DE 30 34 238 Al - Questel

® BUNDESREPUBLIK o Offenlegungsschrift ® Int. Cl. 3 :
DEUTSCHLAND
© DE 30 34 238 Al
A 61 K 39/17
DEUTSCHES
PATENTAMT
® Aktenzeichen:
• Anmeldetag:
• Offenlegungstag:
P 30 34 238.2-41
11. 9.80
7. 5.81
DE 30 34 238 A
Kyll
Unionspriorität:
@ Erfinder:
29.10.79 SU 2833299
Anmelder:
Kreimer, July Khaimoviä; Ageeva, Ljubov Sergeevna,
Moskva, SU
Vsesojuznyj gosudarstvennyj nauüno-kontrolnyj institut
veterinarnych preparatov, Moskva, SU
® Vertreter:
Eitle, W., Dipl.-Ing.; Hoffmann, K., Dipl.-Ing. Dr.rer.nat.;
Lehn, W., Dipl.-Ing.; Füchsle, K., Dipl.-Ing.; Hansen, B.,
Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 8000 München
Impfstoff zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit und Verfahren zur Herstellung derselben
DE 30 34 238 A 1
BUNDESDRUCKEREI BERLIN 03.81 130 019/652 15/80

IIOFFMANN • EITLE (1*:: FAirrig1;.fi.
PATE N 'FAN W Ä 17,T E 3034238
DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976)- DIPL-ING.W.EITLE • DR.RER.NAT.K.HOFFMANN • DIPL.-ING.W. LEHN
D1PL.-ING. K. FOCHSLE • DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABELLASTRASSE •I • D-8000 MÖNCHEN 81 • TELEFON (0 89) 91 10 87 • TELEX 05-29619 (PATH E)
33 950 u wa
VSESOJUZNY GOSUDARSTVENNY NAUCHNO-KONTROLNY INSTITUT
VETERINARNYKH PREPARATOV, MOSKAU / UdSSR
Impfstoff zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit und Verfahren
zur Herstellung desselben
PATENTANSPRÜCHE
1. Impfstoff zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit von
Geflügel, der eine virushaltige extraembryonale Flüssigkeit
des Virus der Newcastle-Krankheit enthält, dadurch
g e k e n n z e i c h n e t, dass er als virushaltige extraembryonale
Flüssigkeit des Virus der Newcastle-Krankheit die
virushaltige extraembryonale Flüssigkeit des Stammes P a r a-
m y x o v i r u s a-1 "Bor-74 WGNKI" aufweist, der im . Staatlichen
wissenschaftlichen Unionsinstitut für Kontrolle von
Veterinärpräparaten des Ministeriums für Landwirtschaft der
UdSSR deponiert ist, und eine biologische Aktivität von 10 8 ' ° -
109975 EID 5o mi hat .
2. Impfstoff nach Anspruch 1, da*durch g e k e n n-
zeichnet, dass er auch ein Schutzmedium, Magermilch
130019/0652

- 2 -
3034238
enthält, die im gleichen Verhältnis zur virushaltigen extraembryonalen
Flüssigkeit genommen wird.
3. Impfstoff nach Anspruch 1-2, dadurch g e-
k e n n z e i c h n e t, dass er Antibiotika in einer Menge
von 100-200 Einheiten je 1 ml Impfstoff enthält.
4. Impfstoff nach Anspruch 3, dadurch g e k e n n-
zeichnet, dass er als Antibiotika Penizillin und
Streptomyzin enthält.
5. Verfahren zur Herstellung von Impfstoff zur Bekämpfung
der Newcastle-Krankheit von Geflügel nach Anspruch 1,
das die Infizierung von Hühnerembryonen der Newcastle-Krankheit,
die Gewinnung der Matrixvermehrung des Virus mit Ausscheidung
der virushaltigen extraembryonalen Flüssigkeit und
Herstellung des Impfstoffes einschliesst, dadurch
gekennzeichnet, dass als Virus der Newcastle-
Krankheit der Stamm Paramyxovirus a-1 "Bor-74
WGNKI" verwendet wird und die Gewinnung der Matrixvermehrung
des Virus während 72-80 Stunden bei einer Temperatur von
37-37,5°C durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k e n n-
zeichnet, dass die Infizierung von Hühnerembryonen mit
dem Stamm Paramyxovirus a-1 "Bor-74 WGNKI" in
Dosis von lu4
-
• .0 -10 9 -•. 0 EI D 2;11) 50/0,1 ml
erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5-6, dadurch g e-
k e n n z e i c h n e t, dass die Herstellung des Trockenimpfstoffes
durch das Vermischen der ausgeschiedenen virushaltigen
extraembryonalen Flüssigkeit mit dem Schutzmedium
13.0019/0662

-3-
3034238
mit anschliessender Abpackung und Lyophilisierung erfolgt.
8. Verfahl'en nach Anspruch 7, dadurch g e-
kennzeichnet, dass als Schutzmedium Magermilch
verwendet wird, die im gleichen VerhRltnis zur virushaltigen
extraembryonalen Flüssigkeit genommen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 5-8, dadurch g e-
k e n n z e i c h n e t, dass man vor der Abpackung des
Impfstoffes Antibiotika in einer Menge von 100-200 Einheiten
je 1 ml der Vakzine derselben hinzufügt.
130019/0652

