Willinger.ppt [Schreibgeschützt]
Willinger.ppt [Schreibgeschützt]
Willinger.ppt [Schreibgeschützt]
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
Stand der Entwicklung der<br />
Resistenztestung/EUCAST<br />
Birgit <strong>Willinger</strong><br />
Abteilung für Klinische Mikrobiologie<br />
Klinisches Institut für Hygiene und<br />
Medizinische Mikrobiologie<br />
Medizinische Universität Wien
Resistenztestung<br />
Dauerbrenner<br />
oder<br />
alter Hut ?
Ist die Hefe empfindlich?<br />
Die Aussage der Empfindlichkeitsprüfung<br />
ist so gut wie der Wetterbericht: gut, um<br />
Trends vorherzusagen, aber nicht sehr<br />
hilfreich, um zu entscheiden, ob nächstes<br />
Jahr am 10. Juli eine Hochzeitsfeier im<br />
Freien veranstaltet werden kann.<br />
J.H.Rex, 1999
Wozu Resistenztestung?<br />
Es sollen die Stämme, bei denen mit keinem<br />
Ansprechen gegenüber dem getesteten<br />
Antimykotikum zu rechnen ist, auf möglichst<br />
einfache und verläßliche Art erkannt werden.<br />
? Verminderung der Therapieversager<br />
? Verbesserung des Therapieerfolges<br />
? Keine Erfolgsvorhersage!
Resistenztestung im klinischen<br />
Alltag<br />
• Bei eingeschränkten therapeutischen<br />
Möglichkeiten (Patient, Interaktionen)<br />
• Fehlendes Ansprechen auf Therapie<br />
• „Breakthrough“ - Infektionen
Standardisierte Methoden zur<br />
Resistenzbestimmung<br />
• EUCAST - fermentierende Hefen<br />
• EUCAST – Schimmelpilze (Aspergillus)<br />
• CLSI M27-A2- Makro/Mikrodilution –Hefen<br />
• CLSI M38-A – Mikrodilution/Schimmelpilze<br />
• CLSI M 44-A – Agardiffusion/Hefen<br />
• DIN 58940-84 – Mikrodilution (Hefen)
Resistenztestung von Hefen
Testung von Hefen im Vergleich<br />
Methodenvergleich<br />
M27-A2<br />
EUCAST<br />
DIN 58940-84<br />
Zielgruppe<br />
Hefen<br />
fermentierende Hefen<br />
Hefen<br />
Platte<br />
Microtiter 96 U;<br />
Microtiter 96 F<br />
Microtiter 96 U<br />
Gesamtvolumen<br />
200 µl<br />
200µl<br />
200 µl<br />
Medium<br />
RPMI 1640 +<br />
RPMI 1640 +<br />
HR-Medium*<br />
Amphotericin B:<br />
Amphotericin B:<br />
(+ 0,5 mg /L<br />
Antibiotic medium 3?<br />
Antibiotic medium 3<br />
Methylenblau)<br />
Glucose- Konz.<br />
0,20%<br />
RPMI 2% / AM3 2%<br />
2%<br />
Puffer<br />
MOPS<br />
MOPS<br />
Phosphatpuffer<br />
pH<br />
6,9 – 7,1 (25°C)<br />
7,0 ± 0,2<br />
6,8 – 7,2<br />
Inoculum (Zellen/ml)<br />
0,5 – 2,5x10 3<br />
0,5 – 2,5x10 5 in A.d.<br />
0,5 – 2,5x10 3<br />
Temperatur (°C)<br />
35°C<br />
35°C – 37°C<br />
36°C ± 1 °C<br />
Auswertung nach<br />
46-50 h<br />
24h<br />
18 (24, 48) ± 2 h<br />
C.neoformans<br />
70 – 74 h<br />
entfällt<br />
48 + 72 h<br />
visuell / photometrisch<br />
visuell<br />
photometrisch<br />
visuell<br />
Ablese-Hilfen<br />
80 % Inhibition<br />
Endpunkt : 50% Inhibition<br />
(MIC50%) 5FC + Azole<br />
80 % Inhibition<br />
MIC 80% : AmB<br />
Nach W. Fegeler, 2006<br />
+ mit Glutamin, ohne Bicarbonat<br />
MOPS: 3-N-(morpholino)propanesulfonic acid<br />
HR*. Modifiziert nach<br />
Schmalreck
