Lichtblicke in die Nanowelt - Max-Planck-Gesellschaft

FOKUS
Optische HORIZONTE
Lichtblicke in die Nanowelt
Stefan Hell, Direktor
am Max-Planck-Institut
für biophysikalische
Chemie in Göttingen
Das Mikroskop ist 400 Jahre alt – und noch immer nicht ausgereizt. Zwar sollten
die Welleneigenschaften des Lichts seine Leistungsfähigkeit theoretisch begrenzen.
Doch auf dem Weg zu Erkenntnissen müssen Wissenschaftler oftmals Grenzen
überschreiten. Und so hat STEFAN HELL, Direktor am MAX-PLANCK-INSTITUT
FÜR BIOPHYSIKALISCHE CHEMIE in Göttingen, kurzerhand eine neue Technik
erfunden und damit ein weiteres Kapitel der Lichtmikroskopie geschrieben.
Eigentlich war es eine Tatsache,
an der es nichts zu rütteln gab.
Die Auflösung optischer Mikroskope
galt als begrenzt. Objekte, die enger
als 200 Nanometer (Millionstel Millimeter)
beieinander liegen, könnten
nicht unterschieden werden und
würden im Bild immer als ein einziger
verwaschener Fleck erscheinen.
So hatte es Ernst Abbe 1873 erkannt
In die Nanowelt tauchen
Katrin Willig und Stefan Hell ein.
Die Versuchsanordnungen zur
STED-Mikroskopie werden in
mühevoller Handarbeit erstellt.
und als Gesetz formuliert. Und so
steht es auch heute noch in den Optik-Lehrbüchern.
Die Welleneigenschaften
des Lichts geben diese Beugungsgrenze
vor – und seit mehr als
120 Jahren zweifelte niemand an ihrer
Gültigkeit.
Stefan Hell jedoch wollte sich nicht
damit zufrieden geben. Der 41-jährige
Physiker am Max-Planck-Institut
für biophysikalische Chemie in Göttingen
ist während seiner Promotion
Ende der achtziger Jahre auf das Problem
der Auflösungsbegrenzung gestoßen,
und seitdem lässt es ihn nicht
mehr los. Könnte man die Beugungsgrenze
nicht doch durchbrechen und
die Lichtmikroskopie auf die Nanoskala
drücken? Hell brachte erste Gedanken
zu Papier, entwarf physikalische
Konzepte und ließ seine Überlegungen
patentrechtlich schützen.
„Es war Intuition“, sagt der Wissenschaftler
heute. „Ein sicheres Gefühl,
dass das letzte Wort noch nicht
gesprochen und vor allem die Fluoreszenzmikroskopie
noch nicht aus-
gereizt war.“ Im Jahr
1990, als er mit siebenundzwanzig
seine Promotion
abgeschlossen hatte,
wollte er den Sprung ins
Abenteuer wagen. Ginge
es schief, wäre er immer
noch jung genug, um umsatteln zu
können, so sein Gedanke.
Inzwischen hat sich gezeigt: Es ist
nicht schief gegangen. Aus seinen
ersten Gedanken entwickelte Stefan
Hell die 4Pi-Mikroskopie (siehe
Kasten auf Seite 23), mit der er die
Auflösung entlang der Ausbreitungsrichtung
des Lichts um das
Siebenfache verbessert hat.
Drei Jahre darauf formulierte er die
STED-Mikroskopie: das erste physikalisch
schlüssige Konzept zur radikalen
Überwindung der Abbeschen
Grenze. Heute lassen sich beide Methoden
kombinieren. Die kürzlich im
Fachmagazin NATURE BIOTECHNOLOGY
veröffentlichten hoch aufgelösten
3-D-Bilder aus einem STED-4Pi-Fluoreszenzmikroskop
zeigen, dass sein
FOTOS: LAIF-RONALD FROMMANN
Veranschaulichung der Abbeschen
Beugungsgrenze: Aufgrund
der Lichtbeugung mündet
die von einem Objektiv
fokussierte Lichtwelle in einen
Lichtfleck, der entlang der
optischen Achse auseinander
gezogen ist. Nach Abbe nimmt
seine Ausdehnung mit der
Wellenlänge zu und mit zunehmendem
Aperturwinkel ab.
