handhabung ist dabei vergleichsweise<br />
einfach: Nach seiner Installation<br />
lässt sich LEO per Mausklick ansteuern und<br />
sein ganzes Potenzial in der Methodenentwicklung<br />
wie in der Routineanalytik voll und<br />
ganz nutzen. Einfach per Mausklick!<br />
2 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
Inhalt<br />
25 Jahre KAS<br />
Nummer eins unter den<br />
PTV-Injektoren 2<br />
der Fachwelt das KaltAufgabeSystem<br />
(KAS) als Lösung für eine der damals<br />
größten Herausforderungen in der GC:<br />
Mit dem KAS lässt sich die Probe kalt<br />
und damit schonend und diskriminierungsfrei<br />
aufgeben. Die zu analysierenden<br />
Verbindungen werden durch ein<br />
frei wählbares Temperaturprogramm<br />
im Injektor aufgeheizt und verdampft.<br />
Die Analyten lassen sich sauber chromatographieren<br />
und mit scharfen Signalen<br />
detektieren.<br />
Das KAS ermöglicht sogar die Überführung<br />
thermolabiler Substanzen, und<br />
es lässt dem Anwender die Wahl, gasförmige<br />
Proben anzureichern (Cryotrap-Anreicherungssystem)<br />
sowie statt<br />
weniger Mikroliter auch große Mengen<br />
Probe aufzugeben: Das Lösemittel<br />
wird im KAS, sozusagen in einer Vortrennung,<br />
einfach ausgeblendet, was zur<br />
Folge hat, dass sich die Komponenten<br />
lösemittelreduziert anreichern lassen,<br />
womit wiederum die Nachweisgrenze<br />
gesenkt und die Empfindlichkeit der<br />
Messung erhöht wird.<br />
Universelles Injektionssystem<br />
Das KAS ist auch heute noch das weltweit<br />
erfolgreichste, universell einsetzbare<br />
PTV-Injektionssystem für alle Aufgabetechniken<br />
in der GC: Split, Splitlos,<br />
On<strong>Co</strong>lumn und LargeVolume (bis 1000<br />
µL). Dieses Eigenschaftsprofil ermöglicht<br />
es dem Anwender, das GERS-<br />
TEL-KaltAufgabeSystem (KAS) seinen<br />
individuellen Erfordernissen anzupassen<br />
und es entsprechend einzusetzen.<br />
Ist keine Maximalkühlung von<br />
-180°C erforderlich, lässt sich das KAS<br />
kosteneffizient mit einer Kryostatenoder<br />
einer Peltierkühlung betreiben.<br />
Ähnlich flexibel agiert der Anwender<br />
im oberen Temperaturbereich: Mit dem<br />
KAS senkt Nachweisgrenzen:<br />
NRW-Umweltminister<br />
Klaus Matthiesen<br />
(l.) und Handwerkskammer-Präsident<br />
Gerd<br />
Wieneke überreichen<br />
Eberhard <strong>Gerstel</strong> (M.) für<br />
dessen bahnbrechende<br />
Erfindung 1989 den<br />
Umweltschutzpreis der<br />
Handwerkskammer NRW.<br />
KAS 6 steht ihm eine Systemvariante zur<br />
Verfügung, die eine Temperatur von 650<br />
°C erreicht und sogar eine effiziente und<br />
reproduzierbare automatisierte Pyrolyse<br />
direkt im GC-Injektor gestattet.<br />
Welche Variante der Anwender auch<br />
nutzt: Das KAS zeichnet sich durch sein<br />
patentiertes Heizleitersystem und seine<br />
effiziente Liner-Geometrie aus. Seine<br />
Konzeption erlaubt erstklassige Resultate<br />
und erklärt die bislang unerreichte<br />
Marktstellung. Die Temperatur im Verdampfungsraum<br />
des KAS wird über die<br />
gesamte Strecke des KAS-Ofens gleichmäßig<br />
erhöht. Die Verdampfung der einzelnen<br />
Komponenten verläuft kontrolliert<br />
sowie frei von Schwankungen und<br />
Diskriminierung. Dank des SeptumfreienAufgabeKopfes<br />
(SFK), über den das<br />
KAS verfügt, treten Probleme mit Septumpartikeln<br />
oder dem bekannten Septumbluten<br />
gar nicht erst auf.<br />
Das bietet Ihnen das KAS<br />
• Verbesserte Quantifizierung dank kontrollierter<br />
Verdampfung und diskriminierungsfreier<br />
Überführung der Analyten<br />
auf die Trennsäule.<br />
• Bessere Nachweisgrenzen, Identifikation<br />
und Quantifizierung durch schärfere<br />
Signale und Large-Volume-Injektion<br />
(LVI).<br />
• Niedrigeres Grundrauschen, kein Septumbluten,<br />
verbesserte Nachweisgrenzen<br />
dank des patentierten Septumfreien<br />
AufgabeKopfes (SFK).<br />
• Bestmögliche Überführung und Wiederfindung<br />
thermolabiler Analyten aufgrund<br />
des patentierten Heizsystems<br />
sowie frei programmierbarer Heizraten.<br />
• Sichere Analyse matrixhaltiger Proben<br />
durch automatisierten KAS-Liner-Wechsel<br />
mit dem <strong>GERSTEL</strong>-AutomatedLiner-<br />
EXchange (ALEX).<br />
Aroma- und Duftstoffanalyse<br />
Überdimensional gut 4<br />
Trinkwasseranalytik<br />
Geruchsverursacher direkt am<br />
Wasserhahn anreichern 6<br />
Metabolit-Profiling I<br />
Spargelzeit 10<br />
Verbraucherschutz<br />
Cyanid: Gefahr im Verzug 12<br />
Forensische Toxikologie<br />
Tödlicher Kaffeegenuss 14<br />
Arznei- und Lebensmittelsicherheit<br />
Verpackung: Illegale<br />
Auswanderung 15<br />
Metabolit-Profiling II<br />
Aminosäuren vollständig<br />
automatisiert analysieren 18<br />
Automatisierte Probenvorbereitung<br />
Auf Droge?<br />
Effiziente Matrixabtrennung<br />
für die LC-MS/MS-Analytik 20<br />
News 2<br />
Ausblick 24<br />
Impressum 3<br />
Impressum<br />
Herausgeber<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>GmbH</strong> & <strong>Co</strong>. <strong>KG</strong><br />
Eberhard-<strong>Gerstel</strong>-Platz 1<br />
45473 Mülheim an der Ruhr<br />
Konzeption, Text, Redaktion<br />
Guido Deußing Redaktionsbüro<br />
Science<strong>Co</strong>mmunication<br />
Uhlandstraße 16<br />
41464 Neuss<br />
guido.deussing@t-online.de<br />
Übersetzungen<br />
Kaj Petersen<br />
kaj_petersen@gerstel.de<br />
Wissenschaftlicher Beirat<br />
Dr. Eike Kleine-Benne<br />
eike_kleine-benne@gerstel.de<br />
Dr. Oliver Lerch<br />
oliver_lerch@gerstel.de<br />
Dr. Malte Reimold<br />
malte_reimold@gerstel.de<br />
Leserservice<br />
Andrea Hamm<br />
aktuell@gerstel.com<br />
Grafische Umsetzung<br />
Paura Design, Hagen, Germany<br />
www.paura.de<br />
ISSN 1618-5900 · 03 / 2010<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 3
Aroma- und Duftstoffanalyse<br />
Überdimensional gut<br />
Gaschromatographie-Experten schätzen schlanke Peaks und eine<br />
saubere Trennung. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen sie sich,<br />
je nach Komplexität der Probe, insbesondere in Bezug auf die<br />
Art und Weise der Probenvorbereitung einiges einfallen lassen.<br />
Sollten Signale doch einmal überlappen, besteht auch dann kein<br />
Grund zur Besorgnis, schließlich gibt es die multidimensionale<br />
Chromatographie, derer man sich bedienen kann. Klingt einfach,<br />
ist es aber nicht, weil man dafür bislang für eine maximale<br />
chromatographische Auflösung ein zweites GC-System<br />
benötigte. Nun nicht mehr: Mit dem patentierten „Selectable 1D/2D-GC/MS-<br />
System“ führt der Anwender Routineanalytik und multidimensionale Trennung auf ein und demselben<br />
Gerät durch – ohne Umbau des Systems, einfach per Mausklick. Die interessanten Chromatogramm-<br />
Bereiche lassen sich darüber hinaus anreichern, trennen und mit exakt denselben Detektoren sensitiv<br />
bestimmen.<br />
Lebensmittelanalytik ist alles andere<br />
als trivial: Die zu untersuchende Probenmatrix<br />
ist komplex und erfordert in<br />
der Regel eine Schar unterschiedlicher,<br />
teils aufwändiger Probenvorbereitungsschritte,<br />
die idealerweise automatisiert<br />
verlaufen, um ein hinreichendes Maß an<br />
Effizienz, Sicherheit und Reproduzierbarkeit<br />
zu gewährleisten. Das aber ist<br />
noch lange kein Garant für zufriedenstellende<br />
Resultate, denn eine Überlagerung<br />
von Signalen lässt sich dadurch<br />
nicht verhindern. Sollte eine Überlappung<br />
offenkundig sein oder dem olfaktorischen<br />
Detektor ein Geruch entströmen,<br />
ohne dass im Chromatogramm ein<br />
Signal zu erkennen ist, müssen Anwender<br />
in die Trickkiste greifen. In diesem Fall<br />
kann die multidimensionale Gaschromatographie<br />
(GC) das Mittel der Wahl sein,<br />
um klar zu sehen.<br />
Attraktive Alternative zu<br />
gängigen Systemen<br />
Bislang erforderte die multidimensionale<br />
GC den Einsatz zweier miteinander<br />
gekoppelter Gaschromatographen. Aufgrund<br />
der hohen Anschaffungskosten und<br />
geringen Auslastung handelt es sich hierbei<br />
in den wenigsten Fällen um eine wirklich<br />
rentable Lösung. Die aber offeriert GERS-<br />
TEL nun seinen Kunden: Mit dem patentierten<br />
„Selectable 1D/2D-GC/MS“ präsentiert<br />
das Unternehmen der Fachwelt ein<br />
Analysensystem, mit dem sich nach Bedarf<br />
sowohl die ein- als auch die zweidimensionale<br />
Trennung (1D/2D) auf einem einzigen<br />
Gerät realisieren lässt; der Wechsel<br />
zwischen der ersten und zweiten Dimension<br />
erfolgt einfach per Mausklick.<br />
Die Funktionsweise lässt sich vereinfacht<br />
wie folgt beschreiben: Sobald die eindimensionale<br />
GC/MS-Messung einen<br />
rätselhaften Bereich offenkundig macht,<br />
lässt sich das interessante Intervall im<br />
zweiten GC-Lauf aus dem Chromatogramm<br />
schneiden (Heart-cut) und unmit-<br />
Anwendungsbeispiel: SBSE (<strong>GERSTEL</strong>-Twister) und die 2D-GC-O/MS-Analyse von Aromastoffen in Bier<br />
1D-GC-O/MS-Analyse<br />
Das GC-O/MS-System (für parallele olfaktorische und<br />
MS-Detektion) eignet sich dafür, auch in einem komplexen<br />
Chromatogramm leicht die geruchsintensiven Bereiche herauszufinden.<br />
Hapert es indes an der Auflösung der Peaks, fällt<br />
es schwer, die Geruchsverursacher zu identifizieren. Allerdings<br />
lässt sich der interessante Chromatogrammteil heraustrennen<br />
und als „Heart-cut“ auf eine zweite Trennsäule anderer Polarität<br />
zur weiteren Untersuchung überführen (2D-GC).<br />
„Heart-cutting“ und „Backflushing“<br />
Das System lässt sich im Handumdrehen auf die zweidimensionale<br />
Gaschromatographie, verbunden mit der olfaktorischen<br />
und massenselektiven Detektion (2D-GC-O/MS), erweitern –<br />
ohne zusätzliche Hardware oder Wechsel und Einbau neuer<br />
Trennsäulen. Nach dem „Heart-cutting“ wird die überschüssige<br />
Probenmenge aus der ersten Säule (1D) herausgespült (Backflush).<br />
Zur weiteren Anreicherung der interessanten Analyten<br />
steht eine Kühlfalle (CryoTrapSystem, CTS) zur Verfügung.<br />
Sowohl im 1D- als<br />
auch im 2D-Modus<br />
des Systems ist eine<br />
simultane Bestimmung<br />
mittels massenselektivem<br />
Detektor (MSD)<br />
und <strong>GERSTEL</strong>-OlfactoryDetectionPort<br />
(ODP)<br />
möglich.<br />
4 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
telbar auf eine zweite, im selben GC installierte<br />
Kapillarsäule zur weiteren Auftrennung<br />
überführen; beide Säulen befinden<br />
sich an demselben GC, lassen sich<br />
aber dank der Low-Thermal-Mass-Technologie<br />
(LTM) unabhängig voneinander<br />
heizen. Weder der GC-Lauf wird dabei<br />
unterbrochen noch die Aufzeichnung<br />
des Chromatogramms. Die Vermessung<br />
des auf der zweiten Säule aufgetrennten<br />
Heart-cuts erfolgt in Minutenschnelle<br />
auf demselben Detektor beziehungsweise<br />
denselben Detektoren: MSD, olfaktorischer<br />
Detektor, PFPD usw. unmittelbar<br />
im Anschluss an die 1D-Trennung. Das<br />
fragliche Intervall lässt sich zudem, etwa<br />
aufgrund einer ungenügenden Sensitivität<br />
der Messung, im Verlauf beliebig vieler<br />
Injektionen auf einer zwischengeschalteten<br />
Kühlfalle (<strong>GERSTEL</strong>-CryoTrap-<br />
System, CTS) sammeln und anreichern.<br />
Wird die zweite Dimension schließlich<br />
aktiviert, ist mit hinreichend verwertbaren<br />
qualitativen und quantitativen Analysenergebnissen<br />
zu rechnen.<br />
Bislang wurde der Selectable<br />
1D/2D-GC/MS insbesondere in der<br />
Lebensmittel- und Aromaanalytik<br />
mit Erfolg eingesetzt. Das patentierte<br />
System gewährleistet aufgrund einer<br />
intelligenten Verknüpfung zweier unterschiedlich<br />
polarer Kapillarsäulen auf<br />
einem GC-System eine effiziente multidimensinale<br />
Chromatographie mit hoher<br />
Trennleistung bei gleichzeitig geringen<br />
Anschaffungskosten. Ferner lassen<br />
sich die Analyten des Heart-cuts nach<br />
der 2D-Trennung auf ein und demselben<br />
Detektor vermessen wie die Analysen<br />
nach der 1D-Trennung; die Detektion<br />
kann auf Wunsch auf mehreren Detektoren<br />
wie MSD, ODP, FID oder PFPD<br />
zeitgleich erfolgen. Steuern lässt sich das<br />
kompakte, leistungsfähige <strong>GERSTEL</strong>-<br />
Selectable 1D/2D-<br />
GC-Olfactrometry-<br />
(O)/MS-System<br />
1D-GC-O/MS-Analyse<br />
Bei der 1D-GC-O/MS-Analyse<br />
kommt eine so genannte Low-<br />
Thermal-Mass-GC-Säule (LTM-GC)<br />
zum Einsatz. Zeitgleich wird eine<br />
weitere LTM-GC-Säule 2, die sich<br />
in ihrer Polarität von Säule 1 unterscheidet,<br />
mit Trägergas gespült.<br />
Heart-cutting<br />
Der vom Anwender auf der<br />
LTM-GC-Säule 1 ausgewählte<br />
Signalbereich wird auf die LTM-GC-<br />
Säule 2 übertragen. Die Signale<br />
werden an der Spitze von Säule 2<br />
konzentriert, je nach Flüchtigkeit<br />
der Verbindungen mit oder ohne<br />
Cryofokussierung.<br />
2D-GC-O/MS-Analyse<br />
Nachdem der ausgesuchte Teil des<br />
1D-Chromatogramms „herausgeschnitten“<br />
(Heart-cutting) und am<br />
Kopf der zweiten Säule aufkonzentriert<br />
wurde, wird der andere Teil<br />
der Probe zurück- und aus dem<br />
System gespült (back flushed).<br />
Wenige Minuten nach dem Heartcut<br />
startet das Temperaturprogramm<br />
der zweiten LTM-GC-Säule.<br />
Selectable 1D/2D-GC/MS-System wie<br />
im Übrigen alle <strong>GERSTEL</strong>-Geräte<br />
und -Systeme einfach und komfortabel<br />
per Mausklick.<br />
For Weitere more Informationen<br />
information<br />
www.gerstel.com,<br />