- 4 - 3034238
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet
des Veterinärwesens und insbesondere auf einen neuen Impfstoff
zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit sowie auf ein
Verfahren zur Herstellung desselben.
Die Newcastle-Krankheit /Pseudopest, atypische Pest,
asiatische Pest, Pneumoenzephalitis bei Geflügel/ stellt
eine akute ansteckende Viruskrankheit dar, die in Forin von
Epizootien verläuft und den Massentod empfindlicher Geflügelbestände
hervorruft. Die Newcastle-Krankheit ist eine der
verbreitetesten Infektionskrankheiten auf dem Erdball, sie
fügt einen grossen wirtschaftlichen Schaden der Volkswirtschaft
zu und gehört zu gefährlichen Infektionserkrankungen.
Die Bekämpfung der Newcastle-Krankheit ist ein aktueller und
wichtiger Bestandteil des Programms zur Bekämpfung von Infektionserkrankungen
von Nutztieren und Geflügel.
Zur Zeit werden die Infektionsherde der Newcastle--Krankheit
durch das Totalschlachten von erkrankten Beständen und
an Erkrankung verdächtigten Geflügel kupiert.
Bekannt sind verschiedene inaktivierte und Virus-Impfstoffe
für die spezifische Prophylaxe der Newcastle-Krankheit
von Geflügel. Die inaktivierten Impfstoffe werden durch
die Inaktivierung einer virushaltigen extraembryonalen
sigkeit mit Formalin beziehungsweise mit Betapropiolakt, ,on
hergestellt. Ihr Hauptnachteil besteht darin, dass sie eine
niedrige Immunogenität aufweisen und ausserdem kostspielig
sind und eine individuelle Bearbeitung von Geflügel durch
Impfung erfordern.
130019/0652
BAD ORIGINAL

-5--
3034238
Bekannt sind Virus-Impfstoffe, die zur spezifischen vorbeugenden
Bekämpfung der Newcastle-Krankheit zweier Gruppen
zum Einsatz kommen: lentogene avirulente /"BI-Stämme, "La-
Sota5- und "F"-Stämme/ und mesogene mit Restvirulenz /Roakin-
Komarow- und "H"-Stämme/. Trockene Virus-Impfstoffe bestehen
aus einer virushaltigen extraembryonalen Flüssigkeit und
einem Schutzmedium. Als Schutzmedium wird hauptsächlich Mager-
"milch verwendet. /"Teilgebiet des Veterinärwesens - Veterinärvirologie",
Moskau, "Kolos R -Verlag, Seite 233-240/.
Der Hauptnachteil des Virus-Impfstoffes mesongener Stammgruppe
ist das Vorhandensein der Restvirulenz, wodurch sie
eine begrenzte Verwendung findet. Die Virus-Impfstoffe der
"B"-und "F"-Stämme sind echwachimmunogen und die Impfstoffe
des "H"-Stammes verursacht eine Postvakzinationskrankheit
beim Geflügel.
Von den gegenwärtig bestehenden Virus-Impfstoffen weist
der Impfstoff des "La-Sote-Stammes eine besonders ausgeprägte
Immunogenität auf. Dieser Impfstoff setzt sich aus
50% virushaltiger extraembryonaler Flüssigkeit des "La-Sota"-
Stammes, 50% Schutzmedium und Antibiotika zusammen. Der Impfstoff
des "La-So -bau -Stammes ist unschädlich, bei seiner intranasalen
Einführung wird sie in einer Menge von 0,1 ml bei
einer Verdünnung von 1:25, bei peroraler Einführung mit
Trinkwasser während zwei Tage hintereinander in einer Menge
von 5-15 ml bei einer Verdünnung von 1:500 und bei Aerosolverfahren
der Einführung in einer Menge von 600-1200 EID 50
50-Embryonale Infizierende Dosis).
verwendet. (EID
Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes des "La-Sota"-
130019/0662

-6- 3034238
Stammes besteht in folgendem: Hühnerembryone werden mit
einem Virus in .einer Menge von 0,1 ml bei einer Verdihanung
von 10-3 infiziert, man erhält eine Matt vermehrung des Virus
mit einer Aktivität von mindestens 10 7 ' 5 EID 50
/ml während
96-120 Stunden vor, dann wird die ausgeschiedene virushaltige
extraembryonale Flüssigkeit mit dem Schutzmedium vermischt,
abgepackt, lyophilisiert und man führt die Kontrolle der
Fertigvakzine durch. Der genannte Impfstoff wird vorbeugend,
wie oben genannt, intranasal, aerosol und peroral mit Trinkwasser
verwendet. Die Einführung des genannten Impfstoffes
wird jedoch mehrmals vorgenommen. So wird beispielsweise Geflügel
im Alter bis 150 Tage mit diesem Virus-Impfstoff dreimal
und dann alle 6 Monate geimpft. Abgesehen von der mehrmaligen
Impfung mit diesem Impfstoff sind Immunitätdurchbruch und Tod
von Geflügelbeständen in Geflügelfarmen infolge der Newcastle-
Krankheit zu beobachten.
Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrunde gelegt, durch
die Verwendung eines neuen Stammes einen Impfstoff zur Bekämpfung
der Newcastle-Krankheit bei Geflügel herzustellen,
der unschädlich wäre und eine erhöhte Immunogenität aufwies,
sowie den technologischen Zyklus ihrer Herstellung zu reduzieren.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, da ss r7 er Impfstoff
Bekämpfung der Newcastle-Krankheit bei Geflügel, der eine
virushaltige extraembryonale Flüssigkeit des Virus der Newcastle-Krankheit
einschliesst, erfindungsgemäss als virushaltige
extraembryonale Flüssigkeit des Virus der Newcastle-
Krankheit.die virushaltige extraembryonale Flüssigkeit des
130019/0652
BAD ORIGINAL

