Willinger.ppt [Schreibgeschützt]

Stand der Entwicklung der
Resistenztestung/EUCAST
Birgit Willinger
Abteilung für Klinische Mikrobiologie
Klinisches Institut für Hygiene und
Medizinische Mikrobiologie
Medizinische Universität Wien

Resistenztestung
Dauerbrenner
oder
alter Hut ?

Ist die Hefe empfindlich?
Die Aussage der Empfindlichkeitsprüfung
ist so gut wie der Wetterbericht: gut, um
Trends vorherzusagen, aber nicht sehr
hilfreich, um zu entscheiden, ob nächstes
Jahr am 10. Juli eine Hochzeitsfeier im
Freien veranstaltet werden kann.
J.H.Rex, 1999

Wozu Resistenztestung?
Es sollen die Stämme, bei denen mit keinem
Ansprechen gegenüber dem getesteten
Antimykotikum zu rechnen ist, auf möglichst
einfache und verläßliche Art erkannt werden.
? Verminderung der Therapieversager
? Verbesserung des Therapieerfolges
? Keine Erfolgsvorhersage!

Resistenztestung im klinischen
Alltag
• Bei eingeschränkten therapeutischen
Möglichkeiten (Patient, Interaktionen)
• Fehlendes Ansprechen auf Therapie
• „Breakthrough“ - Infektionen

Standardisierte Methoden zur
Resistenzbestimmung
• EUCAST - fermentierende Hefen
• EUCAST – Schimmelpilze (Aspergillus)
• CLSI M27-A2- Makro/Mikrodilution –Hefen
• CLSI M38-A – Mikrodilution/Schimmelpilze
• CLSI M 44-A – Agardiffusion/Hefen
• DIN 58940-84 – Mikrodilution (Hefen)

Resistenztestung von Hefen

Testung von Hefen im Vergleich
Methodenvergleich
M27-A2
EUCAST
DIN 58940-84
Zielgruppe
Hefen
fermentierende Hefen
Hefen
Platte
Microtiter 96 U;
Microtiter 96 F
Microtiter 96 U
Gesamtvolumen
200 µl
200µl
200 µl
Medium
RPMI 1640 +
RPMI 1640 +
HR-Medium*
Amphotericin B:
Amphotericin B:
(+ 0,5 mg /L
Antibiotic medium 3?
Antibiotic medium 3
Methylenblau)
Glucose- Konz.
0,20%
RPMI 2% / AM3 2%
2%
Puffer
MOPS
MOPS
Phosphatpuffer
pH
6,9 – 7,1 (25°C)
7,0 ± 0,2
6,8 – 7,2
Inoculum (Zellen/ml)
0,5 – 2,5x10 3
0,5 – 2,5x10 5 in A.d.
0,5 – 2,5x10 3
Temperatur (°C)
35°C
35°C – 37°C
36°C ± 1 °C
Auswertung nach
46-50 h
24h
18 (24, 48) ± 2 h
C.neoformans
70 – 74 h
entfällt
48 + 72 h
visuell / photometrisch
visuell
photometrisch
visuell
Ablese-Hilfen
80 % Inhibition
Endpunkt : 50% Inhibition
(MIC50%) 5FC + Azole
80 % Inhibition
MIC 80% : AmB
Nach W. Fegeler, 2006
+ mit Glutamin, ohne Bicarbonat
MOPS: 3-N-(morpholino)propanesulfonic acid
HR*. Modifiziert nach
Schmalreck

MHK Breakpoints: Nur für einige
Substanzen etabliert
Substanz
Susceptible
(S)
Susc.-dose
dependent
(S-DD)
Intermediate
(I)
Resistant
(R)
Fluconazol
< 8
16-32
-
> 64
Itraconazol
< 0.125
0.25-0.50
-
> 1
Voriconazol*
< 1
2
> 4
Flucytosin
< 4
-
16-32
> 32
Amphotericin B
?
?
?
?
NCCLS M27-A2, 2002,
reference microdilution method
*Pfaller 2006, JCM 44, 819-826
Ampho MHKs sind in einem engen Bereich verteilt, Detektion resistenter
Stämme ist daher sehr schwierig Antibiotic Medium 3 als mögliche Alternative
(kontraversielle Daten)
Nguyen et al. J Infect Dis 1998; 177: 425 ; Rex et al. AAC 1995; 39: 906
Park et al., AAC 2006, 50; 1287-97