www.gerstel.de, gerstel@gerstel.de<br />
e-mail: gerstel@gerstel.com<br />
2D-GC-O/MS-Analyse<br />
Die interessanten Peaks wurden erfolgreich isoliert und<br />
nach ihrer Trennung auf der zweiten Säule (2D) mittels<br />
ODP erfolgreich detektiert. Resultat ist ein wohldefiniertes<br />
Massenspektrum, das klare Aussagen zulässt.<br />
Datenbank-Recherche<br />
Mithilfe einer Wiley-Datenbank wurde das auf der<br />
2D-Säule aufgezeichnete Signal als b-Damascenon<br />
identifiziert.<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 5
Die Zufriedenheit steht ihnen ins Gesicht geschrieben: Mit ihrer<br />
Erfindung des „Advanced Relevant Investigation Sampler for Taste<br />
& Odor at Tap“, ARISTOT genannt, haben Thomas Thouvenot, David<br />
Benanou und Christophe Tondelier (v. l.) von Veolia Environnement in<br />
Frankreich die echte passive Probennahme von Geruchsverursachern<br />
unmittelbar am Wasserhahn erst möglich gemacht.<br />
6 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
Trinkwasseranalytik<br />
Auf den Geruch gekommen:<br />
Off-Flavors am Wasserhahn anreichern<br />
Ein Team französischer Wissenschaftler um David Benanou hat auf Basis der lösemittelfreien Stir Bar<br />
Sorptive Extraction (SBSE) einen neuartigen Passivsammler entwickelt und patentieren lassen, mit dem<br />
sich Geruchsverursacher im Trinkwasser unmittelbar am Wasserhahn unter Alltagsbedingungen anreichern<br />
lassen. Thermische Extraktion, Identifikation und Qualifikation der passiv angereicherten Off-Flavor-<br />
Verbindungen erfolgen automatisiert mittels Thermodesorptions-GC/MS unter Einsatz des <strong>GERSTEL</strong>-<br />
ThermalDesorptionSystem (TDS).<br />
Der klassische Vorführeffekt: Seit<br />
geraumer Zeit schmeckt oder riecht<br />
das Leitungswasser medizinisch-chlorig,<br />
chemisch, muffig-modrig oder erdig, doch<br />
kaum wird eine Probe gezogen, um den<br />
Sachverhalt näher zu untersuchen, lässt<br />
sich weder ein schlechter Geruch noch<br />
ein Fehlgeschmack feststellen. Ausweg<br />
aus diesem Dilemma bietet nur die auf<br />
Dauer ausgerichtete, echte passive Probennahme.<br />
Die war bislang unmöglich<br />
– in Ermangelung geeigneter Techniken.<br />
Für Abhilfe sorgen David Benanou,<br />
Christophe Tondelier und Thomas<br />
Thouvenot von der Veolia Environnement<br />
in Paris; das Unternehmen zählt zu<br />
den größten Wasserversorgern weltweit.<br />
Im Journal of Chromatography A, 1216<br />
(2009) 2854-2859 berichten die Forscher,<br />
wie sie auf Basis der Stir Bar Sorptive<br />
Extraction (SBSE) einen patentierten<br />
Passivsammler entwickelt haben, mit<br />
dem sich Geruchsverursacher (Off-Flavor-Verbindungen)<br />
unmittelbar am Wasserhahn<br />
des Verbrauchers anreichern lassen.<br />
Identifizierung und Quantifizierung<br />
der extrahierten Verbindungen erfolgen<br />
anschließend vollständig automatisiert<br />
mittels Thermodesorptions- Gaschromatographie<br />
und massenselektiver Detektion<br />
(TD-GC/MS).<br />
Fehlgeruch und Fehlgeschmack<br />
auf der Spur<br />
Gustatorische Parameter wie Geschmack<br />
und Geruch spielen für Trinkwasserversorger<br />
eine wichtige Rolle.<br />
„Der Verbraucher bewertet die organoleptische<br />
(sensorische) Qualität seines<br />
Trinkwassers unmittelbar während der<br />
Verkostung, und ein schlechter Geruch<br />
oder Geschmack wird irrtümlicherweise<br />
mit gesundheitlichen Gefahren in Verbindung<br />
gebracht“, nennt David Benanou<br />
den Grund. Trinkwasserfirmen<br />
sind daher bemüht, die Quellen von<br />
beeinträchtigenden Geruchs- oder Geschmacksverbindungen<br />
zu identifizieren<br />
und Maßnahmen zu ergreifen beziehungsweise<br />
Empfehlungen auszusprechen,<br />
mit denen sie sich abstellen lassen.<br />
Die Belastung des Trinkwassers mit<br />
Off-Flavor-Verbindungen, zu denen<br />
unter anderen Geosmin, 2-Methylisoborneol<br />
oder 2,4,6-Trichloranisol zählen,<br />
lässt sich nicht per se auf eine Ursache<br />
zurückführen. Sie können natürlicherweise<br />
unmittelbar der Quelle<br />
entstammen, aus der das Rohwasser<br />
geschöpft und zu Trinkwasser weiterverarbeitet<br />
wird. Denkbar und möglich<br />
sind Eintragungen über Kontamination<br />
durch Algen, Abwässer und Leckagen.<br />
Belastungen entstehen jedoch ebenso<br />
durch mikrobielle Aktivität im weitverzweigten<br />
Wasserverteilungsnetz wie un-<br />
ARISTOT-Zylinder: In die Bohrungen werden die <strong>GERSTEL</strong>-<br />
Twister eingelassen und der Raum wird mittels<br />
Drehverschluss, der über eine für Wasserauslasse<br />
typische Düse verfügt, gedeckelt.<br />
Der Wasserhahn lässt sich unter Anschluss<br />
eines ARISTOT-Systems in gewohnter<br />
Weise ohne jede Einschränkung nutzen.<br />
mittelbar in der überschaubaren Hausinstallation.<br />
„In den meisten Fällen genügt bereits<br />
eine Konzentration der gelösten<br />
Bestandteile im Sub-Nanogramm-pro-<br />
Liter-Bereich (ng/L = ppt), um Geruchs-<br />
und Geschmacksrezeptoren zu<br />
malträtieren“, konstatiert Christophe<br />
Tondelier. Dieser Sachverhalt mache<br />
die Identifizierung und Quantifizierung<br />
der Off-Flavor-Verbindung jedoch diffizil:<br />
„In der Regel stoßen konventionelle<br />
Methoden und Verfahren schnell<br />
an ihre Nachweisgrenzen“, weiß der<br />
Wasserexperte. Etabliert habe sich zur<br />
Analyse von Off-Flavor-Verbindungen<br />
insbesondere die Kapillargaschromatographie,<br />
was mit der flüchtigen Natur<br />
der Analyten zusammenhänge,<br />
in<br />
Verbindung mit der<br />
massenselektive<br />
(MSD) sowie der sensorischen<br />
Bewertung mittels eines olfaktorischen<br />
Detektors wie dem<br />
Ofactory<br />
Detection-<br />
Port<br />
(ODP)<br />
ARISTOT,<br />
montiert an<br />
einem<br />
Wasserhahn.<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 7
Klein, aber oho: der <strong>GERSTEL</strong>-Twister für<br />
die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE).<br />
von <strong>GERSTEL</strong>: „Die GC verfügt über<br />
eine hohe Trennleistung; MSD und<br />
ODP verfügen über die erforderliche<br />
Empfindlichkeit“, sagt David Benanou.<br />
Auf Art und Effizienz der<br />
Anreicherung kommt es an<br />
Vor der Analyse sind jedoch Probenvorbereitungstechniken<br />
unabdingbar, um<br />
der Off-Flavor-Verbindungen habhaft<br />
zu werden: Sie müssen angereichert und<br />
aufkonzentriert werden, um hinreichend<br />
genau bestimmt werden zu können.<br />
Als gängig und in der Anwendung<br />
weit verbreitet erweist sich die so<br />
genannte Closed-Loop-Stripping-Analysis<br />
(CLSA), bei der die Extraktion der<br />
Analyten unter Einsatz von Aktivkohle<br />
oder ähnlichen Adsorbentien in einem<br />
zirkulierenden Gasstrom erfolgt. Üblich<br />
ist auch die Headspace-SPME: Eine mit<br />
Sorbensmaterial beschichtete Faser wird<br />
mittels einer Spritze in den Dampfraum<br />
des Vials oberhalb der Probe eingeführt.<br />
Unter Einfluss von Wärme treten die<br />
flüchtigen Verbindungen in die Gasphase<br />
über und reichern sich auf der Faser an.<br />
In einem geeigneten Injektor erfolgt die<br />
thermische Extraktion und die Analyten<br />
lassen sich mittels GC/MS bestimmen.<br />
Zunehmend zum Mittel der Wahl<br />
zwecks Anreicherung organischer Verbindungen<br />
aus wässrigen Matrices hat<br />
sich in den zurückliegenden Jahren die<br />
Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE)<br />
entwickelt. Bei der SBSE kommt der so<br />
genannte <strong>GERSTEL</strong>-Twister zum Einsatz,<br />
dessen Handhabung denkbar einfach<br />
ist und ohne aufwändige manuelle<br />
Probenvorbereitungsschritte und organische<br />
Lösemittel auskommt.<br />
Beim Twister handelt es sich, vereinfacht<br />
gesagt, um ein Rührstäbchen für<br />
Magnetrührer, das mit Polydimethylsiloxan<br />
(PDMS) als Sorptionsmedium<br />
ummantelt ist. Klassischerweise reichern<br />
sich die organischen Inhaltsstoffe<br />
aktiv im PDMS-Mantel an, sobald der<br />
Twister die wässrige Probe durchmischt.<br />
Das Rührstäbchen wird entnommen, trockengetupft,<br />
manuell oder automatisiert<br />
in der <strong>GERSTEL</strong>-ThermalDesorption-<br />
Unit (TDU) oder dem ThermalDesorptionSystem<br />
(<strong>GERSTEL</strong>-TDS) thermisch<br />
desorbiert, von wo aus die Analyten temperaturprogrammiert<br />
auf die Säule des<br />
GCs überführt werden.<br />
„Wie die Erfahrung zeigt, erweist<br />
sich die SBSE als attraktive Alternative<br />
zu den konventionellen Strippingmethoden<br />
und zur SPME“, sagt Christophe<br />
Tondelier. Die SBSE arbeite mit<br />
der gleichen PDMS-Phase wie die<br />
SPME-Fasern, allerdings verfüge der<br />
Twister aufgrund des größeren PDMS-<br />
Volumens über eine höhere Sorptionskapazität:<br />
Der Anreicherungsfaktor ist größer,<br />
was sich positiv auf die Quantifizierung<br />
vor allem stärker polarer Verbindungen<br />
auswirkt. „Die SBSE ist eine unvergleichlich<br />
effektive Technik, um organische<br />
Verbindungen aus wässrigen Matrices<br />
zu extrahieren und anzureichern und<br />
sie anschließend sicher und zuverlässig zu<br />
bestimmen“, betont der Wissenschaftler.<br />
Echter Passivsammler zur<br />
Leitungswasserbeprobung<br />
Während für das Veolia-Team aus der<br />
Forschungs- und Entwicklungsabteilung<br />
Einigkeit über die Extraktionsund<br />
Analysentechnik bestand, erwies<br />
sich die Entwicklung eines echten passiven<br />
Probennehmers im vorliegenden<br />
Fall als regelrechte Denksportaufgabe:<br />
Die optische Anmutung sollte ansprechend<br />
sein und sich unauffällig in Bad<br />
und Küche integrieren lassen. Wichtiger<br />
aber sei die Frage gewesen, wie sich der<br />
Passivsammler am Wasserhahn in den<br />
Wasserweg schalten ließ, also zeitlich<br />
befristet als neuer Wasseraustritt dienen<br />
konnte, ohne die üblichen Durchflussbedingungen<br />
sowie die gewohnte<br />
Mehrere Rührstäbchen wurden nach der Multischussmethode<br />
analysiert; die Ergebnisse wurden verglichen<br />
mit der klassischen Methode, die im Desorbieren<br />
eines einzelnen Rührstäbchens besteht. Die Rührstäbchen<br />
wurden mit 2,4,6-TCA zu 2 ng/L beladen. Die<br />
2,4,6-TCA-Peakflächen wurden als Funktion der Zahl der<br />
Rührstäbchen geplottet. Die Regressionsgerade passte<br />
hervorragend, mit einem Korrelationskoeffizienten<br />
nahe 1. Dies zeige, sagt David Benanou, dass sich die<br />
Multischussmethode verwenden lässt, um mehr als ein<br />
Rührstäbchen in einem einzelnen Lauf zu analysieren<br />
und so die Sensitivität zu erhöhen.<br />
Die Anwendbarkeit von ARISTOT wurde mit einer Probe aus dem Wasserhahn gezeigt, die<br />
(kontinuierlich) mit einer Mischung aus Halogenanisolen zu 200 pg/L versetzt wurde. Die<br />
Probenahme erfolgte über 15 min, für die Thermodesorption wurden zwei Rührstäbchen verwendet.<br />
Die Aufzeichnung des Chromatogramms erfolgte im SIM-Modus. Erreichen lassen sich<br />
Detektionslimits im niedrigen ppq-Bereich (pg/L).<br />
8 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
Handhabung der Wasserentnahme zu<br />
beeinträchtigen oder gar zu verfälschen.<br />
Mutter Natur lieferte schließlich<br />
die Vorlage für den patentierten Passivsammler<br />
ARISTOT (Advanced Relevant<br />
Investigation Sampler for Taste & Odor<br />
at Tap). Inspiriert durch die Blütenblätter<br />
von Gänseblümchen wurden in einen 40<br />
Millimeter langen Zylinder aus inertem<br />
Stahl (um Kontaminationen oder Reaktionen<br />
der Wasserinhaltsstoffe mit dem<br />
verwendeten Material zu unterbinden)<br />
sieben Bohrungen von 3 mm Durchmesser<br />
und 30 mm Länge vorgenommen,<br />
die letztlich die Twister beinhalten<br />
sollten. „Bei genauer Betrachtung der<br />
kaschierten Details gleicht ARISTOT<br />
dem Zylinder eines Trommelrevolvers,<br />
nur dass darin keine Patronen stecken,<br />
sondern sieben mit PDMS ummantelte<br />
<strong>GERSTEL</strong>-Twister als Extraktionsmedium,<br />
die durch ein Sieb in der Düse an<br />
Ort und Stelle gehalten werden“, sagt<br />
der Strömungsexperte Thomas Thouvenot<br />
und fügt an, dass sieben Positionen<br />
gewählt wurden, um beste Durchflussbedingungen<br />
zu schaffen und die<br />
Austauschfläche zwischen Wasser und<br />
PDMS zu optimieren.<br />
ARISTOT auf dem Prüfstand:<br />
Nur Versuch macht klug<br />
Jede Innovation ist nur so gut, wie sie sich<br />
in der Praxis bewährt. Ob und inwieweit<br />
sich der neue Passivsammler als alltagstauglich<br />
erweist, musste zunächst in<br />
kleinem Maßstab überprüft werden. Die<br />
Wissenschaftler entwickelten eine Pilotanlage,<br />
mit der sich die Gewohnheiten<br />
der Verbraucher, die auf Grundlage eines<br />
Fragebogens ermittelt wurden, simulieren<br />
ließen. Ferner wurde mittels <strong>Co</strong>mputermodellen<br />
eine Mischkammer konstruiert,<br />
die eine optimale hydrodynamische<br />
Vermischung des Kranwassers mit einer<br />
definierten Menge einer Mischung relevanter<br />
Off-Flavor-Komponenten zuließ.<br />
Um die einfache<br />
Handhabung des<br />
ARISTOT-Systems<br />
zu demonstrieren,<br />
hat Veolia einen<br />
Animationsfilm in<br />
englischer Sprache<br />
erstellt, in dem<br />
„Professor Benanou“<br />
mithilfe eines kleinen<br />
Assistenten den<br />
Einsatz sowie die<br />
Funktionsweise des<br />
<strong>GERSTEL</strong>-Twisters in<br />
der Wasseranalytik<br />
erklärt. Link zum<br />
Film über www.<br />
gerstel.de.<br />
Laut Umfrage unter Verbrauchern strömt<br />
kaltes Wasser täglich rund 15 Minuten<br />
mit einer durchschnittlichen Flussrate<br />