Beim technisch maximal möglichen Winkel von 70 Grad
ist der Lichtfleck (Beugungsmaximum) mindestens 200
Nanometer breit und 500 Nanometer lang (a). Beim 4Pi-
Mikroskop (b) benutzt man zwei Objektive, um den Gesamtwinkel
zu vergrößern. Addiert man die gegeneinander laufenden
Lichtwellen zweier Objektive mittels konstruktiver
Interferenz, erhält man einen etwa vier- bis siebenmal
kleineren zentralen Lichtfleck. Er wird allerdings von zwei
kleineren Seitenmaxima begleitet, deren Auswirkung im
Bild aber mathematisch annulliert werden kann. Der kleinere
zentrale Lichtfleck liefert eine vier- bis siebenmal höhere
Auflösung entlang der Ausbreitungsrichtung des Lichts.
18 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 19

FOKUS
Optische HORIZONTE
FOTOS: DYBA ET AL., NATURE BIOTECHNOLOY, 21, 1347, 2003
Aufnahmen von fluoreszenzmarkierten Mikrotubulinfasern
einer Säugerzelle: Der Vergleich von Standardmikroskopie
(links) und Göttinger STED-4Pi-Mikroskopie
(rechts) zeigt eine 15fach verbesserte Auflösung entlang
der optischen Achse (z). Bei der Standardmikroskopie
handelt es sich um eine moderne Form der Laserraster-Konfokalmikroskopie.
Die Vergleichsbilder wurden
an derselben Stelle der Probe hintereinander aufgenommen.
Die Linie im Bild stammt von einer dünnen Schicht
von Fluoreszenzmolekülen auf dem Deckglas; sie ist
ein Maß für die erzielte Auflösung. Der unmittelbare
Vergleich verdeutlicht den Schärfegewinn.
Durch ein Labyrinth aus Linsen
und Blenden verfolgt Marcus Dyba
den Laserstrahl, mit dessen Hilfe
die Göttinger Wissenschaftler
das Abbesche Gesetz aushebeln.
destens 200 Nanometern in der Breite
und 500 Nanometern in der Länge.
Was aber, wenn die Moleküle –
noch ehe sie zur spontanen Fluoreszenz
kommen – mit einem zweiten
Strahl durch stimulierte Emission
abgeregt und früher als gewöhnlich
zurück in den Grundzustand befördert
werden? Unter der Linse des Mikroskops,
die das spontane Fluoreszenzlicht
auffängt, bliebe es dunkel.
Wenn man aber dafür sorgen könnte,
dass die stimulierte Emission nur die
Moleküle im Randbereich des Fluoreszenzflecks
trifft? Dann, so die
Überlegung von Stefan Hell, würde
man unter der Linse statt des ovalen
einen kleinen runden Brennfleck erhalten
(siehe Bild im Kasten auf
Seite 23). Rastert man mit diesem
kleineren Fluoreszenzfleck die Probe
ab, bekommt man ein schärferes Bild.
STIMULIERTE EMISSION
VERHINDERT FLUORESZENZ
Mit stimulierter Emission werden
bei der STED-Mikroskopie also die
angeregten Farbstoffmoleküle einer
Probe abgeregt, jedenfalls ein Teil
von ihnen. Dies gelingt, indem man
dem kurzwelligen Lichtpuls, mit dem
die Proben-Moleküle angeregt werden,
einen längerwelligeren Abrege-
Lichtpuls (STED-Puls) folgen lässt –
zeitlich so abgestimmt, dass sich die
Moleküle noch im angeregten Zustand
befinden. Die Wellenlänge dieses
Pulses entspricht der Energiedifferenz
zwischen dem angeregten
und dem Grundzustand. Räumlich
betrachtet ist dieser zweite Lichtpuls
ringförmig um den Anregungsfokus
angeordnet, sodass der Bereich in
der Mitte des Rings von der Abregung
verschont bleibt. Damit gilt: je
Göttinger Team aus Physikern, Chemikern,
Biologen und Ingenieuren
tatsächlich das Tor zur Nanowelt
aufgestoßen hat.
STED (engl. Stimulated Emission
Depletion) bedeutet „stimulierte
Emissions-Löschung“. Albert Einstein
hatte bereits 1917 vorhergesagt,
dass stimulierte Emission eine
Möglichkeit des Lichts ist, mit Materie
in Wechselwirkung zu treten.
Wenn ein Photon auf Materie trifft
und sich die Moleküle im Grundzustand
befinden, wird ein Molekül in
einen angeregten Zustand überführt.
Befindet sich jedoch ein Molekül
schon im angeregten Zustand,
„merkt“ dies das Photon, wenn es
angeflogen kommt. In dem Fall
nimmt es die Energie des Moleküls
in Form eines zweiten identischen
Photons mit. Das Molekül wird dabei
zurück in den Grundzustand gezwungen,
gleichsam „abgeregt“. Die
stimulierte Emission ist heute das
Grundprinzip des Lasers; bei ihm
werden mit STED Photonen angereichert.