- 7 -
3034238
Stammes P a r a m y x o v i r u s a-1 "Bor-74 WGNKI" enthält,
der im Staatlichen wissenschaftlichen Unionsinstitut
für Kontrolle von Veterinärpräparaten des Ministeriums für
Landwirtschaft der UdSSR deponiert ist und eine biologische
Aktivität von 10 8 ' 0-109 ' 75 EID 50
/m1 aufweist.
Der Impfstoff kann sowohl in flüssiger als auch in
trockener Form hergestellt werden. Zweckmässigerweise soll
bei der Herstellung des Trockenimpfstoffes als Schutzmedium
Mhgermilch im gleichen Verhältnis zur virushaltigen extraembryonalen
Flüssigkeit eingeführt werden. Der Empfstoff
kann Antibiotika in einer Menge von 100-200 Einheiten, bezogen
auf 1 ml Vakzine, enthalten. Als Antibiotika enthält
der Impfstoff vorzugsweise Penizillin und Streptomyzin. Zur
Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Herstellung des genannten
Impfstoffes.
Im Verfahren zur Herstellung des vorgeschlagenen Impfstoffes
zur Bekämpfung der Newcastle-Krankheit bei Geflügel,
das die Infizierung von Hühnerembryonen mit dem Virus der
Newcastle-Krankheit, die Gewinnung der Matrixvermehrung des
Virus mit Ausscheidung der virushaltigen extraembryonalen
Flüssigkeit und Herstellung des Impfstoffes einschliesst, erfindungsgemäss
wird als Virus der Newcastle-Krankheit der
Stamm Paramyxovirus a-1 "Bor-' 74 wrjuvrt ver_
wendet, und die Gewinnung der Matrixve/luehrung des Virus
wird während 72-80 Stunden bei einer Temperatur von 37,0 -
37,5°C durchgeführt. Zweckmässigerweise soll die Infizierung
von Hühnerembryonen mit dem Stamm P a r a m y x o v i r u s
a--]."Bor-74 WGNKI t' in einer Dosis von 10 49° -10 59°EID 50
/0,1 ml
130019/0652
BAD ORIGINAL

erfolgen.
8 - 3034238
Die Herstellung von Trockenimpfstoff erfolgt durch
-ermischen der ausgeschiedenen virushaltigen extraembryonalen
Flüssigkeit mit dem Schutzmedium mit anschliessender Abpackung
und Lyophilisierung. Als Schutzmedium wird Magermilch
verwendet, die im gleichen Verhältnis zur virushaltigen
extraembryonalen Flüssigkeit genommen wird. Vor der Ab-
packung des Impfstoffes zur Vermeidung der möglichen Ein-
.
schleppung der fremden Mikroflora können Antibiotika in
einer Menge von 100-200 Einheiten, bezogen auf 1 ml Impfstoff,
derselben hinzugefügt werden. Man erhält einen unschädliche
Impfstoff, der eine hohe Immunogenität aufweist.
Der vorgeschlagene Impfstoff wird prophylaktisch für empfindliches
Geflügel aller Altersgruppen verwendet.
Erfindungsgemäss, besteht das Verfahren zur Vorbeugung
der Newcastle-Krankheit an Geflügel darin, dass
der er-
findungsgemässe Impfstoff auf die Nasenschleimhaut von Geflügel
in einer Dosis von 0,05-0,1 ml mit einer Verdünnung
von 1:100 einmal oder zweimal eingeführt wird. Der Impfstoff
kann man parenteral (peroral mit Trinkwasser) Kücken im
Alter von 25 Tagen in einem Volumen von 7,5-10 ml bei einer
Verdünnung von 1:1000 einmalig mit anschliessender Revaktinierung
von Geflügel in höherem Alter in einem Volumen von
10-15 ml mit einer Verdünnung von 1:1000 einmalig einführen.
Der Impfstoff kann man auch aerosol dem Geflügel im Alter
bis 25 Tagen in einer Dosis von 300-400 EID 50 mit anschliessen•
der Revaktinierung von Geflügel im höheren Alter in einer Dosis
von 800-1000 EID 50 einführen.
130019/0652
BAD ORIGINAL

- 9 - 3034238
Zur Herstellung des erfindungsgemässen Impfstoffas wird
der Stamm Paramyxovirus a-1 "Bor-74 WGNKI"
verwendet, der von Kücken unter natürlichen Bedingungen ausgeschieden
worden ist, der folgende Eigenschaften aufweist:
MORPHOLOGISCHE MERKMALE. Bei der Besichtigung im Elektronenmikroskop
werden Anhäufungen und einzelne Teilchen, der
Virionen, in der Hauptsache faser- und schlägerartige Formen
von Virionen, sowie sphärische und polymorphe Teilchen dieses
Virus festgestellt.
Die Virionhülle ist mit einer grossen Anzahl von kleinen
faserförmigen Ausragungen mit einer Länge von 80-100 A° und
einem Durchmesser von etwa 30 A° bedeckt. Sie ragen über die
Oberfläche der Hülle heraus und sind voneinander in 70-80 A°
entfernt. Bei faserartiger Form der Virionen verteilen sich
die stachelartige Ausragungen gleich mässig an der Hülle beziehungsweise
in. richtigen Reihen.
In den zu untersuchenden Präparaten aus dem Stamm
Paramyxovirus a-1 "Bor-74 WGNKI" sind hauptsächlich
intakte Formen von Virionen zu verzeichnen. Dieser
Stamm zeichnet sich durch diese Eigenschaft von den anderen
Impfstoffstämmen ("21, "La-Sota" und "F") des Virus der Newcastle-Krankheit
aus, in denen es auch halbzerstörte und
zerstörte Virionen ggh‘
In einzelnen Präparaten des Stammes P a r a m y x 0-
virus a-1 "Bor WGNKI" wurde eine feine filamentose spiralförmige
Struktur mit regelmässiger Periodizität von 50 A° längs
ihrer Achse festgestellt. Ihr Durchmesser beträgt etwa 170 A°,
der Durchmesser des mittleren Kanals beträgt 40-50 A°. Diese
130019/0652