von 2 L/min aus dem Hahn. „Zur Optimierung<br />
der Flussprofile innerhalb des<br />
ARISTOT-Samplers wurden hydrodynamische<br />
Modelle angewandt, um einen<br />
schnellen Austausch zwischen Wasser<br />
und PDMS-Phase zu erhalten“, berichtet<br />
Thomas Thouvenot, Strömungsexperte<br />
und Mitglied im Wissenschaftsteam.<br />
Darüber hinaus sei darauf geachtet<br />
worden, dass nach Öffnen und Schließen<br />
des Wasserhahns die Bohrungen, in<br />
denen die Twister-Rührstäbchen stecken,<br />
mit rund 18 mL Wasser gefüllt blieben,<br />
um die PDMS-Phase vor Kontaminationen<br />
aus der Luft zu schützen.<br />
Die technischen Details<br />
Die Wissenschaftler simulierten an<br />
ihrer Pilotanlage im Labor das Wasserverbrauchsverhalten<br />
und versetzten den<br />
Wasserstrom bei Entnahme mit einer<br />
ethanolischen Standardlösung von Off-<br />
Flavor-Verbindungen (200 pg/L). Sie<br />
enthielt unter anderem:<br />
• 2,4,6-Trichloranisol (2,4,6-TCA),<br />
• 2,4,6-Tribromanisol (2,4,6-TBA),<br />
• deuteriertes 2,4,6-Trichloranisol<br />
(2,4,6-TCA-d5) als internen Standard,<br />
• 2,4-Dichlor-6-Bromanisol<br />
(2,4-DC-6-BA),<br />
• 2,6-Dichlor-4-Bromanisol<br />
(2,6-DC-4-BA),<br />
• 2-Chlor-4,6-Dibromanisol<br />
(2-C-4,6-DBA) und<br />
• 4-Chlor-2,6-Dibromanisol<br />
(4-C-2,6-DBA).<br />
Zur Analyse verwendet wurde<br />
ein GC 6890 mit MSD 5975 (Agilent<br />
Technologies) in Verbindung mit<br />
dem <strong>GERSTEL</strong>-ThermalDesorption-<br />
System (TDS), Autosampler (GERS-<br />
TEL-TDSA) und KaltAufgabeSystem<br />
(<strong>GERSTEL</strong>-KAS). Für die Extraktionsschritte<br />
wurden 20 mm Twister mit 1 mm<br />
Schichtdicke (<strong>GERSTEL</strong>) verwendet.<br />
Diese Rührstäbchen wurden splitlos<br />
desorbiert: 30 °C (0,8 min), 60 °C/min,<br />
250 °C (8 min). Die desorbierten Analyten<br />
wurden im KAS bei -50 °C cryofokussiert.<br />
Anschließend wurde das KAS mit<br />
12 °C/s auf 300 °C (2 min) hochgeheizt<br />
und die Analyten wurden splitlos auf die<br />
Säule transferiert.<br />
Das Trägergas Helium wurde mit<br />
einem konstanten Fluss von 1,5 mL/min<br />
durch das System geführt.<br />
GC-Säule: HP5-MS-Kapillarsäule<br />
von 30 m Länge x 0,25 mm ID x 0,25<br />
µm Filmdicke.<br />
Temperaturprogramm GC-Ofen: 50<br />
°C (2 min) mit 10 °C/min auf 200 °C,<br />
dann mit 25 °C/min auf 300 °C (7 min).<br />
Die Detektion erfolgte im SIM/<br />
Scan-Modus: Der SIM-Modus wurde<br />
für die Quantifizierung verwendet, der<br />
Scan-Modus für die Bestätigung.<br />
Detektionslimits im unteren<br />
ppq-Bereich realisieren<br />
„Um die Sensitivität der Messung zu<br />
erhöhen, haben wir zunächst einmal zwei<br />
Rührstäbchen gleichzeitig in einem einzelnen<br />
Desorptionsröhrchen desorbiert<br />
und analysiert“, berichtet David Benanou.<br />
Unter Einhaltung der ermittelten<br />
optimalen Bedingungen (Flussrate<br />
des Wassers aus dem Wasserhahn 2 L/<br />
min, kaltes Wasser, große Rührstäbchen<br />
– 2 cm lang x 1 mm Dicke der PDMS-<br />
Schicht – und Anreicherungszeit bis zu<br />
120 min) ließen sich in puncto Sensitivität,<br />
Wiederfindung und Reproduzierbarkeit<br />
überaus zufriedenstellende Resultate<br />
erzielen. „Wenn wir alle eingesetzten<br />
Twister-Rührstäbchen nacheinander<br />
thermisch extrahieren, die Analyten<br />
jeweils im KaltAufgabeSystem (KAS)<br />
croyofokussieren und anreichern und<br />
sie erst dann geballt auf die Säule geben,<br />
erreichen wir Detektionslimits bis dicht<br />
zum niedrigen ppq-Bereich (pg/L). Sensitiver<br />
geht’s nicht mehr“, freut sich David<br />
Benanou.<br />
Weitere Informationen<br />
David Benanou und Christophe Tondelier,<br />
Water Research Center, Analytical<br />
Research Department, Veolia Environnement,<br />
Chemin de la Digue, BP 76,<br />
78603 Maisons-Laffitte, Frankreich, Tel.<br />
+33 1 34 93 3103, Fax +33 1 34 93 31 10,<br />
E-Mail: christophe.tondelier@veolia.com.<br />
Sie können Ihre Anfrage auch direkt an<br />
aktuell@gerstel.de richten.<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 9
Metabolit-Profiling I<br />
Spargelzeit<br />
Bereits wenige Minuten nach dem Verzehr wird der Konsument auf<br />
olfaktorische Weise daran erinnert, dass er Spargel gegessen hat.<br />
Applikationsexperten von LECO sind den Ursachen des spargeltypischen<br />
Uringeruchs nachgegangen: mittels <strong>GERSTEL</strong>-Twister (SBSE), ein- und<br />
zweidimensionaler Gaschromatographie (GCxGC) sowie unter<br />
Einsatz eines Flugzeitmassenspektrometers<br />
(Time-Of-Flight Mass Spectrometer, TOFMS).<br />
Es dauert nur zehn bis 15 Minuten, bis<br />
der Verzehr ruchbar wird. Auch der<br />
Nachbar am Urinal merkt sofort mit seiner<br />
Nase: Die Spargelsaison hat begonnen.<br />
Nach einigem Rätselraten sind<br />
sich Wissenschaftler heute über den für<br />
Spargel typischen Uringeruch einig. Er<br />
lässt sich, wie Experimente zeigen, auf<br />
die im Spargel enthaltene Asparagusinsäure<br />
zurückführen, die im Organismus<br />
zu geruchsintensiven Schwefelverbindungen<br />
verstoffwechselt wird: zunächst<br />
zu S-Methylthioester, dann weiter zu<br />
Methanthiol, Dimethylsulfid, Dimethyldisulfid,<br />
Dimethylsulfon und schließlich<br />
zu Dimethylsulfoxid. Bei Testpersonen,<br />
die zwar keinen Spargel, dafür aber Asparagusinsäuren<br />
zu sich nahmen, stellte sich<br />
innerhalb kürzester Zeit genau der für<br />
Spargel typische Uringeruch ein.<br />
Zur Aufklärung des Sachverhalts<br />
bedurfte es einer Analyse des Stoffwechsels<br />
und der resultierenden Metaboliten:<br />
Überlagerung der mit der eindimensionalen GC<br />
aufgezeichneten Signale der infrage kommenden<br />
Metaboliten der Asparagusinsäure im Urin vor<br />
dem Spargelverzehr (blau) und danach (rot): Aceton<br />
(A), Essigsäureethylester (B), 4-Heptanon (C),<br />
5-Methyl-2-(1-methylethyl)-cyclohexanon (D) und<br />
1-(1,5-Dimethyl-4-hexenyl)-4-methylbenzol.<br />
„Traditionell werden die Proben (hier<br />
Urin) für die Dauer von rund 48 Stunden<br />
unter Einfluss von Wärme flüssig extrahiert,<br />
woraufhin man die Extrakte gasoder<br />
flüssigchromatographisch (GC/LC)<br />
auftrennt und die Analyten massenselektiv<br />
(MS) bestimmt“, schreibt Pete Stevens<br />
von LECO. Während sich die GC/MS<br />
beziehungsweise LC/MS vergleichsweise<br />
unkompliziert gestaltet, handelt es sich<br />
bei der Flüssigextraktion um ein sehr aufwändiges<br />
Prozedere, das obendrein häufig<br />
den Einsatz potenziell gesundheitsund<br />
umweltschädlicher Lösemittel erfordert.<br />
„Unser Ziel war es“, beschreibt der<br />
Applikationsexperte, „den Einsatz giftiger<br />
Lösemittel sowie die Extraktionsdauer<br />
nachhaltig zu reduzieren. Beides<br />
gelang uns mit der Stir Bar Sorptive Extraction<br />
(SBSE).“<br />
Technische Details: Durchgeführt<br />
wird die SBSE mit dem patentierten<br />
<strong>GERSTEL</strong>-Twister, einem mit Polydi-<br />
Kein Unterschied: Signal von S-Methyl-2-<br />
propenthioat, gemessen in realen Proben<br />
und verglichen mit der Spektrendatenbank.<br />
methylsiloxan (PDMS) als Sorptionsmedium<br />
ummantelten Rührstäbchen<br />
für Magnetrührer, das die Stoffwechselprodukte<br />
extrahiert, während es die<br />
Probe durchmischt. SBSE und thermische<br />
Extraktion der Twister erfolgten<br />
automatisiert unter Einsatz des GERS-<br />
TEL-MultiPurposeSamplers (MPS)<br />
und der <strong>GERSTEL</strong>-ThermalDesorptionUnit<br />
(TDU). Trennung und Analyse<br />
erfolgten mit einem LECO Pegasus 4D<br />
GCxGC-TOFMS-System. Für die einbzw.<br />
zweidimensionale GC wird ein GC<br />
6890 von Agilent Technologies zusätzlich<br />
mit einem Low-Thermal-Mass-<br />
Modul (LTM) ausgestattet, einem Säulenofen,<br />
der schnelle Heiz- und Kühlraten<br />
ermöglicht.<br />
Die eindimensionale Trennung wird<br />
auf einer unpolaren Säule (10,0 m x 0,18<br />
mm ID x 0,20 µm df Rtx-5) vorgenommen,<br />
die sich im LTM befindet<br />
und durch den GC-Ofen mit<br />
dem Injektor verbunden ist.<br />
Die Säule für die zweidimensionale<br />
Trennung, im GC-<br />
Ofen untergebracht, ist<br />
sehr kurz und von mittlerer<br />
Polarität (1,00 m x 0,10<br />
mm ID X 0,10 µm df DB-17<br />
ms). Zwischen beiden Säulen<br />
befindet sich ein LECO<br />
Dual-jet Thermal Modulator,<br />
der dazu dient, kontinuierlich<br />
das Eluat der ersten Säule zu<br />
trappen und in definierten Portionen<br />
auf die zweite Säule zu<br />
geben. Die zweidimensionale<br />
Trennung ermöglicht eine bessere<br />
Peak-Kapazität sowie eine<br />
höhere Auflösung der Signale.<br />
Breit eluierende Peaks der ersten<br />
Dimension werden im Modulator<br />
fokussiert und als scharfe<br />
Banden in der zweiten Dimension<br />
getrennt; die Peaks sind<br />
somit von schärferer Qualität<br />
und verfügen über ein besseres<br />
Signal-Rausch-Verhält-<br />
10 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
nis. Die Detektion erfolgte mit einem<br />
LECO Pegasus IV Time-of-Flight<br />
Mass Spectrometer (TOFMS), das für<br />
die GCxGC-Chromatgraphie sehr gut<br />
geeignet ist: „Für die schnelle Trennung<br />
auf der zweiten Säule wird ein Detektor<br />
benötigt, der sich durch eine schnelle<br />
Datenaufnahme auszeichnet“, sagt Dr.<br />
Eike Kleine-Benne von <strong>GERSTEL</strong>. Mit<br />
500 Spektren pro Sekunde sei das Pegasus<br />
IV TOFMS bestens geeignet für die vorliegende<br />
Anwendung. Hinzu komme das<br />
TOF-Prinzip, das darauf basiert, für jedes<br />
Spektrum alle Ionen in der Ionenquelle<br />
simultan zu nutzen. Somit entspricht<br />
jeder Scan dem im jeweiligen Moment<br />
vermessenen Säuleneluat. „Diese Eigenschaften,<br />
gepaart mit einer hohen Spektrenrate,<br />
und die simultane Erfassung<br />
der Ionen erlauben zudem eine mathematische<br />
Trennung co-eluierender<br />
Substanzen, Stichwort:<br />
Deconvolution, da sich<br />
schon geringste Unterschiede<br />
der Retentionszeiten<br />
in den MS-Spektren<br />
widerspiegeln“, bemerkt Dr.<br />
Kleine-Benne. Für die eindimensionale<br />
Analyse wurde<br />
der Modulator ausgeschaltet<br />
und die GC-Ofentemperatur<br />
isotherm mit konstant 280 °C<br />
gefahren.<br />
Probenvorbereitung: Um<br />
den Stoffwechsel der Asparagusinsäure<br />
untersuchen zu können,<br />
bat man Testpersonen um<br />
die Abgabe von Urinproben:<br />
jeweils 250 mL vor und etwa<br />
90 bis 120 min nach dem Spargelverzehr.<br />
Die Proben wurden<br />
unverzüglich in 250-mL-<br />
Zweidimensionale<br />
Aufzeichnung<br />
der Messung der<br />
Urinproben vor<br />
und nach dem<br />
Spargelkonsum.<br />
Die relevanten<br />
Komponenten<br />
finden sich nicht in<br />
der Prä-Urinprobe<br />
(A), wohl aber in<br />
der Probe, die nach<br />
dem Verzehr von<br />
Asparagus genommen<br />
wurde (B).<br />
Glasflaschen überführt, die jeweils ein<br />
Twister-Rührstäbchen (10 mm x 0,5<br />
mm) enthielten. Die Extraktion der<br />
Analyten erfolgte, während der Twister<br />
die Probe mit 800 Umdrehungen pro<br />
Minute (UpM) durchmischte; eine Derivatisierung<br />
der Analyten erfolgte nicht,<br />
wie Pete Stevens schreibt. Die Handhabung<br />
des Twisters ist denkbar einfach:<br />
Nach Abschluss der Extraktion werden<br />
die Rührstäbchen mit einer Pinzette<br />
der Probe entnommen, mit destilliertem<br />
Wasser abgespült, mit einem<br />
Tuch trockengetupft und in ein TDU-<br />
Röhrchen für die anschließende automatisierte<br />
thermische Desorption überführt.<br />
Die ausgeheizten Analyten werden<br />
im KaltAufgabeSystem (KAS) cryofokussiert,<br />
um sie anschließend temperaturprogrammiert<br />
punktförmig und diskriminierungsfrei<br />
auf die Trennsäule zu<br />
überführen. Im vorliegenden Fall wurde<br />
die TDU im Splitless-Modus betrieben.<br />
Die Starttemperatur betrug 30 °C und<br />
wurde für die Dauer von 120 Sekunden<br />
gehalten. Anschließend ging es mit<br />
700 °C/min auf eine Endtemperatur<br />
von 280 °C, die ihrerseits für die Dauer<br />
von zwei Minuten gehalten wurde. Die<br />
Cryofokussierung der Analyten im KAS<br />
erfolgte bei -120 °C; von dort ging es mit<br />
12 °C/min auf 280 °C, diese Temperatur<br />
wurde für zwei Minuten gehalten.<br />
Die Resultate der Messung bestätigten<br />
alle Vermutung: „Während sich in den<br />
Urinproben, die vor dem Spargelkonsum<br />
genommen wurden (Prä-Spargelurinproben),<br />
keinerlei verdächtige schwefelhaltige<br />
Metaboliten der Asparagusinsäure<br />
befanden, enthielten die Post-Spargelurinproben<br />
jede Menge davon“, bringt es<br />
Pete Stevens auf den Punkt (s. Abbildung<br />
links). Deutliche Signale lieferten: Aceton<br />
(A), Essigsäureethylester (B), 4-Heptanon<br />
(C), 5-Methyl-2-(1-methylethyl)-<br />
cyclohexanon (D) und 1-(1,5-Dimethyl-<br />
4-hexenyl)-4-methylbenzol. Ferner fanden<br />
sich auch Spuren von S-Methylpropenthioat<br />
und 1,4-bis-(Methylthion)-<br />
butan, nicht aber im Prä-Spargelurin.<br />
Ein ähnliches Bild lieferte die GCxGC-<br />
TOFMS-Analyse. Die Retentionszeit<br />
für S-Methyl-2-propenthioat lag in der<br />
ersten Dimension bei 205 Sekunden, in<br />
der zweiten Dimension bei 1,7 Sekunden.<br />
Pete Stevens: „Mit unserem SBSE-<br />
MPS-GCxGC-TOFMS-System konnten<br />
wir die Bestimmung von Stoffwechselprodukten<br />
in Urin deutlich verbessern:<br />
Die Gesamtanalysenzeit wurde verkürzt,<br />
die herkömmlicherweise aufwändige<br />
und komplexe Probenaufbereitung<br />
effizient vereinfacht, erleichtert und verkürzt.“<br />
Dank der Automatisierung der<br />