Stefan Hell hat jedoch erkannt,
dass man den Effekt auch
nutzen kann, um im Fluoreszenzmikroskop
den Brennfleck zu verkleinern.
Die Methoden aus Göttingen
zielen daher auf die Fluoreszenzmikroskopie,
die in der biomedizinischen
Grundlagenforschung die
wichtigste Mikroskopieform ist. Eine
mit Fluoreszenzmolekülen markierte
Probe wird dabei mit Laserlicht einer
bestimmten Wellenlänge bestrahlt.
Die Moleküle absorbieren das Licht
und geraten vom Grundzustand in
einen angeregten Energiezustand.
Normalerweise fallen sie spontan in
den Grundzustand zurück und senden
dabei Fluoreszenzlicht aus, welches
etwas längerwelliger ist als das
Anregungslicht. Nach dem Abbeschen
Beugungsgesetz entsteht mit
der herkömmlichen Optik jedoch ein
langgezogener Brennfleck von min-
20 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
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FOKUS
Optische HORIZONTE
kleiner das Loch in der Mitte, desto
kleiner der Fluoreszenzfleck (siehe
Bild im Kasten auf Seite 23).
Natürlich unterliegt auch der
STED-Puls der Abbeschen Beugungsgrenze
und bildet ebenfalls einen
langgestreckten Fokus. Das heißt,
man kann ihm kein beliebig kleines
Loch verpassen. Den Ausweg hat Stefan
Hell jedoch sofort erkannt: Er
liegt in dem nichtlinearen Zusammenhang
zwischen Abregung und
Intensität des Pulses. „Je intensiver
der STED-Puls ist, desto besser regt
er ab“, sagt Hell. „Überschreitet die
Intensität eine gewisse Schwelle, hat
das Molekül kaum eine Chance,
spontan zu fluoreszieren. Man sagt,
die Abregung ist gesättigt. Wird die
Intensität weiter gesteigert, nimmt
der von der Abregung betroffene Bereich
immer weiter zu – die fluoreszierende
Region wird immer weiter
eingeschnürt“.
Das ist laut Hell der eigentliche
Trick des Verfahrens: „Je mehr man
die Sättigungsschwelle überschrei-
tet, desto kleiner wird der Fluoreszenzfleck
und umso besser kann
man auflösen“. Abbes Gesetz ist damit
ausgehebelt. Der Faktor, um den
man die Sättigungsschwelle überschreitet,
bestimmt die Auflösung;
diese hängt jetzt nicht mehr von der
Wellenlänge des verwendeten Lichts
ab. Stefan Hell hat berechnet, dass
die Auflösung mit der Wurzel des
Sättigungsfaktors zunimmt. Überschreitet
man die Schwelle um das
Neunfache, so verdreifacht sich die
Auflösung. Überschreitet man sie
um das Hundertfache, ist der Gewinn
verzehnfacht.
„Die Beugung des Lichts verschwindet
natürlich nicht, aber sie
ist nicht mehr die Grenze“, sagt der
Erfinder der neuen Technik. Ohne
physikalische Gesetze zu verletzen,
könne man nun einen Fluoreszenzfleck
von der Größenordnung eines
Moleküls erzeugen und damit Auflösungen
bis hinunter zur molekularen
Skala erreichen. Man braucht
dazu jedoch Fluoreszenzmoleküle,
die eine möglichst niedrige Abregungsschwelle
haben. Beliebig hoch
kann man die Intensität des STED-
Pulses nämlich nicht wählen, da
zu intensives Licht den Molekülen
schaden würde.
AUF DER SUCHE NACH
DER NEUEN GRENZE
Hinter Kabeln
und Haltern versteckt:
das erste
4Pi-Mikroskop,
das wie ein richtiges
Mikroskop
aussieht, wurde
von Max-Planck-
Forschern in Kooperation
mit der
Firma Leica Microsystems
entwickelt.
Der Physiker Jörg
Bewersdorf und
die Biologin Tanja
Rosenmund bereiten
gerade eine
Probe vor.
Die Abregungsschwelle hängt von
den Eigenschaften des Moleküls und
der verwendeten Abregungs-Wellenlänge
ab. Das Team um Stefan Hell –
seit Oktober 2002 ist er Leiter der
neu gegründeten Abteilung „Nano-
Biophotonik“ am Göttinger Max-
Planck-Institut – sucht jetzt nach
den tatsächlichen Grenzen. Die Wissenschaftler
testen alle Farbstoffe;
organische wie anorganische kommen
infrage, aber auch von der Zelle
selbst erzeugte Proteine. Dazu muss
man die Wellenlänge des Lichts variieren
und die chemische Umgebung
(zum Beispiel den pH-Wert) verändern.
