Diss_Meir_Michael.pdf (2304 KB) - OPUS Würzburg - Universität ...

2.3.2. Sekundärantikörper
Tabelle 3 beschreibt die verwendeten Sekundärantikörper, die Hersteller und
die Konzentrationen, in denen sie für Immunfluoreszenzen und Western Blots
verwendet wurden
Tabelle 3: Verwendete Sekundärantikörper
Antikörper Konzentration Hersteller
IF
WB
Ziege gegen Maus
(gam)
Ziege gegen Ratte
(gart)
Ziege gegen Kaninchen
(garb)
1 : 600 1 : 3000 Dianova, Hamburg, D
1 : 600 1 : 3000 Dianova, Hamburg, D
1 : 600 1 : 3000 Dianova, Hamburg, D
2.4. Indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie
Durch die indirekte Immunfluoreszenz-Mikroskopie können spezifisch markierte
Proteine in den Zellen beurteilt werden und damit Veränderungen der
Lokalisation und Konzentration von Proteinen erkennen. Dies gelingt durch eine
spezifische Bindung eines Primärantikörpers an Epitope der Zielproteine. Der
Fc-Teil dieser gebundenen Primärantikörper wird wiederum von einem
zugegebenem Sekundärantikörper erkannt, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff
gekoppelt ist. Dieser Fluoreszenzfarbstoff kann durch Lichtstrahlen bestimmter
Wellenlänge dazu angeregt werden, selbst Licht sichtbarer Wellenlänge zu
emittieren. So leuchtet der Cyaninfarbstoffe Cy3 rot, Cy2 grün, Alexa Phalloidin
488 grün und DAPI blau.
Für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie wurden Zellen auf ∅ 12 mm große,
gelatinierte Deckgläschen im Verhältnis 1:6 ausgesät, und diese in einer
Petrischale mit DMEM kultiviert. Nach Inkubation mit einem Testreagenz oder
mit einem Toxin wurden die Zellen mit 2% Formalin über 10 min bei
Raumtemperatur fixiert und anschließend für 15 min mit 0,1% (w/v) Triton X-
100 in PBS permeabilisiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die
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