im Gesamtsystem integrierten GERS-<br />
TEL-Module, MPS, TDS und KAS, ließ<br />
sich die manuelle Arbeit zugunsten einer<br />
höheren Effizienz und Reproduzierbarkeit<br />
der Messergebnisse auf ein absolutes<br />
Minimum reduzieren. Das GCxGC-<br />
TOFMS wiederum erbrachte eine bessere<br />
Auflösung der Messsignale und eine<br />
gute Trennung der co-eluierenden Peaks.<br />
Die verbleibende <strong>Co</strong>-Elution wiederum<br />
ließ sich mittels „True Signal Deconvolution“<br />
auflösen – dank der hohen<br />
Geschwindigkeit, mit der das LECO-<br />
Pegasus-TOFMS<br />
Gesamtspektren<br />
aufzeichnet.<br />
Detaillierte Informationen<br />
Pete Stevens, LECO <strong>Co</strong>rporation,<br />
Saint Joseph, Michigan, USA,<br />
info@leco.com, www.leco.com<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 11
Verbraucherschutz<br />
Gefahr im Verzug<br />
Cyanide gehören zu den Chemikalien, die mit besonderer Vorsicht zu behandeln sind. Allein der Kontakt<br />
mit Wasser kann aus ihnen das Atemgift Blausäure (Cyanwasserstoff, HCN) freisetzen. Ungeachtet dessen<br />
finden Cyanide breite Anwendung, unter anderem in der Metallurgie und Kunststoffherstellung. Grund<br />
ist ihre Fähigkeit, mit vielen organischen Stoffen Verbindungen einzugehen und mit Metallionen stabile<br />
Komplexe zu bilden. Cyanide finden sich infolge ihres Einsatzes auch als problematische Umweltfracht in<br />
industriellen Abwässern. Über Leckagen, etwa in der Gold- und Silbergewinnung, können sie in die Umwelt, in<br />
Oberflächen- und Grundwässer gelangen und unsere wichtigsten Trinkwasserspeicher belasten. Zum Schutz<br />
der Verbraucher und gemäß gültiger Normen und Vorschriften ist Trinkwasser auf Cyanid zu untersuchen. Die<br />
Bestimmung mittels Headspace-(HS)-GC/MS gewährleistet die Einhaltung gebotener Grenzwerte und sorgt<br />
bei geeigneter Automatisierung der Probenvorbereitung für den raschen Erhalt reproduzierbarer Messwerte.<br />
Sekunden nach der Aufnahme von<br />
nur 120 bis 250 Milligramm Kaliumcyanid<br />
(KCN) oder Natriumcyanid<br />
(NaCN) befällt das Opfer namenloses<br />
Entsetzen: Das Atmen fällt schwer,<br />
wird plötzlich unmöglich und nach etwa<br />
einer Minute bricht es unter Krämpfen<br />
bewusstlos zusammen. Auch sofort eingeleitete<br />
geeignete medizinische Maßnahmen<br />
ändern selten etwas an der Prognose:<br />
Der Patient stirbt meist in Minutenschnelle<br />
an den Folgen einer akuten<br />
Atemlähmung.<br />
KCN („Zyankali“) und NaCN sind<br />
Salze des Cyanwasserstoffs (HCN), dessen<br />
Trivialname „Blausäure“ allgemein<br />
geläufiger sein dürfte. HCN gehört zu<br />
den stärksten und am schnellsten wirkenden<br />
Giften. Die letale Dosis liegt<br />
nach oraler oder inhalativer Aufnahme<br />
bei einem bis zwei Milligramm pro Kilogramm<br />
Körpergewicht.<br />
Reine Blausäure (HCN) ist eine farblose,<br />
sehr leicht flüchtige Flüssigkeit (Siedepunkt:<br />
26 °C), deren Bittermandelgeruch<br />
charakteristisch ist. Aber „nicht<br />
alle Menschen sind genetisch bedingt<br />
in der Lage, diesen Geruch wahrzunehmen;<br />
darüber hinaus werden bei hohen<br />
HCN-Konzentrationen die Geruchsnerven<br />
schon nach kurzer Zeit betäubt“,<br />
weiß Professor Thomas Daldrup, der Leiter<br />
der forensischen Toxikologie am Institut<br />
für Rechtsmedizin der Universität<br />
Düsseldorf.<br />
Die toxische Wirkung der Blausäure<br />
beruht insbesondere auf der Reaktionsfreudigkeit<br />
des Cyanid-Anions (CN - ):<br />
Es bildet, von einigen Ausnahmen einmal<br />
abgesehen, mit Gold, Silber und<br />
den meisten Metallen stabile Komplexe.<br />
Das gilt natürlich auch für das dreiwertige<br />
Eisen, das für den Sauerstofftransport<br />
im menschlichen Organismus wichtig<br />
ist. Konsequenz: Die Zellatmung wird<br />
unterbunden; der mit dem Blut herbeigeschaffte<br />
Sauerstoff kann nicht verwertet<br />
werden. Diesen Prozess, der letzten<br />
Endes zum Tod des Organismus führt,<br />
wird als „inneres Ersticken“ bezeichnet.<br />
Bis zu einem gewissen Grad lässt<br />
er sich durch geeignete therapeutische<br />
Gegenmaßnahmen umkehren. Darüber<br />
hinaus ist der Mensch in der Lage,<br />
kleine Dosen Cyanid in der Leber enzymatisch<br />
abzubauen und die resultierenden<br />
Stoffwechselprodukte über den Urin<br />
auszuscheiden. „Der Grund, warum wir<br />
ohne Sorge Äpfel und Birnen mit Stumpf<br />
und Stiel verzehren können, obgleich aus<br />
deren Kernen in geringen Mengen Blausäure<br />
freigesetzt werden kann“, schildert<br />
Professor Daldrup. Auch Bittermandeln,<br />
Erbsen und Bohnen enthalten<br />
so genannte cyanogene Glycoside,<br />
aus denen sich durch enzymatische oder<br />
chemische Hydrolyse Blausäure entwickeln<br />
kann.<br />
Giftigkeit hängt<br />
von der Verbindung ab<br />
Apropos: Nicht alle Cyanid-Verbindungen<br />
sind per se giftig, wie etwas das<br />
Kaliumhexacyanidoferrat(II). Die auch<br />
als gelbes Blutlaugensalz bezeichnete<br />
Chemikalie stellt einen stabilen Komplex<br />
dar, aus dem kein Cyanid freigesetzt<br />
wird; sie wird in der Lebensmittelindustrie<br />
als Trennmittel und Stabilisator<br />
eingesetzt und ist in der Europäi-<br />
12 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
schen Union (EU) als Lebensmittelzusatzstoff<br />
(E536) für die Verwendung in<br />
Kochsalz und Kochsalzersatz zugelassen.<br />
Kaliumhexacyanidoferrat(III) wiederum<br />
spielt in der Synthesechemie und<br />
in der chemischen Analytik eine besondere<br />
Rolle; das als rotes Blutlaugensalz<br />
bezeichnete Additiv wird auch in der Färberei<br />
verwendet sowie als Härtemittel für<br />
Stahl. Bei unsachgemäßem Umgang aber,<br />
etwa unter großer Hitze oder Säureeinwirkung,<br />
kann sich aus beiden Blutlaugensalzen<br />
giftige Blausäure (HCN) entwickeln,<br />
geben Toxikologen zu bedenken.<br />
Als problematisch und höchst gefährlich<br />
erweisen sich die sehr leichtlöslichen<br />
Alkali- und Erdalkalicyanide, die bei der<br />
Gewinnung von Rohsilber und Gold im<br />
großen Stil eingesetzt werden. Im Verlauf<br />
der „Cyanid-Laugerei“ lassen sich<br />
die Edelmetalle aus dem meist zerriebenen<br />
Silbererz beziehungsweise goldhaltigem<br />
Sand als Cyanid-Komplex extrahieren.<br />
Obgleich im Kreislauf gefahren,<br />
gelangen Rückstände der hochgiftigen<br />
Lauge in die Umwelt und kontaminieren<br />
Böden, Oberflächen- und Grundwasser.<br />
Welche Folgen eine solche Belastung<br />
der Umwelt im schlimmsten Fall nach<br />
sich ziehen kann, wurde unter anderem<br />
im Januar 2000 offensichtlich, als Tauwetter<br />
und heftige Regenfälle Auffangbecken<br />
für Cyanid-Lauge des Gold- und<br />
Silberbergwerks Baia Mare in Rumänien<br />
beschädigten: Geschätzte 100.000<br />
Kubikmeter giftigster Abwässer flossen<br />
in den Fluss Theiß und töteten darin<br />
alles Leben bis zur Donaumündung. „Die<br />
schwerste europäische Umweltkatastrophe<br />
seit Tschernobyl“, urteilte die Presse.<br />
Cyanidnachweis wichtig für die<br />
Bestimmung der Wasserqualität<br />
Vergiftete Gewässer kommen irgendwann<br />
wieder ins Gleichgewicht, Mutter<br />
Natur sei Dank. Cyanide lassen sich nämlich<br />
im Verlauf einer Oxidationsreaktion<br />
zu Stickstoff und Kohlenstoffdioxid<br />
abbauen und unschädlich machen. Dieser<br />
Prozess verläuft im Labor unter Einsatz<br />
von Natriumhypochlorit (NaOCl)<br />
oder Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) zeitlich<br />
beschleunigt; ohne Einfluss des Menschen<br />
dauert es etwas länger. Dennoch<br />
gilt es, kein Risiko einzugehen. Bereits<br />
geringe Mengen Cyanide, werden sie mit<br />
der Nahrung oder dem Trinkwasser aufgenommen,<br />
sind<br />
in der Lage, die<br />
Gesundheit des<br />
Menschen zu<br />
beeinträchtigen.<br />
Die United States<br />
Environmental<br />
Protection<br />
Agency (EPA)<br />
hat daher Grenzwerte<br />
(Maximum<br />
<strong>Co</strong>ntaminant<br />
Level,<br />
MCL) definiert,<br />
die nicht überschritten<br />
werden<br />
dürfen. Die<br />
MCL für Cyanide liegt hiernach bei 0,2<br />
Milligramm pro Liter beziehungsweise<br />
bei 200 ppb. Gemäß der TrinkW2001<br />
liegt die Maximalbelastung bei 0,5 mg/L.<br />
Werden die Werte überschritten, ist der<br />
Wasserversorger gehalten, Maßnahmen<br />
zum Schutz der Verbraucher zu treffen.<br />
HS-GC/MS als Methode der Wahl<br />
Zum Nachweis löslicher Cyanidsalze<br />
in Trink- und Quellwasser hat die EPA<br />
kürzlich eine vom H&E Testing Laboratory<br />
im US-Bundesstaat Maine entwickelte<br />
Methode auf Basis der Headspace-<br />
Gaschromatographie in Verbindung mit<br />
der massenselektiven Detektion (HS-<br />
GC/MS) zur Referenzmethode (ME<br />
355.01) von Cyaniden in Trinkwasser<br />
erkoren. „Die Methode lässt sich auf alle<br />
Formen von Cyaniden anwenden, die im<br />
sauren Milieu leicht HCN freisetzen“,<br />
schreibt Dr. Jim Eaten vom H&S-Testing<br />
Laboratory in der Methodenvorschrift.<br />
Die ME355.01 basiert auf einer vom<br />
PrepBuilder-Sequenz beim<br />
Cyanidnachweis: Per<br />
Mausklick lassen sich alle<br />
erforderlichen Schritte aus<br />
einer Liste von Möglichkeiten<br />
schnell, einfach<br />
und sicher zusammenstellen.<br />
US-amerikanischen Center of Disease<br />
<strong>Co</strong>ntrol and Prevention (CDC) für den<br />
Nachweis von Cyaniden in Blut präferierten<br />
Methode, die für die Anwendung<br />
in der Trinkwasser- und Umweltanalytik<br />
modifiziert wurde. Um sich rasch ein<br />
Bild von der tatsächlichen Kontamination<br />
des Trinkwassers durch Cyanide zu<br />
GC/MS-Analyse von Blausäure in Wasser<br />
gemäß der EPA-Methode ME 355.01. Der<br />
Massenscan erfolgte bei m/z = 26, 27 und 29<br />
(interner Standard).<br />
machen und umgehend geeignete Maßnahmen<br />
zum Schutz der Konsumenten<br />
ergreifen zu können, wird folgende Vorgehensweise<br />
von der EPA präferiert:<br />
Die Proben werden in 40-mL-Braunglasvials<br />
gesammelt, durch Zugabe von<br />
1 mL einer 1 N NaOH haltbar gemacht<br />
und bis zur Analyse bei 4 °C in dunkler<br />
Umgebung gelagert. Sollte sich die Probe<br />
nach Zugabe einer o-Tolidin-Lösung<br />
gelb färben, ist die Probe zu verwerfen,<br />
was unabhängig davon spätestens nach<br />
sieben Tagen zu erfolgen hat. Um eine<br />
rasche und sichere Analyse zu gewährleisten,<br />
sollte ein geeigneter Autosampler<br />
zur Probenvorbereitung zum Einsatz<br />
kommen. Als ideal erweist sich die Dual-<br />
Rail-Variante des MultiPurposeSamplers<br />
(MPS-PrepStation), die spezifisch in<br />
der Methode genannt wird. Kraft zweier<br />
unabhängig in alle Raumrichtungen agierender<br />
Roboterarme ermöglicht der MPS<br />
dem Anwender, sowohl eine Flüssigspritze<br />
einzusetzen, etwa für die Dosierung<br />
von Reagenzien einschließlich des<br />
internen Standards, als auch zeitgleich die<br />
Probennahme im Headspace. Beim GC/<br />
MS-System handelt es sich um eine handelsübliche<br />
Gerätekombination.<br />
Probenvorbereitung: Von den zu<br />
analysierenden Proben wird je 1 mL in<br />
ein 10-mL-Headspacevial pipettiert,<br />
das anschließend in Reih und Glied von<br />
Hand auf den Probenteller der PrepStation<br />
platziert wird. Alle weiteren Schritte<br />
verlaufen voll automatisiert und dank<br />
der <strong>GERSTEL</strong>-MAESTRO-Software<br />
komfortabel gesteuert. Alle erforderli-<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 13
Forensische Toxikologie<br />
Tödlicher Kaffeegenuss<br />
Professor Daldrup diskutiert mit einer Mitarbeiterin<br />
den Fall des „Cappuccino-Mörders“.<br />
„Der Cappuccino schmeckt aber faulig.“<br />
Christa G. hatte nur einen Schluck genommen,<br />
schon verzog sie angewidert ihr Gesicht.<br />
Guido W., Leiter eines Galvanik-Betriebes im<br />
westfälischen Lüdenscheid, zeigte sich verwundert,<br />
war der Kaffee doch von ihm zubereitet<br />
und seiner Stellvertreterin serviert worden.<br />
Den Weg zur Toilette schaffte Christa G.<br />
gerade noch, dann brach sie nach Luft schnappend<br />
unter Krämpfen bewusstlos zusammen.<br />
Guido W. rief den Notarzt ...<br />
Für die Ärzte im Krankenhaus in Lüdenscheid<br />
wiesen die Symptome auf eine akute<br />
Vergiftung hin, wie sie Jahr für Jahr schätzungsweise<br />
an die 200.000mal hierzulande ärztlich<br />
behandelt werden muss. Manchmal ist es ein<br />
Wettlauf gegen die Zeit. In rund 5000 Fällen<br />
kommt leider jede Hilfe zu spät.<br />
Christa G. befand sich in Lebensgefahr. Im<br />
Nu waren Blut- und Urinproben von ihr auf<br />
dem Weg zum Institut für Rechtsmedizin der<br />
Düsseldorfer Heinrich-Heine-Universität. Die<br />
dortige forensische Toxikologie, eine Unterabteilung<br />
der Rechtsmedizin, ist spezialisiert<br />
auf den Nachweis von Giftstoffen in Körperflüssigkeiten.<br />
Professor Thomas Daldrup, Leiter<br />
der Toxikologie, nutzt dazu verschiedene<br />
Verfahren.<br />
Erste Indizien für die Anwesenheit toxischer<br />
Stoffe wie Rückstände von Arzneimitteln, Drogen<br />
oder Giftstoffen liefern immunchemische<br />
Tests. Hat der Test ein solches Ergebnis, erhält der<br />
behandelnde Arzt in der Klinik bereits binnen kurzer<br />
Zeit einen ersten Anhaltspunkt für eine Vergiftung<br />
und somit wertvolle Hinweise für die Therapie<br />
des Patienten.<br />
Um detaillierte Aussagen über Art und<br />
Menge einer im Blut beziehungsweise im Urin<br />
enthaltenen verdächtigen Substanz machen zu<br />
können, müssen Toxikologen auf adäquate Trennverfahren<br />
wie die Gaschromatographie in Verbindung<br />