Vergleich EUCAST und CLSI M27-A2
• Internationale Multicenterstudie mit 6 Labors
anhand 71 Candida-Isolaten
• Vergleich von Fluconazol, Itraconazol,
Posaconazol und Voriconazol
• Interlaboratorielle Reproduzierbarkeit
• Einsatz der CLSI-Breakpoints für EUCAST
Espinell-Ingroff et al. 2005, JCM 43, 3884-3889

Übereinstimmung zwischen
EUCAST und CLSI (in Prozent)
Flu
Itra
Vori
Posa
Übereinstimmg.
E-N 24h (%)
95
90
94
91
EUCAST-CLSI
E-N 48h (%)
94
85
92
90
Interlaborat.
EUCAST (%)
95
93
93
92
Übereinst.
CLSI (%)
Übereinstimmung innerhalb 2 Verdünnungsstufen ohne Berücksichtigung der
Interpretation
⇒Beste Übereinstimmung mit Flu und Vori!
⇒24h- Werte besser als 48h!
⇒ 24h –Ablesung für Flu und Vori ev. auch nach CLSI
Espinell-Ingroff et al. 2005, JCM 43, 3884-3889
97
93
95
96

Übereinstimmung zwischen EUCAST und
CLSI nach Breakpoints
Substanz/Methode
S (%)
S-DD (%)
R (%)
Übereinst. (%)
Fluco - CLSI
66
17
17
78,5
Fluco - EUCAST
73
18
8
Itra - CLSI
48
38
14
58,5
Itra - EUCAST
76
18
6
EUCAST: S/SDD;
CLSI: SDD/R
9% (5/58) very major errors bei Flu-resistenten Stämmen (64 µg/ml)
50% (18/36) very major errors bei Vori-resistenten Stämmen ( 4 µg/ml)
Posa Werte mit EUCAST stets niedriger als mit CLSI
Kein Einsatz der CLSI-Breakpoints für EUCAST!
Espinell-Ingroff et al. 2005, JCM 43, 3884-3889

Agardiffusion
• Standard CLSI M44-A – Candida spp.
• Mueller-Hinton-Agar
• + 2% Glucose
• + 0,5 µg/ml Methylenblau
• pH 7,2 – 7,4
• Ablesung nach 24h, ev. 48h
• HHD und Interpretationshilfe für Fluconazol
R
S-DD
S
Fluconazol 25 µg
< 14 mm
15 -18 mm
> 19 mm

Agardiffusion - Voriconazol
• Keine Interpretationshilfe nach M44-A
• Vorschlag nach Pfaller et al. 2005 (JCM 43, 5208-5213)
R
S-DD
S
Voriconazol 1µg
< 13 mm
14 -16 mm
> 17 mm
Voriconazol Mikrodilution*
> 4 µg/ml
2 µg/ml
< 1 µg/ml
*Pfaller et al. 2006; JCM 44, 819-826)
Übereinstimmung: 93,8%
Very major errors: 0,2%
Major errors: 3,4%
Minor errors: (2,6%)
Beste Übereinstimmung bei C. albicans (99,8%);
geringste Übereinstimmung bei C. glabrata, C. tropicalis

Testung der Echinocandine
• Bisher keine standardisierte Testung, keine Breakpoints
• Testung von Caspofungin nach EUCAST und CLSI
verlässlich (Chryssanthou et al. 2002, JCM 40, 3841-44)
• Bevorzugte Testung derzeit nach M27-A2
• QC:C. parapsilosis (ATCC 22019)
C. krusei (ATCC 6258)
• In vitro-Aktivität unabhängig von Fluconazol-Resistenz
sehr gut
Ausnahme: C. parapsilosis, C. guilliermondii

In vitro Empfindlichkeiten -
Caspofungin
• 8197 invasive Candida-Isolate (Blut, steriles Material)
• M27-A2, Endpunktablesung nach 24h
• Gute Aktivität: 99,7% MIC < 1 µg/ml
• MIC > 1µg/ml:
• C. parapsilosis (1%)
• C. guilliermondii (6%)
• C. rugosa (n=2/8)
• C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis,
C. lusitaniae (jeweils 1 Stamm)
Keine Veränderung des Aktivitätsmusters seit Einführung von Caspofungin!
Pfaller et al. 2006, JCM 44, 760-763

In vitro-Aktivität von Micafungin bei
Fluconazol-resistenten Candida-Isolaten
Gute Aktivität von Micafungin
Messer et al. 2006, JCM 44, 324-326