„Wir haben einen Faden gefunden.
Nun schauen wir, bei welcher
Auflösung er endet“, beschreibt
Hell die Situation.
„Noch handelt es sich um Grundlagenforschung“,
meint der Physiker.
„Wir haben gezeigt, dass die STED-
Mikroskopie funktioniert und sich
die zu Grunde liegende physikalische
Idee experimentell bestätigen lässt.
Jetzt wollen wir herausfinden, wie
gut das Prinzip mit der Palette vorhandener
fluoreszierender Moleküle
zu realisieren ist.“ Auch über Alternativen
zu STED denkt Hell bereits
nach. Statt die Randmoleküle gezielt
aus dem angeregten Energiezustand
abzuregen, sei es beispielsweise
denkbar, sie schon vor der eigentlichen
Fluoreszenzanregung aus
dem Grundzustand zu entfernen. In
Betracht ziehen die Forscher außerdem
die lichtinduzierte Umlagerung
von Atomgruppen innerhalb der
Moleküle, welche die Fluoreszenz
ein- und ausschalten.
Besonders aufmerksam verfolgen
Biologen die Göttinger Entwicklungen.
Die Lichtmikroskopie ist für sie
nämlich die einzige Möglichkeit, das
Innere lebender Zellen zu beobachten.
Elektronen- und Rasterkraftmikroskopie
erreichen zwar die gewünschte
Auflösung. Aber sie arbeiten
unter Bedingungen (Vakuum
oder tiefe Temperaturen), unter denen
jede lebende Zelle stirbt. Und
mit Rastersondenmikroskopen kann
man ohnehin nur Oberflächen abtasten.
Die optische Mikroskopie war jedoch
aufgrund der Beugungsgrenze
in ihrer Anwendung bislang begrenzt.
Würden Stefan Hells Methoden
den Sprung in die breite Anwendung
schaffen, wäre das neben dem
schon erzielten physikalischen Durchbruch
ein echter Gewinn auch für die
Biologie. „Am Anfang“ erinnert er
sich, „wollte kaum jemand daran
glauben. Aber jetzt ist klar: Die Vision
der lichtoptischen Nanoskopie hat
eine echte Chance.“ INA HELMS
DIE 4PI-MIKROSKOPIE
Schon mit dieser Methode gelang es, die optische Auflösung von den
vorher möglichen 500 Nanometern auf 70 bis 140 Nanometer entlang
der optischen Achse zu verbessern. Zwar blieb die Abbesche Beugungsgrenze
noch unangetastet, doch mit der 4Pi-Idee hatte Stefan Hell
Anfang der neunziger Jahre erstmals gezeigt, dass die Lichtmikroskopie
noch lange nicht am Ende ist. Doch selbst als er die Theorie der Methode
schlüssig bewiesen hatte, glaubte zunächst kaum jemand, dass sie in der
Praxis umsetzbar sei. Dennoch entwickelten die Göttinger Max-Planck-
Forscher die 4Pi-Mikroskopie unbeirrt weiter. Den letzten Beweis hat
Alexander Egner erbracht: Während seiner Promotionsarbeit gewann
er hoch auflösende 3-D-Bilder, welche die Verteilung von Proteinen im
so genannten Golgi-Apparat zeigen – das sind Zellorganellen, in denen
Proteine sortiert und verzuckert werden (siehe Foto rechts). Außerdem
haben die Göttinger Forscher in Kooperation mit der Firma Leica Microsystems
Heidelberg ein 4Pi-Mikroskop in einer physikalisch besonders
leistungsfähigen Form realisiert. Statt eines einzigen Objektivs, so der
Grundgedanke der 4Pi-Mikroskopie, verwendet man zwei Objektive, die gegeneinander gerichtet sind.
Die Lichtwellen beider Objektive werden so überlagert, dass sie im Fokuspunkt ihr Feld verstärken (konstruktive
Interferenz). Auf diese Weise simuliert man eine beinahe kugelförmige Lichtwelle, die fast aus
allen Richtungen auf den Fokuspunkt zuläuft. Der volle Raumwinkel von 4Pi wird dadurch viel besser abgedeckt.
