Extended-Spectrum Beta-Lactamasen (ESBL) - Paul Ehrlich ...

Bad Honnef-Symposium 2009
Antibiotikaresistenz- Mechanismen der Entstehung,
Ausprägung und Ausbreitung
Extended-Spectrum Beta-Lactamasen (ESBL)
und Carbapenemasen
Dr. Yvonne Pfeifer
06./07.04.2009

Gramnegative, nosokomiale Erreger als Beta-Lactamase-Bildner
Escherichia coli
Klebsiella ssp.
Enterobacter ssp.
Citrobacter ssp.
Morganella ssp.
Providencia ssp.
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumannii
●
●
●
Harnwegsinfektionen, Urosepsis
Wundinfektionen, Bakteriämie, Sepsis
Infektion der Atemwege/
Nosokomiale Pneumonie
Resistenzen:
●
●
●
●
Beta-Lactam-Antibiotika
Aminobenzylpenicilline (Ampicillin)
Cephalosporine (Cefoxitin, Ceftriaxon, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefepim)
Monobactame (Aztreonam)
Carbapeneme (Ertapenem, Imipenem, Meropenem)
Sulfomamide (Sulfamethoxazol/Trimethoprim)
Aminoglycoside (Amikacin, Gentamicin,)
Chinolone (Ciprofloxacin, Ofloxacin)
6-Aminopenicilliansäure

Einteilung der β-Lactamasen nach Ambler (DNA-Sequenz basiert)
Serine-β-lactamases
Metallo-βlactamases
Ambler
classes
A C D B
General
designation
ESBL AmpC OXA Metallo-β-lactamases
Important
examples
Preferential
occurrence
Important
phenotypica
l resistance
traits
•TEM-1, TEM-2
SHV-1
•TEM-type ESBL
•SHV-type ESBL
CTX-M
penicillins,
cefotaxime,
ceftazidime,
cefpodoxime,
•KPC
•GES
•SME
Enterobacteriaceae
penicillins
cephalosporins,
imipenem,
meropenem,
ertapenem
AmpC enzymes:
•CMY
•MOX
•ACC
•DHA
Enterobacteriaceae
penicillins
cefoxitin
cefotaxime
ceftazidime
cefpodoxime
•OXA-type
ESBL
oxacillin,
cefotaxime,
ceftazidime,
cefpodoxime
•OXA-type
carbapenemases
Enterobacteriaceae,
A. baumannii
penicillins,
cephalosporins
imipenem,
meropenem,
ertapenem
carbapenemases
•VIM
•IMP
A. baumannii
P. aeruginosa
penicillins,
several cephalosporins,
imipenem,
meropenem,
ertapenem

Diagnostik: Phänotypische Resistenzbestimmung ESBL
ESBL
Fähigkeit zur Hydrolyse von 3. Generation Cephalosporinen
Hemmbarkeit durch ß-Lactamase Inhibitoren (z.B. Sulbactam)
Bestätigungstests
• Mikrobouillonverdünnungstest für den ESBL-Nachweis
(A)
CTX CAZ CPD CTX/SUL CAZ/SUL CPD/SUL
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)
128
WK
128
WK
128
WK
128
WK
128
WK
128
WK
ESBL-positiv:
(B)
64
0,008
64
0,008
64
0,008
64
0,008
64
0,008
64
0,008
MHK Ceftazidim o. Cefotaxim
≥ 2 μg/ml
(C)
32
0,016
32
0,016
32
0,016
32
0,016
32
0,016
32
0,016
(D)
16
0,032
16
0,032
16
0,032
16
0,032
16
0,032
16
0,032
MHK Cefpodoxim
≥ 8 μg/ml
(E)
8
0,063
8
0,063
8
0,063
8
0,063
8
0,063
8
0,063
(F)
(G)
4
2
0,125
0,25
4
2
0,125
0,25
4
2
0,125
0,25
4
2
0,125
0,25
4
2
0,125
0,25
4
2
0,125
0,25
Quotient aus MHK Cephalosporin
und MHK Cephalosporin. + Inhibitor ≥ 8
(H) 1
0,5
1
0,5
1
0,5
1
0,5
1
0,5
1
0,5