MHK Breakpoints: Nur für einige<br />
Substanzen etabliert<br />
Substanz<br />
Susceptible<br />
(S)<br />
Susc.-dose<br />
dependent<br />
(S-DD)<br />
Intermediate<br />
(I)<br />
Resistant<br />
(R)<br />
Fluconazol<br />
< 8<br />
16-32<br />
-<br />
> 64<br />
Itraconazol<br />
< 0.125<br />
0.25-0.50<br />
-<br />
> 1<br />
Voriconazol*<br />
< 1<br />
2<br />
> 4<br />
Flucytosin<br />
< 4<br />
-<br />
16-32<br />
> 32<br />
Amphotericin B<br />
?<br />
?<br />
?<br />
?<br />
NCCLS M27-A2, 2002,<br />
reference microdilution method<br />
*Pfaller 2006, JCM 44, 819-826<br />
Ampho MHKs sind in einem engen Bereich verteilt, Detektion resistenter<br />
Stämme ist daher sehr schwierig Antibiotic Medium 3 als mögliche Alternative<br />
(kontraversielle Daten)<br />
Nguyen et al. J Infect Dis 1998; 177: 425 ; Rex et al. AAC 1995; 39: 906<br />
Park et al., AAC 2006, 50; 1287-97
Vergleich EUCAST und CLSI M27-A2<br />
• Internationale Multicenterstudie mit 6 Labors<br />
anhand 71 Candida-Isolaten<br />
• Vergleich von Fluconazol, Itraconazol,<br />
Posaconazol und Voriconazol<br />
• Interlaboratorielle Reproduzierbarkeit<br />
• Einsatz der CLSI-Breakpoints für EUCAST<br />
Espinell-Ingroff et al. 2005, JCM 43, 3884-3889
Übereinstimmung zwischen<br />
EUCAST und CLSI (in Prozent)<br />
Flu<br />
Itra<br />
Vori<br />
Posa<br />
Übereinstimmg.<br />
E-N 24h (%)<br />
95<br />
90<br />
94<br />
91<br />
EUCAST-CLSI<br />
E-N 48h (%)<br />
94<br />
85<br />
92<br />
90<br />
Interlaborat.<br />
EUCAST (%)<br />
95<br />
93<br />
93<br />
92<br />
Übereinst.<br />
CLSI (%)<br />
Übereinstimmung innerhalb 2 Verdünnungsstufen ohne Berücksichtigung der<br />
Interpretation<br />
⇒Beste Übereinstimmung mit Flu und Vori!<br />
⇒24h- Werte besser als 48h!<br />
⇒ 24h –Ablesung für Flu und Vori ev. auch nach CLSI<br />
Espinell-Ingroff et al. 2005, JCM 43, 3884-3889<br />
97<br />
93<br />
95<br />
96
Übereinstimmung zwischen EUCAST und<br />
CLSI nach Breakpoints<br />
Substanz/Methode<br />
S (%)<br />
S-DD (%)<br />
R (%)<br />
Übereinst. (%)<br />
Fluco - CLSI<br />
66<br />
17<br />
17<br />
78,5<br />
Fluco - EUCAST<br />
73<br />
18<br />
8<br />
Itra - CLSI<br />
48<br />
38<br />
14<br />
58,5<br />
Itra - EUCAST<br />
76<br />
18<br />
6<br />
EUCAST: S/SDD;<br />
CLSI: SDD/R<br />
9% (5/58) very major errors bei Flu-resistenten Stämmen (64 µg/ml)<br />
50% (18/36) very major errors bei Vori-resistenten Stämmen ( 4 µg/ml)<br />
Posa Werte mit EUCAST stets niedriger als mit CLSI<br />
Kein Einsatz der CLSI-Breakpoints für EUCAST!<br />
Espinell-Ingroff et al. 2005, JCM 43, 3884-3889
Agardiffusion<br />
• Standard CLSI M44-A – Candida spp.<br />
• Mueller-Hinton-Agar<br />
• + 2% Glucose<br />
• + 0,5 µg/ml Methylenblau<br />
• pH 7,2 – 7,4<br />
• Ablesung nach 24h, ev. 48h<br />
• HHD und Interpretationshilfe für Fluconazol<br />
R<br />
S-DD<br />
S<br />
Fluconazol 25 µg<br />
< 14 mm<br />
15 -18 mm<br />
> 19 mm
Agardiffusion - Voriconazol<br />
• Keine Interpretationshilfe nach M44-A<br />
