Dissertation F.Grotelüschen - Universität zu Lübeck

f) γ-Katenin: polyclonaler Ziegen γ-Katenin Antikörper (sc-1497 Santa Cruz
Biotechnology, Inc., USA), Verdünnung 1:200, entspricht einer Endkonzentration von
2 µg/ml.
g) Maus anti Ziegen Brückenantikörper (DAKO, Hamburg, Deutschland).
Für die Verdünnung der Antikörper wurde Antibody Diluent with background reducing
components (DAKO, Hamburg, Deutschland) verwendet.
3.2.2 Färbetechnik
Da es durch die Formalinfixierung zu einer Proteinquervernetzung kommt, war es für die
in dieser Arbeit verwendeten Antikörper notwendig, alle Schnitte nach dem
Entparaffinieren und Rehydrieren für drei Minuten in Zitratpuffer im Dampfdrucktopf zu
kochen. Dadurch wird eine Antigendemaskierung erreicht, das heißt, die durch die
Formalinfixierung verursachte Proteinquervernetzung wird wieder aufgehoben, und die
Antigenepitope der Cadherine und Katenine können durch die Antikörper wieder erkannt
werden. Nach dem Trocknen wurden alle Schnitte für 5 Minuten in Tris-Puffer gespült.
Für die immunhistochemischen Färbungen wurde die Avidin-Biotin-Methode gewählt.
Diese nutzt die starke Affinität des Avidins zum Biotin. Dabei wird ein Avidin-Biotin-
Peroxidase-Komplex verwendet, der über einen biotinylierten Sekundärantikörper an die
Primärantikörper bindet. Die Färbung erfolgte mit AEC (3-Amino-9-Ethyl-Carbazol), das
in Gegenwart von Peroxid durch die an das Avidin gebundene Peroxidase eine rötliche
Farbe annimmt.
Um die endogene Peroxidase zu blockieren, wurden die Schnitte zuvor in 3%
Wasserstoffperoxid für 5 Minuten inkubiert und anschließend wiederum für 5 Minuten in
Tris-Puffer gespült.
Die Färbung erfolgte weitestgehend nach dem von Vector laboratories und BioPrime
vorgeschlagenen Verfahren.:
1. Inkubation mit Normalserum (Bestandteil des Vectastain elite ABC Kit-Peroxidase-
Kits) für 15 Minuten.
15