Beta-Lactamase-Typ und Phänotypische Resistenz
Antibiotika
Hemmbarkeit
β-Lactamase AP CPD CTX CAZ FOX ETP SUL, CLV, EDTA
TEM ESBL R R V R S S SUL, CLV
SHV ESBL R R V R S S SUL, CLV
CTX-M-ESBL R R R V S S SUL, CLV
K1 (K.
oxytoca)
R R V S S S
-
AmpC R R R R R S
-
MBL R R R R R R
EDTA
AP, Ampicillin; CPD, Cefpodoxim; CTX, Cefotaxim; CAZ, Ceftazidim; FOX, Cefoxitin; SUL, Sulbactam; CLV,
Clavulansäure; ETP, Ertapenem; R, Resistent; V, variabel; S, sensitiv
Veränderung des Phänotyps durch Kombination von verschiedenen
Beta-Lactamasen und weiteren Resistenzmechanismen
Molekulare Diagnostik (Resistenz-Genotyp) erforderlich

Verbreitung der Resistenz gegen Cephalosporine und gegen Carbapeneme
●
Klonale Ausbreitung resistenter Stämme
●
●
Mobilisierung chromosomaler „Vorläufer-Gene“ (z.B. CTX-M) über,
Integrons, Transposons und Integration in Resistenzplasmide
Horizontaler Gentransfer - Übertragung von konjugativen Plasmiden
innerhalb der Spezies oder in andere Spezies
A
B
Ausbreitung von Resistenz-
Plasmiden zwischen
verschiedenen Isolaten
A Donor
B Rezipient
●
„Akkumulation“ von verschiedenen Resistenzgenen auf mehreren
MGEs (Transposons) hintereinander möglich:
multi-drug resistance regions (MDR)
Multiresistente Erreger (MRE)

Molekulare Nachweismethoden
●
PCR-Amplifikation und Sequenzierung der bla-Gene
ESBL-Multiplex-PCR
M 1 2 3 4 5 MP
CTX-M-Multiplex-PCR
M 1 2 3 4
MP
M 2 3 4
bla TEM
bla SHV
bla CTX-M
CTX-M-14 spez.
CTX-M-9-type
CTX-M-2-type
CTX-M-1-type
AmpC-Multiplex-PCR
1 5 MP
Universalprimer erfassen nahezu alle Genvarianten eines Beta-Lactamase Types
Gesamt-Gen Sequenzierung nötig für epidemiologische Untersuchungen
MOX A.h.
EBC E.cl.
ACC H.a.
DHA M.m.
CMY C.f.
●
Oligonukleotid-Microarray zur Beta-Lactamase Identifikation
1,00
●
●
●
●
schnell
sensitiv
spezifisch
teuer!
rel. intensity (RI)
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
S163 S163.2 S180 S182 S194 S194.2 S202 S216 S235 S235.2 S236 S236.2 S237 S241 S241.2 S258 S261 S264 S271 S272 S276
S241: agc Ser
A
G
C
T

Molekulare Epidemiologie
Die Frage nach der Verwandtschaft:
Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
●
●
Makrorestriktionsanalyse (PFGE)
Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST)
ESBL Inc-group
CTX-M-15
FII
CTX-M-15
FII
CTX-M-15
FII
CTX-M-1; TEM-1
CTX-M-1; TEM-1
CTX-M-1; TEM-1
CTX-M-15; TEM-1 FII
CTX-M-65; TEM-1
CTX-M-15
I1
CTX-M-15; TEM-1 FII
●
PCR-Nachweis der Plasmid-Inkompatiblitätsgruppen und Analyse der
„genetic environment“:
ΔISEcp1
IS26
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
Δmph(A)
Δmrx
IR-R IR-RIR-R IR-L
tnpA
hypA
bla CTX-M
hypB
ΔORF2