- 10 -
303!:238
Struktur stellt Ribonukleoprotein des Virus dar. Sie ähnelt
ihrem Aufbau nach den anderen Stämmen des Virus der Newcastle-Krankheit.
Für den Stamm "Bor-74 WGNKI" ist charakteristisch eine
geringere Anzahl von sphärischen Formen der Virionen (mit
einer Grösse von 90-150 nm) gegenüber den Stämmen "La-Sota",
n B 1
n und "F" sowie eine relativ grössere Anzahl von faserförmigen
Virionen mit einem Durchmesser von 100-150 nm und
einer Länge von 1 2 5 nm. Seltener waren schlägerartige Formen
der Virionen sichtbar.
KULTURALE EIGENSCHAFTEN. Virus wird in 9-10 Tage alten
Hühnerembryonen kultiviert, ohne dass ihr Tod während 96-
stündiger Bebrütung bei einer Temperatur von 37°C hervorgerufen
wird. Es ist thermostabil.
EMPFINDLICHKEIT. Gegenüber dem Stamm P a r a m y x 0-
virus a-1 "Bor-74 WGNKI" sind Hühnerembryonen und alle
Altersgruppen von Geflügel anfällig.
VIRULENT- UND ANTIGEN-EIGENSCHAFTEN. Der Stamm P a-
r a m y x o v 1 r u s a-1 "Bor-74 WGNKI" ist avirulent für
Geflügel sämtlicher Altersgruppen. Es zählt zur Gruppe der
lentogenen Stämme.
Er besitzt eine ausgeprägte Eigenschaft zur Aufrechterhaltung
in der Natur und wird auf natürlichem Wege übertragen.
Er ruft bei anfälligem Geflügel die Bildung von
spezifischen Antikörpern hervor, die die Hämagglutination
inhibieren und Virus der Etalonstämme der Newcastle-Krankheitneutralisieren.
130019/0652

3034238
Der Virus reagiert mit Antikörpern, die zu homologi-
sehen und zu den anderen Stämmen des Virus der Newcastle-
.
Krankheit erzeugt wurden.
Bei Einführung dem anfälligen Geflügel ruft er die
Entstehung einer intensiven Immunität gegenüber dem epizootischen
Virus der Newcastle-Krankheit hervor.
Biologische Aktivität des Virus beträgt 108 ' 5-109 ' 75
50 c
Immunogene Aktivität /50%ige/:
EID /m1
- bei Einführung auf Nasenschleimhaut von Geflügel beträgt
2,93 lg EID 50/0,1 ml;
- bei parenteraler Einführung mit Trinkwasser - 4,97 lg
EID 50/10 ml;
--bei Aerosolverfahren der Einführung für Kücken bis
25-tägigem Alter 300-400 EID 50 und für das erwachsene Geflügel
- 800-1000 EID 50 .
Empfindliche Kücken, die einmal mit dem Impfstoff des
Stammes Paramyxovirus a-1 n Bor-74-WGNKIn auf
Nasenschleimhaut und parenteral geimpft wurden, waren
7 Tagen nach Vaktinierung und innerhalb von 438 Tagen 100%
immun (Dauer der Kontrolle).
SEROLOGISCHE EIGENSCHAFTEN. Virus des Stammes P a r a-
m y x o v i r u s 1-a "Bor-74 WGNKI" besitzt eine Fähigkeit,
Erythrozyte von Geflügel und Tieren zu agglutinieren.
Es bewirkt eine ausgeprägte spontane Agglutination mit den
Erythrozyten von Hühnerembryonen. Hämagglutinierender Titer
ist 1:512. Die Reaktion der Hämagglutination ist feinkörnig
und entwickelt sich langsam.
130019/0652
BAD ORIGINAL

folgendem.
- 12 -
3 0 3 !: 2 3 8
Verfahren zur Herstellung von Impfstoff besteht in
Man führt die Infizierung von Hühnerembryonen, die frei
von Antikörpern gegenüber dem Virus der Newcastle-Krankheit
und anderen Geflügelerkrankungen sind, mit dem Stamm P a-
r a m y x o v i r u s a-1 "Bor-74 WGNKI" durch. Die Produktionschargen
werden aus der Matrixvermehrung des Virus zu-
bereitet. Mit der Suspension des Virus des Stammes P a r a-
1
m'yxovirus 1-a "Bor-74 WGNKI" in einer Dosis von
10 40-10 5 ' 0 EID50 / 0,1 ml werden Hühnerembryonen in Allan-
toishöhle infiziert. Die infizierten Embryonen werden bei
einer Temperatur von 37 -37,5°C während 72-80 Stunden inkubiert.
Dann wird die ausgeschiedene virushaltige extraembryonale
Flüssigkeit unter sterilen Bedingungen gesammelt.
Bei der Herstellung eines flüssigen Impfstoffes wird die gewonnene
Flüssigkeit abgefüllt und auf Sterilität, biologische
Aktivität, Unschädlichkeit und Immunogenität geprüft.
Bei der Herstellung von Trockenimpfstoff wird die gewonnene
Flüssigkeit mit Schutzmedium in gleichen Mengen, beispielsweise
mit steriler Magermilch vermischt und in Ampullen
(kleine Flaschen) abgefüllt, dann lyophilisiert, jede Charge
wird auf Restfeuchtigkeit, Sterilität, biologische Aktivität,
Unsr.hädlicht und Immunogen 4 tgt geprnft. Ti er herge s t e llte
Impfstoff ist für sämtliche Altersgruppen von Geflügel unschädlich,
weist eine hohe Immunogenität auf und ermöglicht,
die Anzahl der Vaktionationen zu verringern.
Verfahren zur Herstellung desselben unterscheidet sich
von der Herstellung bekannter Impfstoffe durch den reduzier-
130019/0652
BAD ORIGINAL