Aus dem ovalen Brennfleck wird ein schmalerer, fast runder Fokus. Allerdings entstehen oberund
unterhalb des Brennpunkts noch zwei kleinere Brennflecken. Diese ausreichend klein zu halten, war
die größte Herausforderung bei der Entwicklung der Methode. Es galt, physikalische Bedingungen zu finden,
unter denen die Intensität der beiden Satelliten mindestens kleiner als 50 Prozent des Hauptbrennflecks
ist. Dann nämlich kann man ihre Auswirkung auf das Bild wegrechnen. Gelungen ist dies mithilfe
der Zwei-Photonen-Anregung (siehe den Beitrag „Mikroskopie im optischen Schnitt“, Seite 34 ff.), die
jedoch nur eine erste pragmatische Lösung sein soll. Denn bei dieser Art der Anregung ist eine zusätzliche
Laserquelle erforderlich, und man muss mit gepulster Strahlung arbeiten. In Zukunft, so die Vorstellungen
in Göttingen, soll die 4Pi-Mikroskopie auch ohne Zwei-Photonen-Anregung auskommen und damit leichter
handhabbar werden. Die Göttinger Forscher sind jedenfalls überzeugt, dass es sich lohnt, das Auflösungsproblem
systematisch und von mehreren Seiten anzugehen. Unabhängige Ansätze wie die STED- und die
4Pi-Mikroskopie könnten dann kombiniert werden und würden sich gegenseitig verstärken.
DIE STED-MIKROSKOPIE
Der entscheidende Bestandteil der STED-Mikroskopie ist die Sättigung der Molekül-Abregung durch stimulierte
Emission. Ein Lichtpuls (STED), unmittelbar nach der Fluoreszenzanregung losgeschickt, zwingt die
Moleküle vom angeregten Energiezustand zurück in den Grundzustand (a). Wenn sich Anregungs- und Abregungspuls
geschickt überlagern (c), werden die Moleküle abgeregt, die sich im Randbereich des Brennflecks
befinden – noch ehe sie dazu kommen, spontan zu fluoreszieren. Insgesamt nimmt die spontane
Fluoreszenz eines Moleküls mit steigender Intensität des STED-Pulses ab (b). Wird eine bestimmte Schwelle
überschritten, kann die Fluoreszenz fast vollkommen unterbunden werden. Der grüne Brennfleck, der ohne
STED-Puls entsteht, schnürt sich mit zunehmender Intensität des Abregungspulses immer mehr ein. Das
Ergebnis: ein fokaler Fleck, der deutlich kleiner ist als der von der Beugung limitierte Abbesche Fleck (d).
(a)
(b)
(c)
(d)
DATEN AUS KLAR ET ETAL, PNAS, 97, 2000
AUFNAHMEN: MPI FÜR BIOPHYSIKALISCHE CHEMIE
22 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 23

FOKUS
Optische HORIZONTE
Neuland in drei Dim ensionen
Im Inneren der Zelle herrscht Gedrängel, die verschiedenen Proteinstrukturen
schwimmen keineswegs ungehindert umher. Woher die Forscher
das wissen? Aus den sensationellen dreidimensionalen Aufnahmen
lebender Zellen. Die „Fotografen“: Wissenschaftler um WOLFGANG
BAUMEISTER, Direktor am MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR BIOCHEMIE
in Martinsried. Das Verfahren: die Kryo-Elektronentomographie.
„Zellkino“: Drei unterschiedliche
makromolekulare
Proteinkomplexe,
die Wissenschaftler mit
der Kryo-Elektronentomographie
innerhalb einer
Zelle lokalisiert haben.
Selbst in den Naturwissenschaften
halten sich manche Legenden
über Jahrzehnte hinweg und länger.
Mehr als 300 Jahre lang glaubte man
beispielsweise, jede lebende Zelle enthalte
in der Hauptsache Wasser, in der
vereinzelte Partikel treiben. Dass dies
nicht so ist, ahnte man zwar schon
seit längerem, und vor etwa 20 Jahren
hat man erkannt, dass sehr viele
Makromoleküle das Zellinnere bevölkern.
Aber erst die Aufsehen erregenden
Darstellungen der Martinsrieder
Wissenschaftler schufen Klarheit –
nach mehr als zehnjähriger Forschungs-
und Entwicklungsarbeit auf
dem Gebiet der zellulären Kryo-Elektronentomographie.
Trotzdem war die Idee, diese Methode
auf mikroskopisch kleine lebende
Objekte wie Zellen zu übertragen,
reichlich verwegen, und das hat
mehrere Gründe. Erstens: Zellen sind
einen bis wenige Mikrometer groß,
die Dimension ihrer inneren Strukturen
bewegt sich aber im Nanometerbereich;
deshalb ist eine Abbildungsmethode
mit hoher optischer Auflösung
notwendig. Elektronenstrahlen,
wie man sie im Elektronenmikroskop
verwendet, sind hier geeignet. Zweitens:
Die Durchleuchtung mit Elektronenstrahlen
geschieht im Hochvakuum,
und in diesem kann keine
Zelle überleben – sie würde sofort
platzen, ihre Flüssigkeit verdampfen.
bis 5000 Elektronen auf einer Fläche
von einem Quadrat-Nanometer die
obere Grenze bilden – lächerlich wenig,
wenn man diese Zahl auch noch
auf Hunderte von Bildern verteilen
muss. Gleichzeitig benötigt aber die
Tomographie viele Einzelaufnahmen.