Resistenz-Übertragbarkeit
Konjugationsexperiment: Übertragung der Resistenzplasmide in einen
sensitiven Rezipienten
A
bla ESBL
B
A Donor: Resistenz
gegen Ampicillin
B Rezipient: Resistenz
gegen Natriumazid
Plasmidisolation
S 1 2 3 4 5 6 S 7 8 91011 12 S
1 2 M 1 2 M
53000 bp
90000 bp
53000 bp
7200 bp
6000 bp
5550 bp
5100 bp
3900 bp
3000 bp
2700 bp
2100 bp
1 K. pneumoniae CTX-M-9, CMY-4, VIM-1
2 E. coli K CMY-4, VIM-1
7200 bp
6000 bp
5550 bp
5100 bp
3900 bp
3000 bp
2700 bp
2100 bp
Southern Hybridisierung
3 E. coli 335/07 CTX-M-14 + TEM-110 + SHV-12
4 E. coli K 335/07 CTX-M-14

Verbreitung der Cephalosporin-Resistenz bei Enterobakterien
EARSS - European Antimicrobial Resistance Surveillance System
No data*
< 1%
1 - 5%
5 - 10%
10 E. - 25% coli und K. pneumoniae mit ESBL-Phänotyp
Resistenzstudie der PEG (Paul-Ehrlich-Gesellschaft e.V.)
25 - 50%
14
12
> 50
10
ESBL Rate in %
8
6
4
2001
2004
2007
2
0
E. coli K. pneumoniae
Proportion of invasive isolates of Escherichia coli with resistance to third generation
cephalosporins in 2006 (http://www.rivm.nl/earss/ on 28th Feb 2009)
*These countries did not report any data or reported less than 10 isolates

Antibiotika-Resistenz-Surveillance in Deutschland
Cephalosporin- und Carbapenemresistenz in Enterobacteriaceae
Untersuchung zu Vorkommen und Verbreitung von ESBL-Typen
nosokomialer Enterobacteriaceae in Deutschland
Erkennen von „Resistenz-Trends“ (Frühwarnfunktion)
Molekulare Diagnostik und deren Weiterentwicklung
ARS-ESBL-Projekt 2008
Molekulare Untersuchung von ESBL Isolaten aus mehr
als 100 beteiligten Kliniken in ganz Deutschland:
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
(Proteus mirabilis)
n = 1
n = 1
n = 1
n = 1
Isolate mit ESBL-Phänotyp aus
Blutkultur, Wundabstrichen,
Trachealsekret

Deutschland: ESBL in nosokomialen E. coli
Antibiotikaresistenz-Surveillance (ARS): ESBL-Projekt 2008
2004 2008
no. of strains n = 49 no. of strains n = 154
no. of hospitals n = 29 no. of hospitals n = 150
TEM type n = 7 TEM type n = 6
SHV type n = 2 SHV type n = 3
CTX-M type n = 40 (81 %) CTX-M type n = 143 (93 %)
CTX-M-1 n = 10 CTX-M-1 n = 50
CTX-M-2 n = 2 CTX-M-2 n = 4
CTX-M-3 n = 7 CTX-M-3 n = 1
CTX-M-9 n = 7 CTX-M-9 n = 2
CTX-M-14 n = 2 CTX-M-14 n = 10
CTX-M-15 n = 11 (27,5%) CTX-M-15 n = 76 (53 %)
ca. 70-80% aller ESBL Isolate resistent gegen Sulfonamide und Fluorchinolone