- 13 -
3034238
ten technologischen Zyklus (Dauer beträgt 72-80 Stunden anstelle
von 96-120 Stunden gemäss dem bekannten Verfahren).
Gegenwärtig wurde der erfindungsgemässe Impfstoff mit
positiven Ergebnissen in Geflügelfarmen bei einem Geflügelbestand
von 7 Millionen erprobt.
Zur besseren Erläuterung der vorliegenden Erfindung
werden nachstehende Beispiele der.Herstellung des Impfstoffes
z4r Bekämpfung der Newcastle-Krankheit bei Geflügel und ihrer
Anwendung zur Vorbeugung dieser Krankheit angeführt.
Beispiel 1
Zur Herstellung von drei Versuchschargen der trockenen
Virus-Impfstoffe aus dem Stamm P a r a m y x o v i r u s
a-1 "Bor-74 WGNKI" werden 10-tägige Hühnerembryonen genutzt,
die frei von den Antikörpern gegenüber dem Virus der Newcastle-
Krankheit und anderen Geflügelerkrankungen sind. Für jede
Charge des Impfstoffes werden je 300 Embryonen verwendet.
Die Charge Nr. 1 hat biologische Ausgangsaktivität von
108950 EID 50/ml, die Charge Nr. 2 mit biologischer Ausgangsaktivität
von 108975 EID50 /m1 und die Charge Nr. 3 hat biologische
Ausgangsaktivität von 10 9150 EID /ml. 50
Die Produktionscharge des Virus aus dem Stamm P a r a-
m y x o v i r u s a-1 "Bor-74WGNKIn wird aus lyophilisierter
Matrixvermehrung der 10. Passage zubereitet. Mit der
Virussuspension bei einer Verdünnung von 10 -4 werden Embryonen
in Allantoishöhle in einer Menge von 0,1 ml infiziert.
Die infizierten und Kontrollembryonen werden bei einer Temperatur
von 37°C während 72 Stunden inkubiert. Zur Herstel-
130019/0652

- 14 - 3034238
lung des Impfstoffes werden nur lebende Embryonen aus der
72-ständigen Inkubation verwendet, die vorher mindestens
8 Stunden bei +4°C gekühlt werden.
Der Abfall infizierter und Kontrollembryonen von
Hühnern während 72-ständiger Inkubation ist in Tabelle 1
angeführt.
Tabelle 1
Abfall infizierter Hühnerembryonen während
72 Stunden laut Ergebnissen aus drei Versuchen
lfd. Anzahl von gestorben
Insgesamt
Nr. Embryonen
gestorben
in in in
-24 h 48 h 72 h Anzahl
1. 900 (Versuchsembryonen)
48 9 3 60 6,7
2. 36 (Kontrollembryonen)
Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, dass der Abfall infizierter
HiLrembryonen whhrend der 72-ständigen Inkubation im
Bereich von 6,7% war. Der Tod der Embryonen.war hauptsächlich
in den ersten 24 Stunden nach der Infizierung zu beobachten
(das heisst nicht spezifisch).
Zur Herstellung des Impfstoffes wird eine bakterien--
und pilzfreie Allantois- und Amnionflüssigkeit verwendet,
die unter sterilen Bedingungen in ein Gefäss abgegossen, in
gleichem volumenmässigem Verhältnis mit steriler Magermilch
vermischt und in Ampullen zu je 4 ml abgefüllt wird. Dann
130019/0652

- 15 -
3034238
wird der Impfstoff lyophilisiert. Das Zulöten des Impfstoffes
erfolgt in Vakuumkollektoren. Die Ampullen mit Impfstoffe
ohne Vakuum werden aussortiert. Als Herstellungsdatum des
Impfstoffes gilt der Tag der Beendigung der Trocknung.
Sämtliche Ampullen werden mit Angabe der Bezeichnung des
jeweiligen Biopräparates, der Chargenummer und des Herstellungsdatums
etikettiert.
Jede Versuchscharge des Impfstoffes wird auf Restfeuchtigkeit,
Sterilität, Unschädlichkeit und Immunogenität
geprüft.
Die Kontrolle des nativen und trockenen Impfstoffes
auf Sterilität in bezug auf Bakterien- und Pilzflora wird
mittels Aussaat in einem Nährboden vom Typ MPA 9 MPB, MPPB
und im Saburo-Medium durchgeführt. Die Erfassung der Aussaatergebnisse
wird während 10 Tage kontrolliert.
Die Unschädlichkeit wird an 17-20-tägigen anfälligen
Kücken mittels intramuskulärer Einführung des Impfstoffes
in einer Menge von 0,2 ml bei einer Verdünnung von 1:10 geprüft.
Die Kücken werden innerhalb von 14 Tagen beobachtet.
Der hergestellte Impfstoff ist unschädlich.
Die Immunogenität des Impfstoffes wird an 17-20-tägigen
Kücken mittels Einführung derselben auf die Nasenbeziehungsweise
Augenschleimhaut von Geflügel (je 0,1 ml bei
einer Verdünnung von 1:100 und 1:1000)und peroral mit Trinkwasser
(je 10 ml bei einer Verdünnung von 1:1000 und
1:5000) ermittelt.
Das Vorhandensein und die Dauer der Immunität bei
130019/0652