Je mehr verschiedene Projektionen
eines Objekts der Computer kombiniert,
desto höher ist die erreichbare
Auflösung, desto „schärfer“ werden
die 3-D-Bilder. Viele Aufnahmen bedeuten
jedoch auch eine hohe Strahlenbelastung.
Die Idee, Elektronentomographie
für wissenschaftliche Zwecke zu betreiben,
ist schon 35 Jahre alt. Im
Jahr 1968 veröffentlichten drei For-
Architektur des Herpes simplex
Virus 1: Links ein mikroskopisches
Bild, in der Mitte
das rekonstruierte und entrauschte
Tomogramm, rechts
die gesonderte Darstellung der
Hauptbestandteile des Virus.
FOTOS: PNAS USA 97, 14245-14250 (2000) UND PNAS USA 99, 14153-14158 (2002)
FOTOS: SCIENCE 302, 1396-1398 (2003)
Das Prinzip gleicht dem der Computertomographie,
die inzwischen in
allen großen Kliniken gang und gäbe
ist und es erlaubt, Schichtbilder vom
Inneren des Menschen herzustellen.
Dazu umkreisen eine Röntgenquelle
und eine Kamera den Patienten. Die
Kamera nimmt dabei Röntgenbilder
aus vielen Winkeln auf, die anschließend
im Computer miteinander
kombiniert werden. So errechnen
sich schließlich dreidimensionale
Bilder, auf denen sich die inneren
Organe zeigen. Das Verfahren ist
heute technisch ziemlich ausgereift
und liefert zuverlässige Einblicke in
den menschlichen Körper.
Dies ist auch der Grund, warum man
unter dem Elektronenmikroskop von
jeher getrocknete Präparate betrachtet
hatte, die meist in Kunststoff eingebettet
oder mit Schwermetallen fixiert
und gefärbt waren.
ZU VIELE ELEKTRONEN
SIND DER ZELLE TOD
Außerdem hält das fragile Gebilde
einer lebenden Zelle energiereiche
Strahlung wie etwa Elektronen nur
sehr begrenzt aus. Wird die Bestrahlungszeit
und damit die Dosis zu
hoch, „verkohlt“ die Zelle und ist für
eine weitere Untersuchung verloren.
Die Erfahrung hat gezeigt, dass 2000
schergruppen erste prinzipielle Studien
dazu, die jedoch wegen der damals
verwendeten Technik in ihrer
Anwendbarkeit äußerst limitiert waren.
Erst im Laufe der neunziger Jahre
hatten sich die Geräte- und vor allem
die Computertechnik und Informatik
so weit entwickelt, dass man
allmählich an einen Einsatz für Auflösungen
im Nanometerbereich auch
bei intakten Zellen denken konnte.
„Wahrscheinlich führen beim heutigen
Stand des Wissens neue Methoden
und Techniken häufiger zu
Erkenntnisfortschritten als neue Hypothesen“,
sagt Wolfgang Baumeister,
der seit 1988 als Direktor am
24 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 25

FOKUS
Optische HORIZONTE
Max-Planck-Institut für Biochemie
die treibende Kraft des Tomographieprojekts
ist. „Das steht in einem sonderbaren
Kontrast zu der verhältnismäßig
geringen Wertschätzung, die
der methodisch orientierten Forschung
zuteil wird.“ Es gab sogar
Diskussionen darüber, ob die Entwicklung
eines bildgebenden Verfahrens
überhaupt Aufgabe der Max-
Planck-Gesellschaft sei – oder ob
nicht vielmehr die Industrie solche
Tomographen entwickeln und herstellen
müsse. Der Biophysiker gibt
hierauf eine klare Antwort: „Wenn
die Industrie nicht willens ist, dieses
Risiko einzugehen und uns diejenigen
Instrumente zur Verfügung zu
stellen, die wir für unsere wissenschaftlichen
Fragestellungen brauchen,
dann müssen wir sie eben
selbst produzieren.“ Man tat dies allerdings
in enger Kooperation mit
einschlägigen Firmen.
„vakuumfähig“ zu machen und die
Zellen in ihrem natürlichen Zustand
zu bewahren, wird es schockgefroren.