Untersuchung von “Ausbruchs- Isolaten”
RKI-Nr. Herkunft bla-Gen (ESBL-MP-PCR)
165/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
●
●
●
23 E. coli aus der Neonatologie/
Neointensivstation mit ESBL-Verdacht
CTX-M-15 als häufigste ESBL-Variante
Klonale Verbreitung innerhalb der Station
KLUC-1
CTX-M-10
CTX-M-3
CTX-M-28
CTX-M-15
CTX-M-22
CTX-M-23
CTX-M-1
CTX-M-21
CTX-M-17
CTX-M-24
CTX-M-14
CTX-M-9
CTX-M-16
CTX-M-6
CTX-M-7
CTX-M-4
CTX-M-2
CTX-M-20
KLUA-Enzyme
KLUG-1
CTX-M-8
CTX-M-25
CTX-M-26
[AAK08976]
[AAF65843]
[BAB40925]
[AJ549244]
[AAL02127]
[AAL86924]
[AAL99990]
[P28565]
[CAD08929]
[AAM33515]
[AAN38836]
[AAF72530]
[AAF05311]
[AAK32961]
[CAA06311]
[CAA06312]
[CAA74573]
[P74841]
[CAC95175]
[CAB59824]
[AF501233]
[AAF04388]
[AAM70498]
[AY157676]
KLUC-1 Gruppe
CTX-M-1 Gruppe
> 97 % Sequenz-Identität
CTX-M-9 Gruppe
> 98 % Sequenz-Identität
CTX-M-2 Gruppe
> 94 % Sequenz-Identität
CTX-M-8 Gruppe
> 98 % Sequenz-Identität
CTX-M-25 Gruppe
> 98 % Sequenz-Identität
166/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
167/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
168/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
169/07 Kind CTX-M-2
170/07 Kind CTX-M-2
171/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
172/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
173/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
174/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
175/07 Kind CTX-M-15
176/07 Kind CTX-M-15
177/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
178/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
179/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
180/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
181/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
182/07 Kind TEM-1 + CTX-M-15
183/07 Mutter TEM-1 + CTX-M-1
184/07 Personal TEM-1 + CTX-M-15
20/08 (1) Mutter TEM-1 + CTX-M-15
20/08 (2) Mutter TEM-1 + CTX-M-15
21/08 Personal TEM-1 + CTX-M-15

Plasmid-Transfer zwischen verschieden Spezies
●
ESBL-Screening von Patienten einer Klinik:
Gleichzeitige Besiedlung mit E. coli und Klebsiella pneumoniae
Spezies Beta-Lactamase Spezies Beta-Lactamase
E. coli TEM-1 + CTX-M-3 K. p. SHV-11 + CTX-M-3
E. coli TEM-1 + CTX-M-15 K. p. TEM-1 + SHV-32 + CTX-M-15
E. coli TEM-1 + CTX-M-1 K. p. TEM-1+ CTX-M-1
Konjugation,
Plasmidisolation:
E.c. Konj. M K.p. Konj.
53000 bp
E. c. TEM-1 + CTX-M-1
Konj. TEM-1
K.p. TEM-1 + CTX-M-1
Konj. CTX-M-1
M = Plasmidstandard V517 E. coli

ESBL in Salmonella spp.
●
●
●
16 humane Isolate Salmonella enterica
serovar Typhimurium, Lysotyp DT193
aus fünf Bundesländern
Gastroenteritis,Harnwegsinfektion
1 = 6/07 CTX-M-1 + TEM-1
2 = 7/07 CTX-M-1 + TEM-1
3 = 8/07 CTX-M-1 + TEM-1
4 = 9/07 CTX-M-1 + TEM-1
5 = 10/07 CTX-M-1 + TEM-1
6 = 11/07 CTX-M-1 + TEM-1
7 = 12/07 CTX-M-1 + TEM-1
Bayern
Bayern
Niedersachsen
Thüringen
Thüringen
Sachsen-Anhalt
Bayern
Nachweis des Stammes in Isolaten aus
Schweinekot
S
Xba-I-Makrorestriktionsanalyse (PFGE)
1 2 3 S 4 5 6 7 S
S = S. enterica Braenderup universal marker
●
●
Erstmaliger Nachweis von „importiertem“ Salmonella Typhi mit CTX-M-15
ESBL und übertragbarer Chinolonresistenz (Qnr-Determinanten)
Leichte Übertragbarkeit der
Resistenzplasmide Salmonella ein mögliches ESBL-“Reservoir“?