- 16 -
3034238
allen Kücken der Versuchs- und Kontrollgruppen wird in 14
Tagen nach der•Vakzination mittels Infizierung mit dem
virulenten Stamm u T" des Virus der Newcastle-Krankheit in
einer Dosis von 1000 LD 50/0,2 ml geprüft. Die Kontrolle
der infizierten Geflügelbestände wird innerhalb von 10 Tagen
geführt.
Sämtliche mit obengenannten Methoden vakzinierte
Kieken waren nach der Kontrollinfizierung mit dem virulenten
Stamm ne des Virus der Newcastle-Krankheit immun, beiden
Kontrollkücken 100%iger Tod zu verzeichnen war. Die Ergebnisse
der Prüfung der Immunogenität sind in Tabelle 2 angeführt.
Eine 50%ige immunisierende Aktivität des trockenen Virus-
Impfstoffes aus dem Stamm Paramyxovirus a-1
-n Bor-74WGNKI ll ermittelte man in sechs Versuchen an 17-20-
tägigen Kücken durch Einführung auf Nasenschleimhaut von
Geflügel und parenteral mit Wasser bei einer Verdünnung des
Virus von 10 -4 bis 10 -8 .
Unter Anwendung statistischer Methoden der Bearbeitung
wird die immunisierende Aktivität /IMD 50
/jeder Charge des
Impfstoffes bei Einführung auf die Nasenschleimhaut von Geflügel
und bei enteraler Methode der Immunisierung ermittelt.
Immunisierende Aktivität:
- Charge Nr. 1 mit biologischer Ausgangsaktivität von
108'5 EID 50
/m3 "
bei Vaktination durch die Einführung auf die
Nasenschleimhaut von Geflügel betrug 3,6 lg EID 50/0.1 ml;
bei parenteraler Vaktination - 5,2 lg EID 50/ 10,0 ml;
130019/0662

- 17 -
3034238
- Serie Nr. 2 mit biologischer Ausgangsaktivität von
8,75 10 EID 50/mi betrug 2,3 lg EID50/0, 1
ml und 5,0 1g2
EID 50/10,0 ml;
- Serie Nr. 3 mit biologischer Ausgangsaktivität von
109 ' 5 EID 50/mi bei Einführung auf die Nasenschleimhaut von
Geflügel betrug 2,8 lg EID5u/u -/-91
ml,
und bei parenteraler
E inführung - 4,7 lg EID 50/10,0 ml
Gemäss Ergebnissen der sechs Versuche lag die 50%ige
immunisierende Aktivität (IMD 50 ) bei der Einführung auf
die Nasenschleimhaut von Geflügel im Bereich von 2,93 lg
u
u1 ml und bei parenteraler Einführung - 4,97 lg
EID 50/10,0 ml'
Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 3
angeführt.
130019/0652

- 1 8 -
3034238
Tabelle 2
Ergebnisse der Prüfung der Immunogenität der Versuchschargen
des Trockenimpfstammes aus dem Stamm Paramyxovirus
a-1 "Bor-74 WGNKI"
Verdünnung Methode der
des Impfbtammes
Einführung
Volumen
ml
Anzahl der
vakzinierten
Kücken
1:10
1:100
1:1000
1:1000
1:5000
intramuskulär
Einführung auf
die Nasenschleimhaut
von Geflügel
peroral mit
Trinkwasser
tt
0,2 15
0,1 30
0,1 30
10,0 30
10,0 30
Kontrollkücken
/nicht vakziniert/
130019/0652

- 9 -
3034238
Ergebnisse der Kontrollinfizierung
Anzahl
estorben
15 0 15
30 0 30
30 0 30
30 0 30
30 0 30
30 30 0
130019/0652

-20-
3034238
Tabelle 3
Ergebnisse der Ermittlung der 50%iger immunisierenden
Dosis bei drei Chargen des Impfstoffes des Stammes
Paramyxovirus a-1 u Bor-74 WGNKIu
Verdünnung Einführungs- Volumen Anzahl v.
methode (ml) Kücken
10-4
Einführung auf
0,1
15
10-5
-6
10
die Nasenschleimhaut
von Geflügel
11
_11._
15
15
10-7
-8
10
10-4
parenterale
l t
11
10,0
15
15
15
10-5
-6
10
Methode der
Einführung
11
am.
lt
MN>
15
15
10-7
-8
10
tt
tt
$1
lt
15
15
Kontrollgruppe
(nicht vakzinierte)
IM»
30
130019/0652

-21 -
3034238
•■••■■•■*.
Anzahl v.
Kücken
Ergebnisse der Kontrollinfizierung
d a v o n
gestorben
überlebt
15 0 15
15 3 12
15 8 7
15 15 0
15 15 0
15 0 15
15 3 12
15 9 6
15 12 3
15 15 0
30 30 0
130019/0662

-22 -
3034238
Beispiel 2
Die Prüfung des erfindungsgemässen Impfstoffes aus dem
Stamm Paramyxovirus a-1 "Bor-74 WGNKI" in der
Geflügelwirtschaft wurde wie folgt durchgeführt.
Bei der Prüfung verwendete man:
- trockenen Viruel.-Impfstoff gegen die Newcastle-Krankheit
aus dem Stamm Paramyxovirus a-1 "Bor-74
1WGNKI" der Chargen 1, 2 und 3, die gemäss Beispiel 1 hergestellt
wurden;
- trockenen Virus-Impfstoff gegen die Newcastle-Krankheit
aus dem Stamm "La Sota",
- den virulenten Kontrollstamm n T" des Virus der Newcastle-
Krankheit. Trfektionsaktivitat betrug 10 7 t 5LD 50/0,2 ml'
Bei der Immunisierung mittels Einführung auf die Nasenbeziehungsweise
Augenschleimhaut von Geflügel wurde der Impfstoff
aus dem Stamm Paramyxovirus a-1 "Bor-74
WGNKI" in einem Verhältnis von 1:100 und der Impfstoff aus
dem Stamm "La-Sota" 1:25 verdünnt. Der verdünnte Impfstoff
wurde in einer Menge von je 2 -Tropfen in die Nase eingetropft.
Vor der Vakzination wurde dem Geflügel Wasser weggenommen
und das Tränken wurde in 1,5 Stunden nach der Immunisierung
durchgeführt. Bei der peroraler Immunisierung von
Geflügel mit Trinkwasser (parenterale Methode der Vakzination)
verdünnte man den Impfstoff aus dem Stamm P a r a m y x 0-
virus a-1 "Bor-74 WGNKI" in einem Verhältnis 1:1000
und aus dem Stamm "La Sota" - 1:500. Der verdünnte Impfstoff
wurde dem Geflügel bei einem Tränkegang in einer Menge von
130019/0662

