Diss_Meir_Michael.pdf (2304 KB) - OPUS Würzburg - Universität ...

unterstützt. Somit wird eine Beeinflussung des Ergebnisses durch die räumliche
Struktur und der Ladung der einzelnen Proteine vermieden, und die Proteine
wandern allein aufgrund ihrer Masse unterschiedlich schnell zur Anode.
Für die Auftrennung wurden vertikale Gelelektropheresesysteme (Biorad,
München) verwendet. Die Flachbettgele wurden zwischen zwei Glasplatten, die
durch ca. 1 mm dicke Abstandshalter voneinander getrennt und in einer
Halterung eingespannt waren, gegossen. Die Polymerisierung der Gele wurde
durch Ammoniumpersulfat (APS) initiiert und Tetramethylethylendiamin
(TEMED) diente als Katalysator. Zunächst wurde die 7,5 %, 10 % und 15 %
Trenngellösung zwischen die Platten gefüllt und mit Wasser überschichtet, um
Sauerstoff fernzuhalten und für eine gerade Oberfläche zu sorgen. Nach
dessen Polymerisation wurde das Wasser wieder entfernt, das Sammelgel auf
das Trenngel gegossen und der Taschenkamm, der für das Einfüllen der
Proben für Aussparungen im Sammelgel sorgte, eingesetzt. Die Proben wurden
vor dem Auftragen im Verhältnis 3:1 mit dreifach konzentriertem Probenpuffer
mit DTT (Dithiothreitol, spaltet intra- bzw. intermolekulare Disulfidbrücken)
vermischt und für 5 min auf 56°C erhitzt. Der Auftragspuffer enthielt Glycerin,
damit die Gesamtprobe durch ihre höhere Dichte in die Taschen sank, und den
Farbstoff Bromphenolblau zum visuellen Verfolgen des Auftrags- und
Elektrophoreseprozesses. Neben den Proben wurde
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ein Größenmarker
aufgetragen (Prestained protein ladder; PPL Marker; Fermentas, St. Leon –
Rot). Die Elektrophorese wurde in 1 x Elektrophoresepuffer bei einer Spannung
von 80 V im Sammelgel und bis zu 160 V im Trenngel durchgeführt, bis die
durch den Farbstoff markierte Lauffront aus dem Gel herausgelaufen war.
Anschließend wurde das Gel für einen Immunoblot genutzt.
2.5.3. Immunoblot
Nach der SDS- PAGE Gelelektropherese werden die, der Größe nach
aufgetrennten Proteine, auf eine Nitrozellulosemembran (Hybond-C extra,
Amersham, Braunschweig) geblottet. Dies geschieht im halbtrockenen
Verfahren nach Towbin (Towbin et al. 1979) Dabei werden das SDS Gel und
eine Nitrozellulosemembran ummantelt von jeweils zwei mit Transferpuffer [25
mM Tris, 192 mM Glycin, 20% (v/v) Methanol] angefeuchteten Filterpapieren in