mit einer massenselektiven Detektion (GC/<br />
MS) zurückgreifen.<br />
Christa G. hatte weder Drogen noch Medikamente<br />
konsumiert. Das ergab die chemische<br />
Analyse. Jedoch fanden sich in Blut und Mageninhalt<br />
der 28-Jährigen erhebliche Mengen Cyanid,<br />
das mit der Magensäure zu dem Atem- und Nervengift<br />
Blausäure reagiert. Christa G. erlitt hierdurch<br />
einen irreversiblen Hirnschaden, an dem<br />
sie vier Tage später verstarb.<br />
„Unnatürliche Todesursache.“ Der Wortlaut<br />
der finalen Diagnose, die Mediziner bei<br />
Christa G. vornahmen, rief Polizei und Staatsanwaltschaft<br />
auf den Plan. Es galt herauszufinden,<br />
wie das tödliche Gift in den Körper der<br />
28-Jährigen gelangen konnte.<br />
Zwar hantierte die Laborantin an ihrem<br />
Arbeitsplatz mit Cyanidsalzen; sie werden dort<br />
eingesetzt, um Metalloberflächen zu vergolden.<br />
Gegen einen Unfall oder gar einen Selbstmord<br />
sprach aber der Wirkmechanismus des<br />
Gifts: „Hätte Christa G. Cyanidsalze aus suizidalem<br />
Motiv eingenommen oder sie zufälligerweise<br />
verschluckt, hätte sie es zur morgendlichen<br />
Kaffeerunde gar nicht erst schaffen<br />
können“, gibt Professor Daldrup zu bedenken.<br />
Die Ermittlungen liefen auf Hochtouren.<br />
Alle denkbaren Szenarien wurden theoretisch<br />
durchgespielt und in alle Richtungen wurde<br />
recherchiert. Vier Monate nach dem Gifttod<br />
der jungen Frau meinte die Kriminalpolizei<br />
schließlich, im Cappuccino das <strong>Co</strong>rpus Delicti<br />
ausfindig gemacht zu haben – und in Guido<br />
W., den Leiter des Galvanikbetriebs, jemanden<br />
des Mordes Verdächtigen.<br />
War es möglich, dass Christa G. das tödliche<br />
Gift mit dem Cappuccino in heimtückischer<br />
Weise verabreicht worden war? Professor<br />
Daldrup wurde beauftragt, eben diesen<br />
Sachverhalt unter die Lupe zu nehmen. Der<br />
Forensiker prüfte die Löslichkeit von Cyanidsalz<br />
in Cappuccino. Mit dem Ergebnis: „Der<br />
Verdächtige hätte dem Heißgetränk unbemerkt<br />
eine tödliche Menge des Gifts beimischen<br />
können, nicht einmal die Schaumkrone<br />
wäre dadurch verschwunden“, versichert der<br />
Wissenschaftler.<br />
Gegen Guido W. sprach zudem, dass er den<br />
Cappuccino, das einzige Beweismittel, unverzüglich<br />
entsorgt hatte; der Becher blieb unauffindbar.<br />
Schließlich stieß die Polizei auch auf ein mögliches<br />
Mordmotiv: Guido W. hatte im Betrieb Gold<br />
im Wert von umgerechnet rund 5000 Euro unterschlagen.<br />
Der Betriebsleiter hatte allen Grund<br />
anzunehmen, dass ihm seine Stellvertreterin<br />
Christa G. auf die Schliche gekommen war und<br />
ihn anzeigen wollte. Um das Delikt zu vertuschen,<br />
tötete Guido W. die 28-Jährige heimtückisch.<br />
Es kam zur Anklage vor dem Schwurgericht in<br />
Hagen. Guido W. beteuerte seine Unschuld, das<br />
Gericht aber sah ihn als des Mordes überführt an,<br />
sprach ihn auf Indizien basierend schuldig und<br />
verurteilte ihn zu lebenslanger Haft.<br />
chen Parameter lassen sich per Mausklick<br />
aus einer Liste grundlegender Arbeitsschritte<br />
zusammenstellen; der Anwender<br />
benötigt nur eine Sequenztabelle<br />
und steuert doch das ganze System, also<br />
MPS, GC und MS. Aufgrund der PrepAhead-Funktion<br />
lassen sich Probenvorbereitung<br />
und GC/MS-Analyse derart zeitlich<br />
verschachteln, sodass alle Proben just<br />
in time auf die GC-Säule gegeben werden<br />
können, sobald der vorangegangene<br />
Lauf beendet ist.<br />
Der MPS gibt 50 µL einer wässrigen<br />
K 13 C 15 N-Lösung als internen Standard<br />
zur Probe, ferner 200 µL Ascorbinsäure<br />
und 200 µL Phosphorsäure, um<br />
HCN freizusetzen. Es folgt eine vierminütige<br />
Temperierung des Vials auf<br />
60 °C, bevor die Analyten, aus dem Headspace<br />
gezogen, im KaltAufgabeSystem<br />
(KAS) des GCs bei -10 °C cryofokussiert<br />
werden. Nach etwa 1,5 Minuten wird<br />
das KAS temperaturprogrammiert auf<br />
220 °C aufgeheizt und die Analyten werden<br />
auf die GC-Säule überführt. Anschließend<br />
erfolgt die Analyse auf einem handelsüblichen<br />
GC/MS-System, wobei<br />
folgende Bedingungen einzuhalten sind:<br />
GC-Säule:<br />
Trägergas:<br />
GC-Ofen:<br />
MS-Modus:<br />
Massen:<br />
PLOT-Q-Säule von Agilent,<br />
Teil #19091P-Q04 oder<br />
Äquivalent<br />
Helium (1,1 mL/min),<br />
konstanter Fluss<br />
110 °C (0 min) – 4 °C/<br />
min –130 °C (0 min) –<br />
99 °C/min – 250 °C<br />
(1,79 min)<br />
Selected Ion Monitoring<br />
(SIM)<br />
m/z = 29 (interner<br />
Standard), 27 und 26<br />
Eine Bemerkung zum Schluss: Die<br />
Methode ME 355.01 wurde laut H&L<br />
Testing Laboratory von drei unabhängigen<br />
Laboratorien getestet und auf verschiedene,<br />
mit unterschiedlichen Mengen<br />
an Cyanid (50 und 200 ppb) versetzte<br />
Proben (Reagenzwasser, Wasser<br />
mit hoher Salzkonzentration, Trinkwasser<br />
mit hohem TOC-Gehalt) angewandt.<br />
„Alle drei Laboratorien berichteten<br />
von Ergebnissen, die innerhalb der<br />
Anforderungen lagen und damit die<br />
mustergültige Eignung der Methode<br />
bestätigen“, freut sich Dr. Jim Eaton.<br />
Weitere Informationen<br />
Jim Eaton Ph.D., H&E Testing Laboratory,<br />
221 State Street, Augusta, Maine 04333,<br />
USA. E-Mail: sales@gerstelus.com.<br />
Sie können sich auch direkt an aktuell@<br />
gerstel.de wenden.<br />
14 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
Pharma- und Lebensmittelsicherheit<br />
Illegale Auswanderung<br />
Zum Schutz der Verbraucher muss sichergestellt sein, dass keine schädlichen Verbindungen aus<br />
Verpackungsmaterialien in Lebens- oder Arzneimittel migrieren können. Routinemäßige Migrationsstudien<br />
genügen im Bereich der Lebensmittelverpackung nicht, um die gebotenen Sicherheitsstandards einzuhalten.<br />
Auch die Barriere-Eigenschaft der Primärverpackungen ist experimentell zu überprüfen und sicherzustellen.<br />
An Arzneimittelverpackungen müssen „Extractables & Leachables“-Studien durchgeführt werden. Als<br />
effiziente und sensitive Screening-Methode für Lebens- und Arzneimittelverpackungen erweist sich die<br />
Thermodesorption, gekoppelt mit der GC/MS-Analyse.<br />
ei allen Vorzügen, die moderne Verpackungen<br />
und Verpackungsmateri-<br />
B<br />
alien im Hinblick auf Hygiene, Schutz,<br />
Sicherheit und Deklaration aufweisen<br />
oder durch Modifikation und Aufdruck<br />
erhalten: Ihre Verwendung ist nicht ohne<br />
Risiko. Die zur Herstellung eingesetzten<br />
Lösemittel, Additive und Farbpigmente<br />
sowie gegebenenfalls enthaltene<br />
chemische oder mikrobiologische Verunreinigungen<br />
können nämlich das verpackte<br />
Gut kontaminieren. Um Verbraucher<br />
beziehungsweise Patienten vor der<br />
Aufnahme schädlicher Migrationsrückstände<br />
zu bewahren, sind Lebens- und<br />
Arzneimittelverpackungen dezidiert auf<br />
potenzielle Risiken hin zu untersuchen.<br />
Lebensmittelverpackungen: Migrationsstudien<br />
sollen zeigen, ob die in oder<br />
auf der Verpackung enthaltenen Chemikalien<br />
wie Plastikadditive, Pigmente,<br />
Drucklösemittel oder Bindersysteme an<br />
Ort und Stelle bleiben oder ob sie in das<br />
Lebensmittel übergehen. Durchgeführt<br />
werden die Studien in der Regel mit drei<br />
Simulanzien unter Standardbedingungen<br />
(z. B. 10 Tage bei 40 °C). Zum Einsatz<br />
kommen: wässrige Essigsäure, eine wässrige<br />
alkoholische Lösung und Speiseöl.<br />
Analysiert wird die Zielverbindung im<br />
Simulanz während beziehungsweise nach<br />
der Inkubationszeit. Die Ergebnisse dienen<br />
dazu, spezifische Migrationsgrenzwerte<br />
(specific migration levels, SML)<br />
für die Zielsubstanz zu definieren. Mittels<br />
der SML werden die Zielverbindungen<br />
für den getesteten Kunststoff beziehungsweise<br />
das jeweilige Applikationsszenario<br />
allgemein zugelassen. Zugelassene<br />
beziehungsweise akzeptable Limits<br />
für SLM sind in den Behördenrichtlinien<br />
(siehe Kasten Seite 16) definiert.<br />
Arzneimittelverpackungen: Im Rahmen<br />
von so genannten „Extractables &<br />
Leachables“-Studien (E&L-Studien)<br />
soll gezeigt werden, ob eine Pharmaverpackung<br />
sicher ist beziehungsweise ob<br />
das enthaltene Arzneimittel mit migrierenden<br />
Chemikalien belastet wird. Die<br />
erforderlichen Tests werden in zwei Stufen<br />
durchgeführt:<br />
1. „Extractables“-Studie: Ein „Worst<br />
case“-Szenario wird simuliert, wobei die<br />
Verpackung unbeschädigt mit Lösemitteln<br />
unterschiedlicher Polarität und bei<br />
erhöhter Temperatur extrahiert wird. Die<br />
resultierenden Extrakte werden umfangreich<br />
analytisch charakterisiert, um einen<br />
möglichst vollständigen Überblick über<br />
alle potenziellen Verbindungen zu erhalten,<br />
die das Pharmazeutikum kontaminieren<br />
könnten.<br />
2. „Leachables“-Studie: Nach toxikologischer<br />
Auswertung der „Extractables“-<br />
Studie werden als kritisch eingestufte<br />
Substanzen im echten Pharmazeutikum<br />
(meist aus Stabilitätsprüfung) mit validierten<br />
Methoden analysiert.<br />
Am Rande bemerkt: Es existieren<br />
keine weltweit gültigen Grenzwerte für<br />
„extrahierbare“ Substanzen; jede E&L-<br />
Studie besitzt individuelle Züge und hat<br />
zum Ziel, potenziell risikobehaftete Verbindungen<br />
im jeweils vorliegenden Fall zu<br />
identifizieren und genau zu untersuchen.<br />
Die ganze analytische<br />
Klaviatur spielen<br />
Die Durchführung von Migrationstests<br />
und E&L-Studien erfolgt zum Teil auf<br />
Grundlage gültiger Normen und Regelwerke.<br />
Sie gleichen einem analytischen<br />
Potpourri unter Einsatz einer Vielzahl<br />
unterschiedlichster Verfahren und<br />
Methoden, die sich letztlich auch einsetzen<br />
lassen, um Verpackungssysteme,<br />
gleich welcher Art, zu optimieren.<br />
Die analytische Ouvertüre kommt<br />
der Thermodesorptions-GC/MS (TDS-<br />
GC/MS) zu. Sie eignet sich wie kaum<br />
ein anderes Verfahren zur effizienten und<br />
lösemittelfreien Extraktion leicht- und<br />
mittelflüchtiger Verbindungen aus Verpackungsmaterialien.<br />
Potenzielle Analyten<br />
sind Oligomere aus Polyolefinen,<br />
Antioxidanzien und deren Abbauprodukte,<br />
Plastikadditive, Lösemittel aus<br />
Druckfarben, Weichmacher, Monomere<br />
aus Bindersystemen, Verunreinigungen<br />
aus Pigmenten, Photoinitiatoren, unzählige<br />
Verbindungen und Verbindungsklassen<br />
aus recycliertem Karton wie Diisopropylnaphthalin-Isomere,<br />
Phthalate<br />
oder Kohlenwasserstoffe. Dem Screening<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 15
mit der TDS-GC/MS schließen sich bei<br />
Bedarf weitere Analysen an, zum Beispiel<br />
GC/MS, Headspace-GC/MS, LC-UV-<br />
MS, Elementaranalyse, TOC usw.<br />
Fall I: Migration aus<br />
Lebensmittelverpackungen<br />
Ein Lebensmittel wird in neun unterschiedlichen<br />
Kunststoff-Primärverpackungen,<br />
darunter Polyolefin-Folien,<br />
laminierte Mehrfoliensysteme oder<br />
metallisierte Folien, gelagert. Diese befinden<br />
sich wiederum in einer Sekundärverpackung<br />
aus recycliertem Karton.<br />
Um einen Eindruck von der Migrationskinetik<br />
im Verpackungssystem zu bekommen,<br />
wird das Lebensmittel mittels TDS-<br />
GC/MS nach unterschiedlichen Lagerungszeiten<br />
auf Markersubstanzen aus<br />
dem recyclierten Karton, im vorliegenden<br />
Fall Diisopropylnaphthalin-Isomere<br />
(DIPN), untersucht. Ziel ist es, die Primärverpackung<br />
mit den besten Barriere-<br />
Eigenschaften ausfindig zu machen.<br />
Vorgehensweise: Das Lebensmittel<br />
wird homogenisiert, in Mengen zwischen<br />
50 und 100 mg in das Thermodesorptionsrohr<br />
des TDS überführt und bei Temperaturen<br />
zwischen 150 und 200 °C im<br />
Inertgasstrom thermisch extrahiert. Die<br />
flüchtigen Analyten werden auf einem<br />
geeigneten Adsorbens (z. B. Tenax) in<br />
der Cryo-Falle (KAS) bei -50 °C getrappt<br />
und anschließend durch programmiertes<br />
Erhitzen in das GC überführt. Detektion<br />
und Quantifizierung der Analyten erfolgen<br />
mit einem Massenspektrometer im<br />
SIM-Modus.<br />
Resultat: Bei der Analyse sämtlicher<br />
verpackter Lebensmittel wurde festgestellt,<br />
dass sich die DIPN-Konzentration<br />
über die Zeit im Vergleich zum<br />
unverpackten Lebensmittel erhöht. Mit<br />
anderen Worten: Kein polymeres Primärverpackungsmaterial<br />
stellte eine<br />
hundertprozentige Migrationsbarriere<br />
dar. Dennoch wiesen die Primärverpackungen<br />
unterschiedliche, teils sehr gute<br />
Barriere-Eigenschaften auf. Tendenziell<br />
waren einfache Polyolefin-Systeme sehr<br />
viel schlechtere Barrieren als etwa komplexe<br />
Laminate oder metallisierte Folien.<br />
Fall II: Migration aus laminierten<br />
Arzneimittelverpackungen<br />
Durchgeführt wurde eine „Extractables“-<br />
Studie an einer laminierten Mehrkomponentenverpackung,<br />
bestehend aus folgenden<br />
Einzelkomponenten: flexibler Beutel,<br />
Dichtungssystem, Verschluss, Kathetersystem<br />
etc. Beim Verpackungsinhalt handelte<br />
es sich um eine flüssiges, lipophiles<br />
Arzneimittel. Die Strategie lag darin, mittels<br />
TDS-GC/MS zunächst die Einzelkomponenten<br />
zu untersuchen, anschließend<br />
das Gesamtsystem mit einem unpolaren<br />
Lösemittel zu füllen, bei erhöhter<br />
Temperatur („Worst case“-Szenario) zu<br />
lagern und den resultierenden Extrakt<br />
zu analysieren. Darin konnten letztlich<br />
mehrere Komponenten identifiziert und<br />