3034238
10 ml für jedes Kücken bis 25-tägigem Alter verabreicht.
Das Tränken erfolgte einmal am frühen Morgen vor der Fütterung,
wobei das Geflügel vorher während 8 Stunden ohne
Trinken gehalten wurde. Die Verabreichung von Wasser und
Futter wurde dem Geflügel nach dem Austrinken des Impfstoffes
in 1,5 Stunden vorgenommen. Vor der Durchführung der
Versuche bei Kücken sämtlicher Versuchreihen (je 25 Proben
14i jeder Reihe) wurde der Stand der passiven Immunität
bestimmt. Das Vorhandensein von Antihämagglutininen im
Blutserum von Geflügel wurde in der'Reaktion der Verzögerung
der Hämagglutination mit 4-maliger Dosis eines Antigens
nachgewiesen. Die Versuchsgruppen von Kücken wurden wie
folgt vakziniert: das erste Mal in 12-15-tägigem Alter; das
zweite Mal wurden die konkreten Termine für die Revakzination
von Geflügel nach dem Stand der Intensität der aktiven
Immunität 14 Tage nach der ersten Immunisierung festgelegt.
Das Vorhandensein und das Niveau der aktiven Immunität bei
Geflügel, das mit dem Impfstoff aus dem Stamm P a r a
m y x o v i r u s a-1 "Bor-74-WGNKI u vakziniert wurde, ermittelte
man in 7,10,14, 21 und 42 Tagen nach der ersten
und in 14 Tagen nach der zweiten Vakzination und bei Geflügel,
das mit dem Impfstoff aus dem Stamm u La Sotau vakziniert
wurde, in 14 Tagen nach der ersten und der zweiten
Vakzination (je 25 Proben). Die Kontrollinfizierung von Versuche-
und Kontrollgruppen von Geflügel wurde mittels intramuskulärer
Einführung des virulenten Stammes u Tu des Virus
der Newcastle-Krankheit in einer Dosis von 1000 1D 50/0,2 ml
130019/0652

- 24 -
3034238
durchgeführt. Das infizierte Geflügel wurde während 10 Tage
einer Beobachtung unterworfen. Die Kücken aus den Versuchsreihen
wurden alle in 60-tägigem Alter gewogen und man ermittelte
ihr Durchschnittsgewicht.
*In einer Wirtschaft wurden erprobt:
eine Vakzinationsmethode mittels Einführung des Impfstoffes
auf die Nasenschleimhaut von Geflügel (13 Produktionsgruppen -
188300 Geflügel);
parenterale Methode der Vakzination (3 Produktionsgruppen
Tausend Geflügel);
-40,4
aerosole Methode der Vakzination (27 Produktionsgruppen-über
600 Tausend Geflügel).
Alle Versuchsgruppen von Geflügel wurden ständig kontrolliert
und man nahm täglich eine pathalogisch-anatomische
Obduktion von gestorbenem Geflügel vor. In keiner einzigen
Versuchsgruppe von Kücken, die in den obengenannten
Methoden der Einführung des Impfstoffes aus dem Stamm P a-
r a m y x o v i r u s a-1 "Bor-74 WGNKI" vakziniert wurden,
wurde keine sichtbare äussere Reaktion auf das eingeführte
Antigen festgestellt. Die Kücken waren beweglich, haben
gern Futter verzehrt und sich normal entwickelt. Die postvaktionale
Reaktion (Depression, Atembeschweren, Röcheln)
war bei Kücken am 4. bis 6. Tag zu beobachten, die primär
im Aerosolverfahren mit dem Impfstoff aus dem Stamm P a-
ramyxovirus a-1 "Bor-74 WGNKI" und am 6. bis 8.
Tag mit dem Impfstoff aus dem Stamm "La Sota" vakziniert
wurden. Dabei war die Reaktion auf die Einführung des Impfstoffes
aus dem Stamm "La Sota" klinisch etwas mehr als auf
130019/0652

-25-
3034238
den Impfstoff aus dem Stamm a-1 "Bor-74 WGNKI" ausgedrückt.
Der Antikörperfiter bei Kücken, die in den obengenannten
Methoden der Einführung des Impfstoffes aus dem Stamm P a-
r a m y x o v i r u s a-1 "Bor-74 WGNKI" immunisiert wurden,
erhöhte sich in 7, 10 und 14 Tagen nach der Vakzination
merklich und am 21. Tag befand er sich im Bereich von
6,1-7,4 log2 . Dabei war der Antikörpertiter mehr bei den
Küpken ausgeprägt, die im Aerosol- und Parenteralverfahren
der Einführung des Impfstoffesgeimpft wurden.
Der Kontrollinfizierung wurden 17 Versuchsgruppen von
Geflügel ausgesetzt, darunter:
1 Gruppe (10 Stück) aus nicht vakziniertem Geflügel wurde
der Kontaktvakzination unterworfen und überlebte 100%;
3 Gruppen (100 Stück) aus im parenteralen Verfahren vakziniertem
Geflügel überlebten 100%;
4 Gruppen (80 Stück), die mittels Einführung des Impfstoffes
auf die Nasenschleimhaut von Geflügel vakziniert wurden,
überlebten 100%;
9 Gruppen (135 Stück), die im Aerosolverfahren vakziniert
wurden, überlebten zu 97,8%.
Sämtliche Kontrollgruppen (50 Stück) der nichtvakzinierten
Kücken starben von der Newcastle-Krankheit.
Die Aufrechterhaltung der Kücken in einer Hühnerfarm
im 1- bis 60-tägigen Alter lag im Bereich von 96,9-98,3%,
die durchschnittliche Gewichtszunahme pro Tag bei Kücken im
1- bis .60-tägigen Alter lag im Bereich von 10,0-10,4 g. Die
während der 6 Monate durchgeführten Beobachtungen der Kücken,
die mit dem trockenen Virus-Impfstoff aus dem Stamm P a r a-
130019/0652