In vitro Empfindlichkeiten -
Anidulafungin
• 2235 invasive Candida-Isolate (Blut, steriles Material)
• 315 Flu-resistente Stämme inkludiert
• M27-A2, Endpunktablesung nach 24h
• Gute Aktivität: 90 % MIC < 1 µg/ml
• C. lusitaniae – geringere Aktivität (0,12-1 µg/ml)
• MIC >1µg/ml:
• C. parapsilosis (61%)
• C. guilliermondii (40%)
• 315 Flu-resistente Candida spp: 99% < 1 µg/ml
Pfaller et al. 2006, JCM 44, 760-763

Resistenztestung von
Schimmelpilzen

Empfindlichkeitstestung
Fadenpilze
Methode
Einsaat
Inokulum
Einstellung des In.
Testmedium
Format
Temperatur
Inkubationsdauer
Endpoint
CLSI M38A
Aspergillus, Fusarium,
Rhizopus, Pseudallescheria,
Sporothrix
0,4 x 10 4 - 5 x 10 4 CFU/ml
Spektrophotometer
RPMI 1640
Mikrodilution
35°C
21 h - 48h – 70h
Kein Wachstum
EUCAST-Aspergillus
Aspergillus spp.
2 - 5 x 10 5 CFU/ml
Hämocytometer
RPMI + 2% Glucose
Mikrodilution
35°C
48h
Kein Wachstum
Stammlösungen, antifungale Substanzen, Verdünnungsreihen, QC identisch
Nach C. Lass-Flörl, 2006

Interlaboratorielle Evaluierung nach
EUCAST
A. fumigatus ATCC 204305
Drug
MIC range
MICs in the range (%)
AmB
ITRA
VORI
POSA
0.25-1.0
0.12-0.50
0.25-1.0
0.03-0.25
100
100
94.4
90.3
A. flavus ATCC 204304
Drug
MIC range
MICs in the range (%)
AmB
ITRA
VORI
POSA
0.50-2.0
0.12-0.50
0.50-2.0
0.12-0.50
97.2
100
91.7
91.7
Lass-Flörl et al., 2006

Offene Punkte und Probleme
• Breakpoints – noch offen
• Vorschlag - Itraconazol: MIC > 8 µg/ml – resistent
MIC < 0,5 µg/ml – empfindlich
• Testung der Echinocandine
• Medium: RPMI vs. Antibiotic Medium 3
• Trailing – Phänomen
• MIC ⇒ MEC (minimum effective concentration)
• Bisher jedoch noch keine klinisch relevanten
Resistenzen beschrieben

Der Labor-Alltag

Anforderungen an
routinetaugliche Testung
• Methode mit guter Reproduzierbarkeit
• Einfache Handhabung
• Rasche Durchführung
• Einfache Ablesung
• Möglichst wenig Einschränkungen
• Breakpoints
Mikrodilution nicht routinetauglich!

Wirkspektrum der Antimykotika
Species
Ampho
Keto
Flu
Itra
Vori
Caspo
albicans
+++
++
+++
+++
+++
+++
glabrata
++
+
++
++
++
+++
guilliermondii
++
+
+++
+++
+++
++
krusei
++
+
0
++
++
+++
lusitaniae
++
++
+++
+++
+++
+++
parapsilosis
+++
++
+++
+++
+++
++
tropicalis
+++
++
+++
+++
+++
+++
+++ reliable activity with occasional resistance
++ moderate activity but resistance is noted
+ occasional activity
0 no meaningful activity
Arikan & Rex. Manual of Clinical Microbiology
2003, 8th ed., 1859

Resistenztestung im klinischen
Alltag
• Screening mit semiquantitativen Methoden
• Blättchentest
• Breakpointtest
• Weiterführende Untersuchungen mit
quantitativen Methoden
• E-Test
• Mikrodilution

Alltag in europäischen Laboratorien
- EFISG Survey
• Routinemäßige Resistenztestung
• 94% aller befragten Labors
• Meistens nur für klinisch relevante Isolate
• Methode:
• 42% E-Test
• 24% Plättchentest nach CLSI
• 4% EUCAST
Bille et al., ECCMID 2006, P737

Empfehlungen für die
Resistenztestung
1. Identifizierung bis zu Genus-, besser noch
Speziesebene
2. Routinemäßige Testung von Fluconazol oder
Flucytosin bei Isolaten aus sterilen
Körperkompartimenten
3. Bei Behandlung von therapieresistenten
invasiven Candida-Infektionen mit
Amphotericin B
4. Spezies mit intrinsischer Resistenz nicht testen
Rex, CID 2002, 35: 982-989

Resistenztestung
Dauerbrenner
oder
alter Hut ?
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!