• Vorschlag nach Pfaller et al. 2005 (JCM 43, 5208-5213)<br />
R<br />
S-DD<br />
S<br />
Voriconazol 1µg<br />
< 13 mm<br />
14 -16 mm<br />
> 17 mm<br />
Voriconazol Mikrodilution*<br />
> 4 µg/ml<br />
2 µg/ml<br />
< 1 µg/ml<br />
*Pfaller et al. 2006; JCM 44, 819-826)<br />
Übereinstimmung: 93,8%<br />
Very major errors: 0,2%<br />
Major errors: 3,4%<br />
Minor errors: (2,6%)<br />
Beste Übereinstimmung bei C. albicans (99,8%);<br />
geringste Übereinstimmung bei C. glabrata, C. tropicalis
Testung der Echinocandine<br />
• Bisher keine standardisierte Testung, keine Breakpoints<br />
• Testung von Caspofungin nach EUCAST und CLSI<br />
verlässlich (Chryssanthou et al. 2002, JCM 40, 3841-44)<br />
• Bevorzugte Testung derzeit nach M27-A2<br />
• QC:C. parapsilosis (ATCC 22019)<br />
C. krusei (ATCC 6258)<br />
• In vitro-Aktivität unabhängig von Fluconazol-Resistenz<br />
sehr gut<br />
Ausnahme: C. parapsilosis, C. guilliermondii
In vitro Empfindlichkeiten -<br />
Caspofungin<br />
• 8197 invasive Candida-Isolate (Blut, steriles Material)<br />
• M27-A2, Endpunktablesung nach 24h<br />
• Gute Aktivität: 99,7% MIC < 1 µg/ml<br />
• MIC > 1µg/ml:<br />
• C. parapsilosis (1%)<br />
• C. guilliermondii (6%)<br />
• C. rugosa (n=2/8)<br />
• C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis,<br />
C. lusitaniae (jeweils 1 Stamm)<br />
Keine Veränderung des Aktivitätsmusters seit Einführung von Caspofungin!<br />
Pfaller et al. 2006, JCM 44, 760-763
In vitro-Aktivität von Micafungin bei<br />
Fluconazol-resistenten Candida-Isolaten<br />
Gute Aktivität von Micafungin<br />
Messer et al. 2006, JCM 44, 324-326
In vitro Empfindlichkeiten -<br />
Anidulafungin<br />
• 2235 invasive Candida-Isolate (Blut, steriles Material)<br />
• 315 Flu-resistente Stämme inkludiert<br />
• M27-A2, Endpunktablesung nach 24h<br />
• Gute Aktivität: 90 % MIC < 1 µg/ml<br />
• C. lusitaniae – geringere Aktivität (0,12-1 µg/ml)<br />
• MIC >1µg/ml:<br />
• C. parapsilosis (61%)<br />
• C. guilliermondii (40%)<br />
• 315 Flu-resistente Candida spp: 99% < 1 µg/ml<br />
Pfaller et al. 2006, JCM 44, 760-763
Resistenztestung von<br />
Schimmelpilzen
Empfindlichkeitstestung<br />
Fadenpilze<br />
Methode<br />
Einsaat<br />
Inokulum<br />
Einstellung des In.<br />
Testmedium<br />
Format<br />
Temperatur<br />
Inkubationsdauer<br />
Endpoint<br />
CLSI M38A<br />
Aspergillus, Fusarium,<br />
Rhizopus, Pseudallescheria,<br />
Sporothrix<br />
0,4 x 10 4 - 5 x 10 4 CFU/ml<br />
Spektrophotometer<br />
RPMI 1640<br />
Mikrodilution<br />
35°C<br />
21 h - 48h – 70h<br />
Kein Wachstum<br />
EUCAST-Aspergillus<br />
Aspergillus spp.<br />
2 - 5 x 10 5 CFU/ml<br />
Hämocytometer<br />
RPMI + 2% Glucose<br />
Mikrodilution<br />
35°C<br />
48h<br />
Kein Wachstum<br />
Stammlösungen, antifungale Substanzen, Verdünnungsreihen, QC identisch<br />
Nach C. Lass-Flörl, 2006
Interlaboratorielle Evaluierung nach<br />
EUCAST<br />
A. fumigatus ATCC 204305<br />
Drug<br />
MIC range<br />
MICs in the range (%)<br />
AmB<br />
ITRA<br />
VORI<br />
POSA<br />
0.25-1.0<br />