Ambler-Klasse C: AmpC-β-Lactamasen
Chromosomal-kodierte
AmpC-β-Lactamasen
Plasmid-kodierte
AmpC-β-Lactamasen
●
●
Konstitutive o. induzierbare highlevel
Expression des Wildtyp
ampC Gens in E. cloacae,
Citrobacter freundii
High-level Expression durch
Mutationen im E. coli ampC
Promoter
●
●
CMY
ACC
ACT
FOX
LAT
MOX
6 Gen-Familien abgeleitet von
verschiedenen Ursprungsspezies
High-level Expression z.B.
in E. coli ; K. pneumoniae
Cephalosporinresistenz
„Cefoxitin-Markerresistenz“
Klonale Verbreitung,
Konvergente Evolution
Cephalosporinresistenz
„Cefoxitin-Markerresistenz“
Verbreitung durch horizontalen
Gentransfer

Y. Pfeifer, Epidem. Bull. 28/2007
Cephalosporin-Resistenz in E. coli
• ESBL-Bildung: TEM, SHV, CTX-M (Kombination TEM-1 + CTX-M häufig)
→ Resistenz gegen 3. Gen Cephalosporine, hemmbar durch Inhibitoren
• Plasmid-kodierte AmpC-β-Lactamasen: CMY-type Enzyme am häufigsten
→ Resistenz gegen Cefoxitin + 3.Gen Cephalosporine, nicht hemmbar
• High-Level Expression der Spezies-eigenen AmpC-β-Lactamase
durch Mutationen der chromosomalen ampC Promoter Region
-42 -35box -18 -10box -1
WT AmpC* TCCTGACAGTTGTCACGCTGATTGGTGTCGTTACAATCTAACGCATCGCCAATGTAAATCCGGCCCGCC
108/04 --T-----------------------A----------------T-------------------------
67/04 ------------A---A----------------T-----------------------------------
99/04 -------------------------I---------------------------------------T---
+58
WT AmpC* TATGGCGGGCCGTTTTGTATGGAAACCAGACCCTATGTTCAAAACGACGCTCTGCGCCTTATTAAT
108/04 --------------------------------T---------------------------------
67/04 ---------D----------------------T----------------------A----------
99/04 --------------------------------------------T---------------------

Carbapenemresistenz und Carbapenemasen
Das noch sehr seltene Auftreten (in Deutschland unter 1% der Isolate) muss sehr
ernst genommen werden; die Erreger sind resistent gegen fast alle verfügbaren
Antibiotika; die damit verbundenen Infektionen enden oft tödlich !
Beispiel:
Klasse A Carbapenemasen
weltweite Ausbreitung des Gens
für die Carbapenemase KPC-2
EARSS-Report http://www.rivm.nl/earss/ on 28th Feb 2009
KPC-2 in K. pneumoniae
1998 USA
2004 China
2005 Kolumbien
2005 Frankreich
2005 Israel
2008 Griechenland
2008 Deutschland
C. Wendt, Epidem. Bull. 22/2008

Ambler Klasse D: OXA-β-Lactamasen und Carbapenemresistenz
Multiresistente Acinetobacter baumannii und Enterobacteriaceae
●
Ausbrüche in einer Klinik 2007:
Carbapenemase-bildende A. baumannii mit
schwerem Infektionsverlauf
PCR-Nachweis der Gene bla OXA-23
und bla OXA-58
●
A. baumannii Einzelisolate von oft zuvor im Ausland hospitalisierten Patienten:
Übertragbare Carbapenemresistenz: OXA-23; OXA-24; OXA-48; OXA-58
Klonale Verbreitung:
Überexpression der chromosomalen
OXA-51-like Beta-Lactamase:
TGTACAGAG
ISAbal
AAGTCTTATGAACATT….
7 bases bla OXA-51-like
Turton et al., FEMS Microbiol. Lett. 2006; 258: 72-77