quantifiziert werden.<br />
Eine Komponente mit hoher Konzentration<br />
(>100 ppm) konnte jedoch<br />
nicht identifiziert werden. Der Vergleich<br />
des Extrakt-Chromatogramms mit<br />
dem der Einzelkomponenten enthüllte<br />
schließlich den Ursprung: das laminierte<br />
Polymerteil. Das Massenspektrum der<br />
unbekannten Komponente deutete auf<br />
die Verbindungsklasse „Phthalate“ hin,<br />
da ein intensives Fragment bei m/z = 149<br />
zu beobachten war. Es ließ sich allerdings<br />
kein kommerzielles Phthalat finden, das<br />
chromatographisch und massenspektrometrisch<br />
mit der unbekannten Verbindung<br />
übereinstimmte.<br />
Das Molekulargewicht der unbekannten<br />
Verbindung wurde mittels<br />
CI-MS ermittelt und mittels hochauflösender<br />
EI-MS die Summenformel<br />
bestimmt. Ebenso ließ sich das Fragment<br />
(m/z = 149) eindeutig der Summenformel<br />
C 8 H 5 O 3 + zuordnen, also einem typischen<br />
Phthalat-Fragment. Die TDS-GC/MS-<br />
Analyse der einzelnen Polymerteile und<br />
Klebstoffe zeigte schließlich, dass die<br />
Verbindung aus einer Klebstoffkomponente<br />
stammte. Laut Hersteller des Klebers<br />
handelte es sich hierbei um ein Polyesterdiol,<br />
aufgebaut aus Phthalsäure- und<br />
Dioleinheiten, was Rückschlüsse auf die<br />
postulierte Struktur lieferte (niedermolekulares<br />
Abbauprodukt des Polyesterdiols).<br />
Die Verbindung wurde bei „Ciba<br />
Expert Services“ synthetisiert, gereinigt,<br />
strukturell charakterisiert ( 1 H- und 13 C-<br />
NMR), qualifiziert und als Referenz mittels<br />
GC/MS analysiert. Resultat: gleiche<br />
GC-Retentionszeit und gleiches Massenspektrum<br />
wie die unbekannte Verbindung.<br />
Eine toxikologische Bewertung der<br />
Verbindung lieferte zudem eine Spezifikation<br />
der zumutbaren Tagesdosis. Mithilfe<br />
der synthetisierten Referenz sowie<br />
durch Einsatz spezifischer und sensitiver<br />
Analytik (LC/MS) konnte die Verbindung<br />
in der pharmazeutischen Formulierung,<br />
die im Verpackungssystem gelagert<br />
wurde, detektiert werden, allerdings<br />
unterhalb der Spezifikation. Fazit dieser<br />
Studie: Durch Anwendung der TDS-<br />
GC/MS auf Einzelkomponenten einer<br />
Pharmaverpackung konnte eine hochkonzentrierte<br />
„Extractables“-Verbindung<br />
im Extrakt der Gesamtverpackung<br />
schnell und einfach zugeordnet werden.<br />
Analytisches und chemisches Expertenwissen<br />
dienten der strukturellen Aufklärung<br />
der Verbindung. In weiteren<br />
„Leachables“-Studien muss nun gezeigt<br />
werden, dass die Verbindung auch nach<br />
längerer Lagerzeit nicht in die Stabilitätsproben<br />
der pharmazeutischen Formulierung<br />
aus der Verpackung in nennenswerter<br />
Konzentration migriert.<br />
Fall III: Migration aus bedruckten<br />
Arzneimittelverpackungen<br />
Im Fokus einer weiteren „Extractables“-<br />
Studie stand eine bedruckte Arzneimittelverpackung<br />
auf Polymerbasis, die ein<br />
flüssig-wässriges Pharmakon beinhaltete.<br />
Die Strategie der Studie glich jener im<br />
Fall II (laminierte Verpackung): TDS-<br />
GC/MS-Screening des bedruckten und<br />
unbedruckten Polymers, anschließend<br />
Befüllen des Gesamtsystems mit pola-<br />
Richtlinien für „Extractables & Leachables“-Studien an Arzneimittelverpackungen<br />
• EU-Pharmacopeia Chapter 3, incl. Supplement 5.1, 5.2 & 5.3<br />
• USP e.g. for elastomers, for polymer characterisation<br />
• FDA Guidance for Industry: <strong>Co</strong>ntainer Closure Systems for Packing Human Drugs and<br />
Biologics<br />
• FDA Guidance for Industry: Metered Dose Inhaler (MDI) and Dry Powder Inhaler (DPI)<br />
Drug Products<br />
• FDA Guidance for Industry: Nasal Spray and Inhalation Solution, Suspension and Spray<br />
Drug Products<br />
• EMEA CPMP/QWP/4359/03, Guideline on Immediate Packing Materials<br />
• EMEA CPMP/QWP/2845/00, Note for Guidance for Metered Dose Inhalation Products<br />
Packing Materials<br />
• EMEA CPMP/QWP/158/96, Note for Guidance on Dry Powder Inhaler<br />
Richtlinien für Migrationsstudien an Lebensmittelverpackungen<br />
• FDA-Guideline: „Preparation of Premarket Submissions for Food <strong>Co</strong>ntact Substances:<br />
Chemistry Recommendations“ (December 2007)<br />
• EU-Directive 82/711/EEC (including amendments)<br />
• EU-Directive 85/572/EEC<br />
• EU-Directive 2002/72/EC<br />
16 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
em Lösemittel, Lagerung bei erhöhter Temperatur<br />
(„Worst case“-Szenario) und Analyse des Extrakts<br />
mit unterschiedlichen Methoden.<br />
Neben typischen „Extractables“-Verbindungen<br />
aus polymeren Systemen (Oligomere, Plastikadditive)<br />
konnten im bedruckten Polymer Bestandteile<br />
der Druckformulierung wie Lösemittelrückstände<br />
und Abbauprodukte des Photoinitiators – eines Triarylsulfonium-Salzes<br />
– gefunden werden. Dabei<br />
handelte es sich u. a. um das kanzerogene Benzol.<br />
Im Extrakt des bedruckten Polymers wurde gezielt<br />
mittels HS-GC/MS nach Benzol gesucht, wobei die<br />
Quantifizierung im ppm-Bereich erfolgte.<br />
In einer sich anschließenden „Leachables“-Studie<br />
wurde die HS-GC/MS-Methode nach den so<br />
genannten ICH-Richtlinien („International <strong>Co</strong>nference<br />
on Harmonisation of Technical Requirements<br />
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use“)<br />
validiert. In Stabilitätsproben der pharmazeutischen<br />
Formulierung (gelagert in der bedruckten Verpackung)<br />
wurde Benzol im Bereich von 1 ppb quantifiziert.<br />
Das Vorhandensein dieser kanzerogenen Substanz<br />
erfordert eine Risikoabschätzung: Während<br />
die Aufnahme einer pharmazeutischen Formulierung<br />
von etwa 1 mL (typisch für Fertigspritzen) pro<br />
Tag (entspricht 1 ng Benzol) ein vergleichsweise vernachlässigbares<br />
Risiko für Patienten darstellt, erweist<br />
sich die Aufnahme von einem Liter einer pharmazeutischen<br />
Formulierung, wie es etwa bei Infusionen<br />
erfolgt und was der Aufnahme von rund 1 µg<br />
Benzol entspricht, als unzumutbares Risiko für den<br />
Patienten.<br />
Mit anderen Worten: Mittels TDS-GC/MS ließ<br />
sich in einer polymeren Verpackung Benzol einfach<br />
identifizieren. Im Extrakt der bedruckten Verpackung<br />
wurde diese kritische Verbindung dann gezielt<br />
gesucht – und gefunden. Die Verbindung konnte so<br />
auch in der pharmazeutischen Formulierung quantifiziert<br />
werden.<br />
Zusammenfassung und Diskussion<br />
Aus Gründen des Verbraucherschutzes muss dafür<br />
Sorge getragen werden, dass Materialien, die man<br />
für die Verpackung von Lebensmitteln und Pharmaka<br />
einsetzt, möglichst frei sind von schädlichen<br />
Verbindungen, die in das verpackte Gut migrieren<br />
können. Dies lässt sich im Bereich der Lebensmittelverpackung<br />
nicht alleine mit routinemäßigen Migrationsstudien<br />
bewerkstelligen. Vielmehr braucht es<br />
umfangreiche Studien, um die Barriere-Eigenschaften<br />
der Primärverpackungen gezielt zu verbessern.<br />
Beim Testen von Lebensmittel- und Arzneimittelverpackungen<br />
müssen unterschiedlichste analytische<br />
Methoden angewendet werden. Einen perfekten<br />
methodischen Einstieg in eine Studie zur Verpackungsanalyse<br />
liefert die TDS-GC/MS. Denn eine<br />
Chemikalie, die extrahierbar und migrationsfähig ist,<br />
lässt sich häufig auch thermodesorbieren. Besondere<br />
Kennzeichen solcher Verbindungen: niedriges Molekulargewicht,<br />
niedrige Polarität, und hoher Diffusionskoeffizient.<br />
Das TDS-Screening gibt einen erstklassigen<br />
Überblick über eine potenzielle Kontamination.<br />
Autoren<br />
Dr. Michael Jahn, Dr. Armin Hauk, Ciba Expert Services,<br />
CH-4002 Basel, Tel. +41 (0)61 6364117 bzw.<br />
+41 (0)61 6362904, E-Mail: michael.jahn@<br />
ciba.com und armin.hauk@ciba.com.<br />
Mit der TDS-GC/<br />
MS aufgezeichnetes<br />
Chromatogramm<br />
gleicher<br />
Mengen recyclierten<br />
(A) und<br />
„frischen“ (B)<br />
Kartons: Recycling<br />
hat Vorteile,<br />
birgt aber auch<br />
Risiken durch<br />
eine potenziell<br />
hohe Schadstoffbelastung.<br />
TDS-GC/MS<br />
Chromatogramme<br />
einiger<br />
Einzelteile der<br />
Mehrkomponenten-Pharmaverpackung<br />
sowie<br />
eines organischen<br />
Extrakts.<br />
Die markierte<br />
Verbindung (*)<br />
konnte nicht ad<br />
hoc identifiziert<br />
werden.<br />
EI-Massenspektrum<br />
der<br />
unbekannten<br />
Verbindung im<br />
laminierten<br />
Verpackungssystem:<br />
Das<br />
Massenspektrum<br />
deutete auf die<br />
Verbindungsklasse<br />
„Phthalate“ hin,<br />
da ein intensives<br />
Fragment bei m/z<br />
= 149 zu beobachten<br />
war.<br />
TDS-GC/MS-<br />
Chromatogramm<br />
eines Teils der<br />
bedruckten und<br />
– zum Vergleich<br />
– unbedruckten<br />
polymeren Pharmaverpackung.<br />
1: Benzol, 2:<br />
Diphenylsulfid.<br />
HS-GC/MS-<br />
Chromatogramme<br />
(SIM-Modus) der<br />
pharmazeutischen<br />
Formulierung,<br />
gelagert mal in<br />
bedruckter, mal<br />
in unbedruckter<br />
polymerer Pharmaverpackung.<br />
Die detektierte<br />
Verbindung ist<br />
Benzol.<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 17
Metabolit-Profiling II<br />
Aminosäuren vollständig<br />
automatisiert analysieren<br />
Mitte des letzten Jahrhunderts kamen Wissenschaftler auf die naheliegende Idee, durch Bestimmung<br />
der Aminosäurenkonzentration Stoffwechselerkrankungen zu diagnostizieren – schließlich sind<br />
Aminosäuren an vielen wichtigen Stoffwechselvorgängen beteiligt. Die Gaschromatographie,<br />
verbunden mit der Massenspektrometrie (GC/MS), bietet ideale Voraussetzungen zur quantitativen<br />
Bestimmung von Aminosäuren in biologischen Matrices. Wie effizient die Analytik ist, hängt von ihrem<br />
Automatisierungsgrad ab.<br />
Aufbau der <strong>GERSTEL</strong>-MultiPurpose-<br />
Sampler-PrepStation<br />
minosäuren sind für Mensch und<br />
A Tier gleichermaßen wichtig, können<br />
jedoch nur in begrenztem Umfang<br />
vom Organismus produziert werden.<br />
Eine Reihe Aminosäuren, namentlich die<br />
essenziellen, müssen wir mit der Nahrung<br />
aufnehmen. Aminosäuren sind die<br />
Bausteine der Proteine und erfüllen eine<br />
Vielzahl wichtiger Funktionen im Organismus.<br />
Die Aminosäure Tyrosin etwa<br />
wird zu Katecholamin umgewandelt, also<br />
in ein Hormon, das anregend und stabilisierend<br />
auf das Herz-Kreislauf-System<br />
wirkt. Glutamat wiederum dient als Neurotransmitter,<br />
das heißt, es überträgt neuronale<br />
Signale.<br />
Aufgrund ihrer Einbindung in viele<br />
Stoffwechselvorgänge lassen sich Aminosäuren<br />
als wichtige Marker u. a. für<br />
angeborene Stoffwechselerkrankungen<br />
verwenden. Zu den bekanntesten gehört<br />
die Phenylketonurie (PKU): Der Organismus<br />
ist hierbei nicht in der Lage, Phenylalanin<br />
abzubauen; die Aminosäure reichert<br />
sich im Körper an und beeinträchtigt<br />
die geistige Entwicklung des Menschen.<br />
Diagnostizieren lässt sich die PKU<br />
über die Bestimmung der erhöhten Phenylalanin-Konzentration.<br />
Aus praktischen<br />
Gesichtspunkten werden Aminosäuren<br />
insbesondere in Körperflüssigkeiten<br />
wie Blutplasma und Urin bestimmt.<br />
Zur Bestimmung von Aminosäuren<br />
in biologischen Proben kommen häufig<br />
kommerzielle Aminosäurenanalysatoren<br />
zum Einsatz; ihr Funktionsprinzip<br />
basiert auf der Kationenaustausch-Chromatographie<br />
mit Nachsäulenderivatisierung<br />
und UV-Detektion. Nachteil dieser<br />
Methode ist ihr enorm hoher Zeitaufwand.<br />
Als attraktive, weil effiziente Alternative<br />
empfiehlt sich die Gaschromatographie<br />
mit massenselektiver Detektion<br />
(GC/MS), wobei die Aminosäuren mittels<br />
Chlorameisensäurepropylester in<br />
flüchtige und damit GC-gängige Derivate<br />
umgesetzt werden.<br />
„Damit die Methode für einen hohen<br />
Probendurchsatz geeignet ist, haben wir<br />
die Probenvorbereitung vollständig automatisiert“,<br />
sagt Dr. Katja Dettmer, Projektleiterin<br />
Metabolomics am Institut<br />
für funktionelle Genomik von Prof. Dr.<br />
Peter Öfner an der Universität Regensburg.<br />
Alle relevanten Schritte, angefangen<br />
bei der Zugabe des internen Standards<br />
(IS) über die Derivatisierung bis hin<br />
zur Probenaufgabe in das GC/MS-System,<br />
erfolgen mit der <strong>GERSTEL</strong>-MPS-<br />
PrepStation vollständig automatisiert.<br />
Dr. Dettmer: „Durch die Automatisierung<br />
konnten wir den manuellen Arbeitsaufwand<br />
minimieren und gleichzeitig die<br />
Reproduzierbarkeit verbessern.“<br />
Die MPS-PrepStation verfügt über<br />
zwei voneinander unabhängig arbeitende<br />
Roboterarme. Während einer im vorliegenden<br />
Fall für die Addition der Derivatisierungsreagenzien<br />
mit einer Flüssigspritze<br />
im mL-Maßstab ausgestattet<br />
ist, erfolgt die Zugabe des internen<br />
Standards (IS) sowie die Probenaufgabe<br />
der notwendig kleinen Probenmenge<br />
mittels des zweiten Arms, der mit einer<br />
µL-Flüssigspritze ausgestattet ist.<br />
Neben diesem Hardware-spezifischen<br />
Aspekt bietet die zugrunde liegende<br />
komfortable Softwaresteuerung<br />
(<strong>GERSTEL</strong>-MAESTRO-Software)<br />
den Vorteil einer intuitiven Bedienoberfläche,<br />
bei der sich die erforderlichen Probenvorbereitungsschritte<br />
bequem aus<br />
einer übersichtlichen Tabelle per Mausklick<br />
zusammenstellen und dank Prep-<br />
Ahead-Funktion mit der GC/MS-Analyse<br />
zeitlich verschachteln lassen.<br />