- 26 -
3034238
myxovirus a-1 "Bor-74 WGNKI fi geimpft wurden, haben
•
seine Unschädlichkeit und eine hohe Immunogenität nachge-
wiesen.
Es wurde die Ermittlung der Termine des Eintretens
und der Dauer der Immunität bei Geflügel durchgeführt, das
mit dem trockenen Virus-Impfstoff aus dem Stamm P a r a-
myxovirus a-1 "Bor-74 VIGNKI" vakziniert wurde. Man
ellimittelte den Termin des Eintretens und die Dauer der Immunität
bei Kücken, die einmal durch die Einführung des Impfstoffes
auf die Nasenschleimhaut und im parenteralen Verfahren
der Einführung des erfindungsgemässen Impfstoffes
geimpft wurden. In dem Versuch wurden 300 anfälliger Kücken
im 35-tägigen Alter genutzt. Davon wurden 150 Kücken durch
die Einführung des Impfstoffes auf die Nasenschleimhaut von
Geflügel in einer Menge von 0,1 ml bei einer Verdünnung von
1:100 und 150 Kücken im enteralen Verfahren einmal in einer
Menge von 7,5 ml pro Stück und einer Verdünnung von 1:1000
geimpft. Als Kontrollmuster dienten 65 nichtvakzinierten
Kücken. Das Vorhandensein der Immunität wurde. in 7,10,14,
31,84,112,148,178,204,235,287,350 und 438 Tagen (Zeitraum
der Beobachtung) nach der einmaligen Vakzination mittels Bestimmung
des Niveaus spezifischer Antihämagglutinine im
Blutserum und mittels Kontrollinfizierung mit dem virulenten
Stamm "T" des Virus der Newcastle-Krankheit in einer Dosis
von 1000 LD 50/0,2 ml
geprüft. Das infizierte Geflügel wurde
während 10 Tage beobachtet. Sämtliches gestorbenes Geflügel
wurde der pathologisch-anatomischen Obduktion ausgeE•-tzt.
130019/0652

- 27-
3034238
Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen sind in
Tabelle 4 angefinirt. Aus den Werten der Tabelle 4 ist zu
ersehen, dass die Kücken, die einmal mit dem trockenen Virus-
Impfstoff aus dem StammPa .ramyxovirus a-1 "Bor-
74 WGNKIu in den genannten. Methoden der Einführung geimpft
wurden, in 7 Tagen nach der Vakzination und während weiterer
438 Tage 100% immun waren, während alle Kontrollkücken geti
storben sind.
Es ist hervorzuheben, dass der erfindungsgemässe Impfstoff
ausser der humoralen Immunität eine ziemlich ausgeprägte
Zellenimmunität bildet. Davon zeugt die Tatsache, dass
Geflügel über das 204-tägige Alter hinaus, abgesehen vom
niedrigen Niveau spezifischer AntiIbrper (1:4), zur Kontrollinfizierung
mit dem virulenten Stamm u Tu des Virus der Newcastle-Krankheit
immun blieb.
130019/0652

-28-
3031E238
Tabelle 4
ImmunitLlt nach der einmaligen Vakzination der 35-tägigen
Kücken mit dem Impfstoff aus dem Stamm "Bor-74 WGNKI"
Nach der
Vakzination
(in
Tagen)
Intranasale Methode der Vakzination
Antikörpertiter
(1°g2 )
Anzahl
d.Kücken
Bioprobe
davon
gestorben überlebt
7 1:16-1:64 10 0 10
(5,0)
10 1:64-1:256 10 0 10
(7,0)
14 1:128-1,512 10 0 10
(7,9)
31 1:128-1:512 10 0 10
(7,8)
84 1:64-1:128 10 0 10
(6,4)
112 1:16-1:64 10 0 10
(5,2)
148 1:8-1:64 10 0 10
(4,9)
178 1:8-1:32 10 0 10
(4,0)
204 1:4-1:16 10 0 10
(3,8)
235 1:4-1:16 10 0 10
287
(3,7)
1:4-1:16 10 0 10
(3,6)
350 1:4-1:16 10 0 10
(3,5)
438 1:2-1:8 10 0 10
(2,8)
Nichtvakzinierte Kontrollgruppe
130019/0652

- 29
-
3034238
Parenterale Methode der Vakzination
Antikör ertiter -
Biorobe
(log2 )
Anzahl
dav on
d.Kücken
gestorben überlebt
1:16-1:64 10 0 10
( 5,2)
1 : 128-1 :256 10 0 10
(7,6)
1:128-1:512 10 0 10
( 8 ,3)
1:128-1:512 10 0 10
(8,1)
1:64-1:256 10 0 10
(6,6)
1:32-1:128 10 • 0 10
(5,5)
1:16-1:64 10 0 10
(5,1)
1:8-1:64 10 0 10
(4,3)
1:8-1:32 10 0 10
(4,0)
1:4-1:32 10 0 10
(3,8)
1:4-1:16 10 0 10
(3,7)
1:4-1:16 10 0 10
(3,6)
1:2-1:16 10 0 10
(2,9)
65 65
130019/0652