●
Ambler Klasse B: Metallo-β-Lactamasen
Mobilisierung der Gene bla VIM
und bla IMP
aus Acinetobacter baumannii und
Pseudomonas aeruginosa und Transfer in Enterobacteriaceae
●
Carbapenemresistenz und Multiresistenz in Enterobacteriaceae durch
Kombination der Beta-Lactamase-Bildung mit anderen Resistenzmechanismen:
Carbapenem-Resistenz und Porin-Verlust
OMP – outer mebrane protein (OmpA-Trimer)
1
, 2bp-Deletion → STOP in ompK-35
2
, 384 bp-Deletion in ompK-36
3
, 600 bp-Deletion in ompK-36
Antibiotika K.p. 5 K.p. 54 K.p. 149
Imipenem 16 2 2
Imipenem/EDTA ≤ 1 1 1
Meropenem 32 4 2
bla TEM
- - -
bla SHV
1 5 1
bla CTX-M
- - 15
bla ampC
- - -
bla VIM
1 - -
qnr-Gen - qnr-B -
Porin OmpK35 - 1 + +
Porin OmpK36 + - 2 - 3

Metallo-β-Lactamasen und Multiresistenz
Antibiotika
Ampicillin
Mezlocillin
K.p. 62
> 16
> 32
K.o. 57
> 16
> 32
●
Auftreten multiresistenter K. pneumoniae (n = 4) in
zwei Kliniken mit Resistenzen gegenüber allen
verfügbaren Antibiotika außer Colistin und Tigecyclin
MSU
Cefotiam
Cefotaxim
Ceftazidim
Cefoxitin
Gentamicin
> 32
> 8
> 16
> 32
> 32
> 8
> 32
> 8
> 16
> 32
> 32
2
●
●
bla CMY-4 und bla VIM-1 auf einem Plasmid lokalisiert
und übertragbar → multiresistenteTranskonjuganten
Auftreten multiresistenter K. oxytoca (n = 5) in zwei
Kliniken mit bla VIM-1 und übertragbarer
Chinolonresistenz
Kanamycin
> 32
> 32
Beta-Lactamase Gen (bla)
Amikacin
> 32
≤ 2
K.p. 62 K.o. 57
Streptomycin
> 64
> 64
Nalidixinsäure
> 32
> 32
bla TEM
- -
Oxytetrazyclin
> 8
> 8
bla SHV
1 -
Chloramphenicol
Ciprofloxacin
Sulfameracin
SXT
Colistin
Imipenem
> 32
> 64
> 512
> 128
0,5
64
> 32
64
> 512
> 128
0,5
64
bla CTX-M
9 -
bla ampC
CMY-4 -
bla VIM
1 1
qnr-Gen - qnr-B
Porin OmpK35 - a - b
Imipenem+EDTA
Meropenem
≤ 1
32
≤ 1
128
Porin OmpK36 + - b
a , IS1-Transposase in ompK-35; b , bp-Deletionen
Y. Pfeifer, Epidemiol. Bull. 14/2008

Zusammenfassung
Cephalosporinresistenz in Enterobacteriaceae:
ESBL (CTX-M)
AmpC Überexpression
AmpC Plasmid-vermittelt (CMY)
Enterobacteriaceae
Enterobacter spp., E. coli
E. coli, Klebsiella spp., Salmonella spp.
Carbapenemresistenz in Enterobacteriaceae und Nonfermentern:
KPC
E. coli, Klebsiella spp.
OXA Plasmid-vermittelt
OXA Überexpression
Metallo-β-Lactamasen
(VIM, IMP)
E. coli, Klebsiella spp., A. baumannii, P. aeruginosa
A. baumannii
E. coli, Klebsiella spp. Enterobacter spp.,
A. baumannii, P. aeruginosa
Auftreten multiresistenter Enterobacteriaceae, insbesondere Klebsiella spp.,
wobei die therapeutischen Möglichkeiten nahezu erschöpft sind
Risiko Horizontaler Gentransfer: Übertragung von Multiresistenz-
Plasmiden innerhalb der Spezies und in andere Spezies

Danke
Prof. Dr. Wolfgang Witte
Sibylle M.-Bertling
Angela Danschke
Dr. Guido Werner
Dr. Birgit Strommenger
Dr. Rita Prager
Dr. W. Rabsch
Dr. Anne-Marie Fahr
Herzlichen Dank an alle Einsender!