Und so gingen die Wissenschaftler<br />
vor: Die biologische Probe, etwa Blut<br />
18 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
oder Urin, wird in ein Glasrollrandfläschchen<br />
(Vial) dosiert und mit einem magnetischen<br />
Deckel luftdicht verschlossen.<br />
Die Vials werden anschließend in den<br />
gekühlten Probenhalter der MPS-Prep-<br />
Station gestellt. Alle weiteren Schritte<br />
erfolgen automatisiert, dank magnetischer<br />
Verschlusskappen einschließlich<br />
Transport der Vials zum Schüttler, der<br />
die Probe auf Wunsch rührt und schüttelt<br />
sowie erwärmt und abkühlt. Zur<br />
Analyse werden je nach Probenmatrix<br />
20 bis 50 µL Probe eingesetzt. Folgende<br />
Schritte werden von der MPS-Prep-<br />
Station voll automatisiert durchgeführt:<br />
1. Zugabe des internen Standards (Mix<br />
von 19 13 C und 15 N markierten Aminosäuren<br />
und zwei deuterierten Verbindungen).<br />
2. Verdünnungsschritt.<br />
3. Zugabe einer Natriumhydroxid-<br />
Lösung, einer Picolin-Lösung, die als<br />
Katalysator fungiert, sowie des Derivatisierungsreagenz<br />
Chlorameisensäurepropylester.<br />
4. Mischen der Probe im Schüttler<br />
und 5. Extraktion der gebildeten Derivate<br />
mit einem organischen Lösemittel,<br />
namentlich Isooktan, „das mit der wässrigen<br />
Probe im Zweiphasensystem die<br />
obere Phase bildet“, erklärt Dr. Dettmer.<br />
Mit einer 10-µL-Spritze werden aus<br />
der oberen Phase 2,5 µL entnommen<br />
und direkt in den Gaschromatographen<br />
injiziert. Die Trennung erfolgt auf einer<br />
ZB-AAA-Säule (Phenomenex Inc.).<br />
Verwendet wurde ein Agilent GC 6890,<br />
ausgestattet mit dem <strong>GERSTEL</strong>-Kalt-<br />
AufgabeSystem (KAS) als PTV-lnjektor.<br />
Die Detektion erfolgte mit einem Agilent<br />
MSD 5975 parallel im Scan- und SIM-<br />
Modus, wobei für jede Aminosäure zwei<br />
charakteristische Massenfragmente aufgenommen<br />
wurden.<br />
Dettmer und Kollegen bestimmten<br />
mit ihrer MPS-KAS-GC/MS-<br />
Methode 33 Aminosäuren und<br />
Dipeptide quantitativ: Alanin, Sarcosin,<br />
Glycin, α-Aminobuttersäure,<br />
Valin, β-Aminoisobuttersäure, Leucin,<br />
Allo-Isoleucin, Isoleucin, Threonin,<br />
Serin, Prolin, Asparagin, Thiaprolin,<br />
Aspartat, Methionin, Hippursäure,<br />
Hydroxyprolin, Glutamat,<br />
Phenylalanin, α-Aminoadipinsäure,<br />
α-Aminopimelinsäure, Glutamin,<br />
Ornithin, Glycyl-Prolin, Lysin, Histidin,<br />
Hydroxylysin, Tyrosin, Prolin-Hydroxyprolin,<br />
Tryptophan, Cystathionin<br />
und Cystin. Die Quantifizierung erfolgte<br />
über Kalibrierkurven unter Einsatz einer<br />
Reihe interner Standards, bestehend aus<br />
einem Mix von 13 C- und 15 N-markiertem<br />
Alanin, Glycin, Valin, Leucin, Isoleucin,<br />
Threonin, Serin, Prolin, Asparagin,<br />
Aspartat, Methionin, Glutamat,<br />
Phenylalanin, Glutamin, Lysin, Histidin,<br />
Tyrosin, Tryptophan, Cystin sowie<br />
[D 5 ]-Hippursäure und [2,5,5-D 3 ]-α-<br />
Aminoadipinsäure.<br />
„Die Aminosäuren, für die kein interner<br />
Standard zur Verfügung stand, wurden<br />
mit der isotopenmarkierten Aminosäure<br />
korrigiert, die am nächsten eluierte“,<br />
erklärt Dr. Dettmer. Durch die Verwendung<br />
stabiler isotopenmarkierter Aminosäuren<br />
als internem Standard wurde<br />
eine deutliche Verbesserung von Reproduzierbarkeit<br />
und Korrelationskoeffizient<br />
der Kalibrierung erzielt. „Die GC<br />
der 33 Aminosäuren dauert weniger als<br />
zehn Minuten, ist also deutlich schneller<br />
als auf herkömmliche Weise“, freut sich<br />
die Wissenschaftlerin.<br />
Für die meisten Aminosäuren wurde<br />
in einem Bereich von 0,3-2000 µM kalibriert,<br />
bei Einsatz von 50 µL biologischer<br />
Flüssigkeit. Der Bereich der Nachweisgrenzen<br />
(Limit of Detection, LoD) lag<br />
zwischen 0,03 µM für die Aminosäuren<br />
Alanin, Glycin oder Tryptophan und 12<br />
µM für Glutamin und Prolin-Hydroxyprolin;<br />
die unterste Quantifizierungsgrenze<br />
(Limit of Quantification, LOQ)<br />
lag zwischen 0,3 und 30 µM.<br />
Die Methode wurde laut Dr. Dettmer<br />
auf verschiedene biologische Proben<br />
erfolgreich angewendet und die Reproduzierbarkeit<br />
bestimmt. Untersucht wurde<br />
Harn von Menschen und Mäusen sowie<br />
Plasma, wobei jeweils eine zehnfache<br />
Bestimmung durchgeführt und die relative<br />
Standardabweichung (RSD) berechnet<br />
wurde. Sie lag zwischen 2,0 und 8,8<br />
Prozent für menschlichen Harn, zwischen<br />
0,9 und 8,3 Prozent für menschliches<br />
Plasma und zwischen 1,3 und 9,1<br />
Prozent für Mäuseharn.<br />
„Mit unserer Methode lassen sich<br />
biologische Proben wie Urin, Zellkulturen,<br />
Zellextrakte und Plasma mühelos<br />
und sicher analysieren“, bestätigt<br />
Dr. Dettmer. Eine Anwendung ist die<br />
Bestimmung der Aminosäurenkonzentration<br />
in Körperflüssigkeiten zwecks Diagnose<br />
der bereits erwähnten angeborenen<br />
Stoffwechselstörungen. Neben der<br />
klinischen Diagnostik spielt die Bestimmung<br />
von Aminosäuren in der Lebensmittelanalytik<br />
eine besondere Rolle, da<br />
die essenziellen Aminosäuren bekanntermaßen<br />
unter normalen Umständen ausschließlich<br />
mit der Nahrung dem Organismus<br />
zugeführt werden können.<br />
Wie die Praxis zeige, bestätigt Dr.<br />
Katja Dettmer, ließe sich die MPS-KAS-<br />
GC/MS-Methode auch auf die Analyse<br />
von Aminosäuren in Lebensmitteln wie<br />
Milch, Bier und Saft anwenden. Um die<br />
Anwendbarkeit ihrer Methode in der<br />
Lebensmittelanalytik zu demonstrieren,<br />
haben sie und ihre Kollegen exemplarisch<br />
Apfelsaft, Bier und Sojasoße untersucht.<br />
Am Rande bemerkt: Sojasoße ist eine asiatische<br />
Würzsauce, bestehend aus Wasser,<br />
Sojabohnen, Getreide und Salz. Wie<br />
die Analyse zeigt, schildert die Wissenschaftlerin,<br />
enthält Sojasoße viele Aminosäuren<br />
in zum Teil überragend großen<br />
Mengen, wobei Glutamat mit 47,73<br />
mM dominiert. Die Hauptaminosäuren<br />
in Apfelsaft sind Alanin, Prolin, Asparagin,<br />
Aspartat und Glutamat, wobei Asparagin<br />
mit einer Konzentration von 3,16<br />
µM heraussticht.<br />
Im Bier machen die Aminosäuren<br />
Alanin mit 1,13 mM und Prolin mit<br />
3,56 mM die Hauptkomponenten aus.<br />
„Die Resultate zeigen deutlich“, fasst<br />
Dr. Katja Dettmer zusammen, „dass<br />
sich unsere automatisierte MPS-KAS-<br />
GC/MS-Methode hervorragend zum<br />
Nachweis von Aminosäuren in biologischen<br />
Matrices eignet, sei es in Blut und<br />
Urin oder auch in Lebensmitteln.“<br />
Chromatogramm einer<br />
Vollmilchprobe. Aminosäuren,<br />
die einen<br />
Isotopen-markierten<br />
Standard haben, sind<br />
in der Abbildung rot<br />
markiert.<br />
Weitere Informationen<br />
Dr. Katja Dettmer,<br />
Universität<br />
Regensburg,<br />
Institut für Funktionelle<br />
Genomik,<br />
Josef-Engert-Str. 9,<br />
D-93053<br />
Regensburg,<br />
Tel. +49 (0) 941 943 5015,<br />
E-Mail: katja.dettmer@klinik.uniregensburg.de.<br />
Sie können Ihre Anfrage auch direkt<br />
an aktuell@gerstel.de richten.<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 19
Automatisierte Probenvorbereitung<br />
Auf Droge?<br />
Umfassende Harnanalyse auf Drogenkonsum und Medikamentenmissbrauch mittels automatisierter<br />
dispersiver Festphasenextraktion (Disposable Pipette Extraction, DPX) und HPLC-MS/MS<br />
mit „Dynamic Multiple Reaction Monitoring“ (MRM).<br />
Groß im Einsatz: Der <strong>GERSTEL</strong>-MultiPurpose-<br />
Sampler (MPS2XL) mit DPX-Option.<br />
Um biologische Proben auf Rückstände<br />
von Drogen und Medikamenten<br />
wie Benzodiazepinen zu untersuchen,<br />
ist es notwendig, die Probe so<br />
vorzubereiten, dass weder Matrixeffekte<br />
noch Ionensuppression auftreten können.<br />
Die Festphasenextraktion (SPE) ist im<br />
Allgemeinen die bevorzugte Technik zur<br />
Matrixabtrennung; in der hier beschriebenen<br />
Untersuchung wurde zur Extraktion<br />
die automatisierte, so genannte Disposable<br />
Pipette Extraction (DPX) verwendet.<br />
DPX ist eine schnelle dispersive<br />
Festphasenextraktionstechnik unter Verwendung<br />
lose in einer Einwegpipettenspitze<br />
liegender Sorbentien. Die Probe<br />
wird in die Spitze gesaugt und aktiv mit<br />
dem Sorbens vermischt. Die Vorteile<br />
der DPX-Technologie bestehen hauptsächlich<br />
darin, dass die Extraktion sehr<br />
schnell vonstattengeht, wenig Lösungsmittel<br />
verbraucht wird und der gesamte<br />
Prozess voll automatisiert werden kann,<br />
einschließlich der Probenaufgabe ins<br />
chromatographische System. Der MPS-<br />
Autosampler von <strong>GERSTEL</strong> erledigt<br />
DPX-Extraktionen in etwa fünf Minuten<br />
unter Einsatz verschiedenartiger Sorbentien:<br />
Reversed Phase (DPX-RP), Kationentauscher<br />
(DPX-CX), schwache Anionentauscher<br />
(DPX-WAX) oder Festphasen<br />
zur Aufreinigung so genannter<br />
QuEChERS-Extrakte.<br />
Zur Bestimmung von Wirkstoffen<br />
und deren Metaboliten aus Arzneimittelrückständen<br />
sind GC/MS oder HPLC-<br />
MS/MS im Allgemeinen die bevorzugten<br />
Techniken. Der Vorteil bei der LC-MS/<br />
MS ist, dass sich eine Derivatisierung der<br />
Analyten erübrigt, sodass die Probenvorbereitung<br />
vereinfacht wird und weniger<br />
Zeit raubt. Hinzu kommt, dass die hocheffiziente<br />
Ionisierung, kombiniert mit der<br />
Tandem-Massenspektrometrie, zu höherer<br />
Sensitivität und Selektivität führt.<br />
Im Mittelpunkt dieser Untersuchung<br />
stand die automatisierte Extraktion geringer<br />
Probenvolumina für die LC-MS/MS,<br />
um für einen hohen Analysendurchsatz<br />
zu sorgen („one sample at a time“). Die<br />
Gesamtdauer der Analyse konnte ver-<br />
Vorbehandlung der Urinproben<br />
• 260 μL Urin in ein sauberes Reagenzglas<br />
(12 x 75 mm) pipettieren.<br />
• 250 μL einer 1,0 M HCl in das Röhrchen<br />
pipettieren und für einige Sekunden<br />
vortexen.<br />
• 250 μL Acetonitril in das Reagenzglas<br />
pipettieren und für einige Sekunden<br />
vortexen.<br />
• Probe mit einem 2-in-1-Spritzenfilter<br />
von Agilent filtern und das Filtrat in<br />
einem sauberen Reagenzglas (12 x 75<br />
mm) sammeln.<br />
• Gefilterte Urinprobe auf dem GERS-<br />
TEL-MultiPurposeSampler (MPS XL)<br />
mit DPX-Option platzieren.<br />
Vorbehandlung der Vollblutproben<br />
• 200 μL Vollblut in ein sauberes Reagenzglas<br />
(12 x 75 mm) pipettieren.<br />
• 800 µL Acetonitril in das Röhrchen<br />
geben und für einige Sekunden vortexen.<br />
• Für zehn Minuten zentrifugieren und<br />
den Überstand in ein sauberes Röhrchen<br />
(12 x 75 mm) überführen.<br />
• Die Probe auf dem <strong>GERSTEL</strong>-Multi-<br />
PurposeSampler (MPS XL) mit DPX-<br />
Option platzieren.<br />
kürzt beziehungsweise die Produktivität<br />
erhöht werden, weil sich Probenvorbereitung<br />
und Analyse der vorherigen Probe<br />
miteinander zeitlich verschachteln ließen.<br />
20 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
Der DPX-Prozess<br />
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5<br />
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5<br />
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5<br />
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5<br />
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5<br />
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5<br />
Sofern erforderlich, lässt sich das Sorbens in der<br />
Pipette mit einem Lösemittel vor der Extraktion<br />
konditionieren. Sämtliche Schritte der DPX verlaufen<br />
auf dem MPS-Autosampler automatisiert:<br />
1<br />
Die Probe wird aus der Vorlage in die Pipettenspitze<br />
gezogen, ohne mit der Nadel der<br />
Mikroliterspritze in Berührung zu kommen.<br />
DPX-Spitze<br />
Festphase<br />
konditionieren*<br />
*optionale Schritte, methodenabhängig<br />
Probe aufziehen<br />
durchmischen<br />
Probe<br />
Gas<br />
Probe entfernen<br />
waschen*<br />
eluieren<br />
Extrakt<br />
2<br />
3<br />
Durch Ansaugen von Luft werden Probe und<br />
Sorbens optimal gemischt, mit dem Resultat einer<br />
effizienten Extraktion mit hoher Ausbeute.<br />
Nach 20 bis 30 Sekunden ist die Extraktion<br />
erfolgreich beendet; die Probenflüssigkeit wird<br />
aus der Pipettenspitze entleert. Bei Bedarf lässt<br />
sich ein Waschschritt einfügen.<br />
4<br />
Anschließend werden die extrahierten Analyten mittels<br />
eines geeigneten Lösemittels eluiert und der Extrakt wird<br />
in ein vorbereitetes Vial pipettiert.<br />
Die Extraktion einer Probe dauert nur wenige Minuten.<br />
Probenvorbereitung und Analyse verlaufen zeitlich<br />
verschachtelt.<br />
Experimenteller Teil<br />
Ausstattung: Die Trennung der Analyten<br />
erfolgte auf einem HPLC 1200,<br />
ihre Detektion auf einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer<br />
6410 mit<br />
ESI-Quelle (beide Geräte von Agilent<br />
Technologies). Für die Probenvorbereitung<br />
und die Probenaufgabe wurde der<br />
MultiPurposeSampler (MPS XL) von<br />
<strong>GERSTEL</strong> verwendet.<br />
Material: Benzodiazepin-Multikomponenten-Mixtur<br />
8 von Cerilliant (enthält<br />
acht Komponenten in Acetonitril: Clonazepam,<br />
Temazepam, Nitrazepam, Alprazolam,<br />
Diazepam, Flunitrazepam, Lorazepam<br />
und Oxazepam, 250 μg/mL; enthält acht<br />
Komponenten in Methanol: Nordiazepam,<br />
Clobazam, Bromazepam, Estazolam, Flurazepam,<br />
Midazolam, Triazolam, 1,0 mg/mL,<br />
und α-Hydroxyalprazolam, 100 µg/mL).<br />
Aus den 16 Benzodiazepinen wurde eine<br />
wässrige Stammlösung bereitet, aus der eine<br />