Dazu bringt man es blitzschnell in eine
Flüssigkeit von minus 196 Grad
Celsius. Die Zellen kühlen so rasch
ab, dass die Wassermoleküle in ihnen
und um sie herum keine Zeit haben,
Eiskristalle zu bilden. So bleiben die
feinen Strukturen intakt – viele Zellen
könnten sogar nach dem Auftauen
weiterleben. Das Präparat befestigt
man nun auf einem speziellen Probenhalter,
der es mit flüssigem Stickstoff
kühlt, damit die Probe während
der Untersuchung nicht auftauen
kann. Da seit einiger Zeit bekannt ist,
dass Zellen der Strahlung umso besser
standhalten, je kälter sie sind, beginnen
die Martinsrieder Forscher
neuerdings damit, die Proben noch
weit unter die Stickstofftemperatur zu
kühlen. Man benutzt dazu flüssiges
Helium von minus 269 Grad.
Gruppen beschäftigen sich mittlerweile
mit der Elektronentomographie.
Konkurrenz belebt natürlich das
Geschäft, doch noch haben wir einen
Wissensvorsprung.“
PARALLELRECHNER
„ENTSCHLEIERT“ DIE BILDER
Im Gegensatz zur Computertomographie
in der Klinik ist es bei der
Elektronentomographie nicht sinnvoll,
das Mikroskop rund um das Objekt
zu führen. Hier wird die Zelle
gedreht, während die „Lichtquelle“,
also die Quelle der Elektronenstrahlen,
an ihrem Platz bleibt. Das klingt
einfach, ist aber in der Praxis mit einer
Reihe von Problemen verbunden.
So verschiebt sich bei jedem Kippschritt
das Gesichtsfeld ein wenig –
der Elektronenstrahl muss deshalb
neu ausgerichtet und wieder genau
auf das Objekt fokussiert werden.
Würde man dies von Hand machen,
FOTOS: BIOPHYSICAL JOURNAL 72, 1031-1042 (1998) UND JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY 138, 105-113 (2002)
wäre die Zelle unter dem Elektronenbeschuss
schon nach den ersten Bildern
verkohlt.
Die Martinsrieder nehmen eine
höchst empfindliche CCD-Kamera
und den Computer zu Hilfe. Er wertet
bei jedem Schritt das registrierte Bild
aus, positioniert die Zelle wieder exakt
und fokussiert auf die richtige
Stelle – alles automatisch. Und während
der ganzen Zeit wird der Elektronenstrahl
zur Seite abgelenkt und
kann deshalb das Objekt nicht schädigen.
„Auf diese Weise gelingt es
uns, rund 97 Prozent der Strahlendosis
für das Aufnehmen der Bilder zu
verwenden“, sagt Harald Engelhardt,
„nur drei Prozent benötigen wir für
die Einstellung des Mikroskops.“
Eine weitere Schwierigkeit: Die
Probe lässt sich nicht aus allen Richtungen
durchleuchten; ein gewisser
Winkel wird immer durch den Probenhalter
verdeckt. Diese Daten fehlen
später bei der Rekonstruktion der
Bilder zum 3-D-Objekt. Neuerdings
versuchen die Forscher, diese Informationslücke
dadurch zu verringern,
dass sie die Probe in einem eigens
konstruierten Dreh-Kipphalter nach
einer Bilderserie um 90 Grad drehen
und dann eine zweite Sequenz aufnehmen.
Sind die Bilder erst einmal im Kasten,
sprich Computer, beginnt die
zeitaufwändige Verarbeitung der Daten.
Aufgrund der extrem geringen
Dosis sind die Einzelbilder sehr verrauscht
– oft erkennt das menschliche
Auge darauf nur schemenhafte
Schleier. Die Aufgabe der Martinsrieder
Bildverarbeiter um Reiner Hegerl
ist es nun, diese Schleier zu lüften
und die Bilder so zu kombinieren
und aufzubereiten, dass man aus der
Datenflut Objekte herausfiltern kann,
die sich klar von der Umgebung abgrenzen
lassen. „Man muss die relesellschaft
in Garching sowie eine
Reihe leistungsfähiger Workstations
im Institut.
Ist das räumliche Bild der Zelle
erst einmal bestimmt und erscheint
auf dem Computerbildschirm, geht
es darum, das Gewirr in ihrem Inneren
zu gliedern und in fassbare
Strukturen einzuteilen – Segmentieren
nennen das die Fachleute. Oft
scheitert diese Methode jedoch daran,
dass in der übervölkerten Zelle
viele Proteinkomplexe zu eng aneinander
liegen. Der Computer kann
dann nicht mehr erkennen, wo der
eine aufhört und der nächste anfängt.