0.12-0.50<br />
0.25-1.0<br />
0.03-0.25<br />
100<br />
100<br />
94.4<br />
90.3<br />
A. flavus ATCC 204304<br />
Drug<br />
MIC range<br />
MICs in the range (%)<br />
AmB<br />
ITRA<br />
VORI<br />
POSA<br />
0.50-2.0<br />
0.12-0.50<br />
0.50-2.0<br />
0.12-0.50<br />
97.2<br />
100<br />
91.7<br />
91.7<br />
Lass-Flörl et al., 2006
Offene Punkte und Probleme<br />
• Breakpoints – noch offen<br />
• Vorschlag - Itraconazol: MIC > 8 µg/ml – resistent<br />
MIC < 0,5 µg/ml – empfindlich<br />
• Testung der Echinocandine<br />
• Medium: RPMI vs. Antibiotic Medium 3<br />
• Trailing – Phänomen<br />
• MIC ⇒ MEC (minimum effective concentration)<br />
• Bisher jedoch noch keine klinisch relevanten<br />
Resistenzen beschrieben
Der Labor-Alltag
Anforderungen an<br />
routinetaugliche Testung<br />
• Methode mit guter Reproduzierbarkeit<br />
• Einfache Handhabung<br />
• Rasche Durchführung<br />
• Einfache Ablesung<br />
• Möglichst wenig Einschränkungen<br />
• Breakpoints<br />
Mikrodilution nicht routinetauglich!
Wirkspektrum der Antimykotika<br />
Species<br />
Ampho<br />
Keto<br />
Flu<br />
Itra<br />
Vori<br />
Caspo<br />
albicans<br />
+++<br />
++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
glabrata<br />
++<br />
+<br />
++<br />
++<br />
++<br />
+++<br />
guilliermondii<br />
++<br />
+<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
++<br />
krusei<br />
++<br />
+<br />
0<br />
++<br />
++<br />
+++<br />
lusitaniae<br />
++<br />
++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
parapsilosis<br />
+++<br />
++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
++<br />
tropicalis<br />
+++<br />
++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
+++ reliable activity with occasional resistance<br />
++ moderate activity but resistance is noted<br />
+ occasional activity<br />
0 no meaningful activity<br />
Arikan & Rex. Manual of Clinical Microbiology<br />
2003, 8th ed., 1859
Resistenztestung im klinischen<br />
Alltag<br />
• Screening mit semiquantitativen Methoden<br />
• Blättchentest<br />
• Breakpointtest<br />
• Weiterführende Untersuchungen mit<br />
quantitativen Methoden<br />
• E-Test<br />
• Mikrodilution
Alltag in europäischen Laboratorien<br />
- EFISG Survey<br />
• Routinemäßige Resistenztestung<br />
• 94% aller befragten Labors<br />
• Meistens nur für klinisch relevante Isolate<br />
• Methode:<br />
• 42% E-Test<br />
• 24% Plättchentest nach CLSI<br />
• 4% EUCAST<br />
Bille et al., ECCMID 2006, P737
Empfehlungen für die<br />
Resistenztestung<br />
1. Identifizierung bis zu Genus-, besser noch<br />
Speziesebene<br />
2. Routinemäßige Testung von Fluconazol oder<br />
Flucytosin bei Isolaten aus sterilen<br />
Körperkompartimenten<br />
3. Bei Behandlung von therapieresistenten<br />
invasiven Candida-Infektionen mit<br />
Amphotericin B<br />
4. Spezies mit intrinsischer Resistenz nicht testen<br />
Rex, CID 2002, 35: 982-989
Resistenztestung<br />
Dauerbrenner<br />
oder<br />
alter Hut ?<br />
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!