Verdünnungsreihe hergestellt wurde. Deuterierte<br />
Benzodiazepin-Analoga (d 5 -Nordiazepam,<br />
d 5 -α-Hydroxyalprazolam, d 5 -Oxa-<br />
zepam, d 4 -Clonazepam und d 5 -Estazolam,<br />
jedes in Methanol, 100 µg/mL) wurden von<br />
Cerilliant bezogen.<br />
Extraktion: Ein MultiPurposeSampler<br />
(MPS) von <strong>GERSTEL</strong> wurde zur<br />
Extraktion des hydrolysierten Urins<br />
mit 1-mL-DPX-CX-Pipettenspitzen<br />
bestückt. Folgende Methode zur<br />
Automatisierung kam zur Anwendung:<br />
250 μL eines 30-prozentigen Acetonitril-Wasser-Gemischs<br />
wurden langsam<br />
(Fließgeschwindigkeit: 50 μL/s) durch<br />
Analysenbedinungen HPLC<br />
Säule:<br />
Zorbax Eclipse<br />
XDB C18 RRHT<br />
(2,1 mm x 50 mm, 1,8 µm)<br />
Eluenten: A – 20 mM Ammoniumformiat,<br />
pH 8.6<br />
B - 10% Isopropanol in<br />
Methanol<br />
Gradient:<br />
Zeit (min)<br />
Fluss (mL/min) Druck (bar) % B<br />
0 0,2 600 45<br />
2 0,2 600 45<br />
5 0,2 600 95<br />
9 0,2 600 95<br />
9,5 0,2 600 45<br />
Säulen-Temperatur: 35 °C<br />
Injektionsvolumen: 2,5 µL<br />
Laufzeit:<br />
10 min<br />
Analysenbedingungen MS<br />
Ionisierung: ESI positive ion mode<br />
Gas-Temperatur: 350 °C<br />
Gas-Fluss (N2): 12 L/min<br />
Nebulizer pressure: 35 psi<br />
Capillary:<br />
4,5 kV<br />
Analyten Precursor- Produkt- Fragmentor CE (V)<br />
Ion [m/z] Ion(en) [m/z] Spannung(V)<br />
Bromazepam 316 182 (209) 140 (140) 30 (25)<br />
Nitrazepam 282 236 (180) 160 (160) 25 (35)<br />
d 4 -Clonazepam 320 274 120 30<br />
Flunitrazepam 314 239 (268) 160 (160) 35 (30)<br />
Clonazepam 316 270 (214) 120 (120) 25 (30)<br />
d 5 -a-OH-Alprazolam 330 302 120 30<br />
d5-Estazolam 300 272 140 25<br />
a-OH-alprazolam 325 216 (297) 120 (120) 35 (30)<br />
Estazolam 295 205 (267) 160 (160) 40 (25)<br />
Clobazam 301 224 (259) 140 (140) 30 (15)<br />
Triazolam 343 239 (308) 180 (180) 40 (25)<br />
Alprazolam 309 274 (281) 160 (160) 30 (25)<br />
d 5 -Oxazepam 292 246 120 20<br />
Oxazepam 287 241 (269) 120 (120) 20 (15)<br />
Lorazepam 321 229 (275) 140 (140) 30 (20)<br />
Temazepam 301 255 (177) 120 (120) 35 (40)<br />
d 5 -Nordiazepam 276 213 160 30<br />
Nordiazepam 271 140 (165) 160 (160) 30 (30)<br />
Midazolam 326 249 (291) 180 (180) 40 (25)<br />
Diazepam 285 222 (257) 160 (160) 25 (25)<br />
Flurazepam 388,1 288 (315) 140 (140) 25 (20)<br />
Parameter der MS/MS-Detektion.<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 21
Chromatogramme (EIC) einer Urinprobe, versetzt mit 7,5 ng/mL einer Standard-Lösung, nach DPX.<br />
die DPX-Pipettenspitze geleitet, um<br />
das Sorbens zu befeuchten. Die Probe<br />
wurde dann in die DPX-Pipettenspitze<br />
gesaugt und mit dem Sorbens vermischt;<br />
dazu wurden 1,3 mL Luft eingezogen.<br />
Die Äquilibrierung dauerte 20 Sekunden,<br />
anschließend wurde die Lösung<br />
entfernt. Zum Auswaschen von Matrixbestandteilen<br />
wurde das Sorbensmaterial<br />
durch die DPX-Pipettenspitze mit<br />
500 μL einer 10-prozentigen Acetonitril-<br />
Wasser-Waschlösung gespült. Es folgte<br />
ein zusätzlicher Waschschritt unter Verwendung<br />
100-prozentigen Acetonitrils.<br />
Die Elution der Analyten erfolgte<br />
mit 700 μL einer Methylenchlorid-Isopropanol-Ammoniumhydroxid-Lösung<br />
[78/20/2 (v/v)], die in die DPX-Pipettenspitze<br />
aufgezogen wurde. Das Eluat<br />
wurde unmittelbar in saubere 2-mL-Vials<br />
pipettiert, dann bis zur Trockenen eingedampft<br />
und mittels Zugabe von 50 μL<br />
Wasser wieder in Lösung gebracht.<br />
Repräsentative Kalibrationsgeraden von Triazolam und Clonazepam.<br />
Ergebnis und Diskussion<br />
Die DPX-CX-Extraktionen ließen sich<br />
mit dem MultiPurposeSampler (MPS)<br />
rasch und leicht durchführen. Weil ein<br />
basischer Eluent zur Elution der Analyten<br />
vom Kationentauscher verwendet<br />
wurde, war es erforderlich, vor der HPLC-<br />
Trennung das Lösemittel zu wechseln.<br />
Mit Blick auf die weltweite Verknappung<br />
von Acetonitril wurde eine Alternative<br />
als organischer Zusatz zur mobilen<br />
HPLC-Phase gesucht und im zehnprozentigen<br />
Isopropanol gefunden. Sämtliche<br />
HPLC-MS-Spektren wurden mittels<br />
MRM (Dynamic Multiple Reaction<br />
Monitoring) erfasst, was eine hohe Sensitivität<br />
bei der Analyse niedriger Arzneimittelkonzentrationen<br />
gewährleistet.<br />
Die gewählte Säule garantierte eine<br />
rasche Trennung der Analyten innerhalb<br />
von zehn Minuten.<br />
Schlussfolgerung<br />
Komponente R 2 LOQ<br />
[ng/mL]<br />
Temazepam C 0,9917 0,5<br />
Alprazolam C 0,9901 0,5<br />
Oxazepam C 0,9950 0,5<br />
Lorazepam C 0,9908 0,5<br />
Estazolam D 0,9955 0,5<br />
a-OH-alprazolam A 0,9958 0,5<br />
Flurazepam B 0,9937 0,5<br />
Midazolam B 0,9919 0,5<br />
Flunitrazepam E 0,9959 0,5<br />
Diazepam B 0,9969 0,5<br />
Clonazepam E 0,9974 0,5<br />
Clobazam C 0,9947 0,5<br />
Bromazepam E 0,9973 0,5<br />
Triazolam C 0,9783 0,5<br />
Nordiazepam B 0,9941 0,5<br />
Nitrazepam C 0,9910 0,5<br />
Ergebnis der Kalibrierung;<br />
verwendete interne Standards:<br />
d 5 -a-Hydroxyalprazolam (A),<br />
d 5 -Nordiazepam (B),<br />
d 5 -Oxazepam (C),<br />
d 5 -Estazolam (D) und<br />
d 4 -Clonazepam (E).<br />
Wiederfindung der untersuchten<br />
16 Benzodiazepine mit<br />
der DPX-LC-MC/MS-Methode:<br />
Die geringe Wiederfindungsrate<br />
von Clobazam basiert auf einer<br />
niedrigen Extraktionseffizienz. Im<br />
Gegensatz zu den anderen Benzodiazepinen<br />
enthält Clobazam keine<br />
protonierbaren Stickstoffzentren<br />
in der chemischen Struktur und<br />
bindet daher eher schlecht an das<br />
DPX-CX-Material. Dieses Ergebnis<br />
bestätigt die Spezifität des DPX-CX-<br />
Sorptionsmittels.<br />
Komponente Wiederfindung [%]<br />
Alprazolam 65<br />
a-OH alprazolam 100<br />
Clonazepam 91<br />
Diazepam 80<br />
Flunitrazepam 86<br />
Lorazepam 49<br />
Nitrazepam 93<br />
Nordiazepam 91<br />
Oxazepam 91<br />
Temazepam 84<br />
Estazolam 90<br />
Clobazam 6<br />
Triazolam 54<br />
Flurazepam 82<br />
Midazolam 57<br />
Bromazepam 43<br />
22 <strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010
Komponente QC1 QC2 QC3<br />
7.5 ng/mL 30 ng/mL 75 ng/mL<br />
a-OH-Alprazolam Mittelwert 7,50 29,8 78,7<br />
%RSD 4,30 1,40 2,31<br />
%Accuracy 101 99,3 105<br />
N 6 5 6<br />
Estazolam Mittelwert 7,31 30,5 80,6<br />
%RSD 1,52 1,01 1,55<br />
%Accuracy 99,3 102 108<br />
N 6 5 6<br />
Lorazepam Mittelwert 6,04 29,5 91,4<br />
%RSD 8,97 8,48 11,5<br />
%Accuracy 89,3 98,3 122<br />
N 6 5 6<br />
Oxazepam Mittelwert 7,21 30,3 79,6<br />
%RSD 1,74 1,68 1,22<br />
%Accuracy 98,6 101 106<br />
N 6 5 6<br />
Temazepam Mittelwert 6,97 30,3 78,5<br />
%RSD 1,96 2,29 1,72<br />
%Accuracy 97,2 101 105<br />
N 6 5 6<br />
Alprazolam Mittelwert 6,65 29,4 86,8<br />
%RSD 5,03 4,25 3,24<br />
%Accuracy 93,7 97,9 116<br />
N 6 5 6<br />
Clobazam Mittelwert 7,54 31,6 66,4<br />
%RSD 13,7 5,67 15,3<br />
%Accuracy 101 105 88,5<br />
N 6 5 6<br />
Clonazepam Mittelwert 7,30 29,3 79,0<br />
%RSD 1,91 2,05 1,75<br />
%Accuracy 97,7 97,5 105<br />
N 6 5 6<br />
Komponente QC1 QC2 QC3<br />
7.5 ng/mL 30 ng/mL 75 ng/mL<br />
Diazepam Mittelwert 6,96 30,1 83,7<br />
%RSD 3,67 3,95 2,19<br />
%Accuracy 97,7 100 112<br />
N 6 5 6<br />
Flunitrazepam Mittelwert 7,33 29,9 80,4<br />
%RSD 1,67 2,85 1,36<br />
%Accuracy 98,5 100 107<br />
N 6 5 6<br />
Flurazepam Mittelwert 6,15 27,8 89,0<br />
%RSD 9,96 10,3 5,25<br />
%Accuracy 86,6 92,5 119<br />
N 6 5 6<br />
Midazolam Mittelwert 6,02 27,7 87,9<br />
%RSD 9,12 9,37 7,40<br />
%Accuracy 84,9 92,4 117<br />
N 6 5 6<br />
Nitrazepam Mittelwert 7,15 29,5 80,2<br />
%RSD 2,17 4,59 1,44<br />
%Accuracy 97,6 98,4 107<br />
N 6 5 6<br />
Nordiazepam Mittelwert 7,38 29,3 77,8<br />
%RSD 2,63 2,10 1,77<br />
%Accuracy 99,5 97,8 104<br />
N 6 5 6<br />
Triazolam Mittelwert 6,13 27,0 81,7<br />
%RSD 6,46 3,69 9,79<br />
%Accuracy 86,7 89,9 109<br />
N 6 5 6<br />
Bromazepam Mittelwert 8,20 31,0 102,0<br />
%RSD 14,8 15,5 26,4<br />
%Accuracy 104 103 136<br />
N 6 5 6<br />
Statistische Auswertung der Bestimmung von Benzodiazepinen in Urin.<br />
Die automatisierte DPX-Extraktion von<br />
Benzodiazepinen aus Urin gelang erfolgreich<br />
mit dem MPS. In der hier vorgestellten<br />
Untersuchung betrug die Extraktionszeit<br />
insgesamt 6,5 Minuten. Die Probenaufbereitung<br />
nahm insgesamt weniger<br />
Zeit in Anspruch als der chromatographische<br />
Probendurchlauf; von daher<br />
kann die nächste Probe bereits bearbeitet<br />
werden, während die Analyse der laufenden<br />
Probe noch im Gange ist. Jedesmal<br />
wenn das LC-MS/MS-System einen<br />
Durchlauf beendet hat, steht die nächste<br />
Probe schon zur Aufgabe bereit; somit<br />
ist ein höchstmöglicher Probendurchsatz<br />
gewährleistet. Überdies stellt die Probenvorbereitung<br />
just in time sicher, dass die<br />
Probe vor Beginn der Analyse nicht zu<br />
lange im Autosampler verweilt. Bei der<br />
Bestimmung von Benzodiazepinen in<br />
Urin wurden mithilfe der DPX-LC-<br />
MS/MS-Methode niedrige Nachweisgrenzen<br />
für sämtliche Benzodiazepine<br />
erreicht. Die Kalibriergeraden wiesen<br />
eine gute Linearität auf (R 2 ≥ 0,98); die<br />
Bestimmungsgrenze lag bei 0,5 ng/mL.<br />
Die Methode erwies sich als richtig und<br />
präzise. Die durchschnittliche Standardabweichung<br />
(RSD) für die analysierten<br />
Benzodiazipine lag bei 5,5 % (Bereich:<br />
1,01-26,4 %).<br />
Autoren<br />
Einfluss der Matrix auf die Ionisierung von Benzodiazepinen in hydrolysiertem Urin und Vollblut im<br />
Vergleich zu den Standard-Lösungen, angesetzt in reinem Wasser (100 %).<br />
Fredrick D. Foster, John R. Stuff, Edward<br />
A. Pfannkoch; <strong>GERSTEL</strong>, Inc., 701 Digital<br />
Dr. Suite J, Linthicum, MD 21090, USA.<br />
Sparkle T. Ellison, William E. Brewer,<br />
Stephen L. Morgan; Department of<br />
Chemistry and Biochemistry, University<br />
of South Carolina, 631 Sumter Street,<br />
<strong>Co</strong>lumbia, SC 29208, USA.<br />
Tom Gluodenis; Agilent Technologies,<br />
2850 Centerville Road, Wilmington, DE<br />
19808, USA.<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>Aktuell</strong> – März 2010 23
Aroma- und Duftsto fanalyse<br />
Überdimensional gut<br />
Forensische Toxikologie<br />
Tödlicher Ka feegenuß<br />
Auf Droge?<br />
Effiziente Matrixabtrennung<br />
für die LC-MS/MS-Analytik<br />
Metabolit-Profiling<br />
Spargelzeit<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>GmbH</strong> & <strong>Co</strong>. <strong>KG</strong> • Postfach 10 06 26 • 45406 Mülheim an der Ruhr<br />
Deutsche Post AG<br />
Entgelt bezahlt<br />
45473 Mülheim<br />
Das lesen Sie in unserer nächsten Ausgabe<br />
Im Internet<br />
Lebensmittelsicherheit: Besserer Nachweis<br />
von Pestiziden aus QuEChERS-Extrakten<br />
Pestizid-Rückstände in Agrarprodukten lassen sich mit<br />
der noch recht jungen QuEChERS-Methode schnell, kostengünstig<br />
und sicher analysieren. Applikationschemiker<br />
haben nun durch den Einsatz einer neuen, schnellen<br />
und effektiven Festphasenextraktionstechnik den GC/MS-<br />
Nachweis von Pestiziden aus QuEChERS-Extrakten optimiert.<br />
Umweltanalytik: Ultraspurennachweis von<br />
PCBs im ewigen Eis des Hochgebirges<br />
Ein Expertenteam, darunter Wissenschaftler des<br />
Helmholtz-Zentrums für Umweltforschung (UFZ) in<br />
Leipzig, hat im Schnee der Anden in 6200 Meter<br />
Höhe polychlorierte Biphenyle (PCBs) nachgewiesen.<br />
Dabei erwies sich der <strong>GERSTEL</strong>-Twister als<br />
ideales Extraktionsmedium, um auch mit geringen Probenvolumina<br />
die geforderte Nachweisgrenze zu erreichen.<br />
Bioanalytik: SPME-Headspace-Technik zur<br />
Untersuchung von Stoffwechselprozessen<br />
Längst haben die Gas- und Hochleistungs-Flüssigchromatographie<br />
ihren Platz in der Biotechnologie gefunden.<br />
Mithilfe von GC und HPLC lassen sich in Verbindung mit<br />
der SPME-Headspace-Technik enzymatische Reaktionen<br />
sowie Stoffwechselprozesse einfach überwachen und<br />
exakt nachvollziehen – und dies im Minimaßstab: in klassischen<br />
Headspace-Vials.<br />
<strong>GERSTEL</strong> online: Hinweise zu Produkten,<br />
Terminen, Veranstaltungen,<br />
Downloads sowie weitere Informationen<br />
über das Unternehmen und seine<br />
kundenorientierten Lösungen finden<br />
Sie im Internet unter www.gerstel.de<br />
Apropos: Sollten<br />
Sie Fragen<br />
zu einem der<br />
Beiträge in dieser<br />
<strong>42</strong>. Ausgabe<br />
der „<strong>GERSTEL</strong><br />
<strong>Aktuell</strong>“ haben<br />
oder Informationen<br />
wünschen,<br />
freuen<br />
wir uns auf Ihre E-Mail an<br />
aktuell@gerstel.de.<br />
Umfangreiches Material über die Produkte<br />
und Systemlösungen des Unternehmens<br />
finden Sie wie gewohnt im<br />
Internet unter www.gerstel.de<br />
www.gerstel.de<br />
Kundenzeitschrift der <strong>GERSTEL</strong> <strong>GmbH</strong> & <strong>Co</strong>. <strong>KG</strong> · Eberhard-<strong>Gerstel</strong>-Platz 1 · 45473 Mülheim an der Ruhr · Telefon + 49 2 08 - 7 65 03-0 · gerstel@gerstel.de<br />
<strong>Nr</strong>. <strong>42</strong> März 2010<br />
Trinkwasseranalytik<br />
Auf den<br />
Geruch<br />
gekommen<br />
ISSN 1618 - 5900<br />
G L O B A L A N A L Y T I C A L S O L U T I O N S<br />
<strong>GERSTEL</strong> <strong>GmbH</strong> & <strong>Co</strong>. <strong>KG</strong><br />
Eberhard-<strong>Gerstel</strong>-Platz 1<br />
45473 Mülheim an der Ruhr<br />
Deutschland<br />
+49 208 - 7 65 03-0<br />
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