Welche Enzyme in einer Zelle
arbeiten, ist zum großen Teil bekannt,
und soweit man deren räumliche
Struktur mit physikalischen
Methoden – etwa der Röntgenstrukturanalyse
oder der Elektronenmikroskopie
– ermittelt hat, kennt man
auch ihre Form. Diese Kenntnis wol-
Die Entwicklung der zellulären
Kryo-Elektronentomographie war eine
Sisyphusarbeit: Hatten die Forscher
ein Problem gelöst, so tauchte
meist gleich das nächste auf. Trotzdem
ließ sich Baumeisters Team, das
unter anderem aus Biologen, Chemikern,
Physikern und Informatikern
besteht, nicht entmutigen. Und so
entstand ein Verfahren, das die neuesten
technologischen Erkenntnisse
und Fortschritte kombiniert.
Zunächst gibt man die Lösung mit
den Zellen, die man betrachten will,
auf ein feines Netzchen, das so konstruiert
ist, dass die Zellen nicht
durchrutschen, trotzdem aber durch
die Maschen hindurch sichtbar bleiben.
Um das empfindliche Objekt
In elegantem Hellgrau präsentiert
sich die neueste Errungenschaft des
Instituts: Das heliumgekühlte Transmissions-Elektronenmikroskop
namens
„Polara“ steht in einem Bunker
des eigens für die Elektronenmikroskopie
errichteten Neubaus, der gegen
Erschütterungen und elektromagnetische
Felder von außen gut abgeschirmt
ist. Unspektakulär sieht es
aus, und für mehrere Millionen Euro
kann jeder so ein Gerät kaufen. Dass
gerade die Forscher rund um Wolfgang
Baumeister derart aufregende
Bilder damit machen können, liegt
an ihrer umfassenden Erfahrung.
„Das Gebiet ist heute für viele Wissenschaftler
attraktiv“, sagt Jürgen
M. Plitzko, „und eine Reihe von
„Schnappschüsse“ aus
einem zellulären Tomogramm
nach 3-dimensionaler
Bildanalyse eines
vollständig in Eis eingebetteten
Archaebakteriums
(Pyrodictium abyssi):
Sichtbar sind die regelmäßig
geformte Oberflächenschicht
(hellblau),
eine Gruppe von Vesikeln
(dunkelblau) und
ein „Röhrchen“ (ebenfalls
dunkelblau). Außerdem
erkennt man verschiedene
an die Vesikel
angelagerte Proteinkomplexe
(weiß).
Trotzdem ist es noch eine Herkulesarbeit
für den Computer, diese
Komplexe im Inneren der Zelle auszumachen.
Es ist das alte Problem,
das Informatiker mit dem „Blick in
einen Werkzeugkasten“ umschreiben:
Der Mensch ist intuitiv in der
Lage, auf einen Blick zum Beispiel
einen Schraubenschlüssel aus der
Fülle anderer Werkzeuge herauszufinden.
Der Rechner kann das nicht.
Er muss mühsam das Bild des Werk-
„Polara“, ein
Transmissionselektronenmikroskop
der neuesten
Generation,
ermöglicht neben
der herkömmlichen
Stickstoffauch
Heliumkühlung.
Am Max-
Planck-Institut
für Biochemie
wird dieses Gerät
seit Anfang 2003
zur Aufzeichnung
von Kippserien für
die Tomographie
verwendet.
FOTO: MPI FÜR BIOCHEMIE
vanten Daten erkennen und vom
überlagernden Rauschen befreien“,
schildert Harald Engelhardt das Vorgehen,
„wir erproben zur Zeit unterschiedliche
Verfahren. Die Astronomen
haben übrigens ähnliche Probleme,
wenn sie winzige Lichtsignale
aus dem Rauschen des Nachthimmels
herausfiltern wollen.“
Gigabyte von Informationen müssen
bei dieser Aufgabe transportiert,
durchforstet und gegeneinander verrechnet
werden. Noch vor wenigen
Jahren wären die Computer an dieser
gigantischen Aufgabe gescheitert.
Erst heute stehen potente Parallelrechner
zur Verfügung, etwa ein Linux-Cluster
in Martinsried, das Rechenzentrum
der Max-Planck-Gelen
die Martinsrieder Forscher nutzen,
um die Muster bestimmter Molekülkomplexe
in den 3-D-Datensätzen
zu finden.
DER COMPUTER
MUSS ALLES ERTASTEN
26 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 27

FOKUS
Optische HORIZONTE
zeugkastens abtasten und mit dem
vorgegebenen Schema des Schraubenschlüssels
vergleichen. Dabei variiert
er nicht nur die Position des
gesuchten Werkzeugs, sondern auch
noch dessen Drehwinkel. Auch wenn
Computer schnell sind, dauert diese
Aufgabe mit ihren unzähligen
Schritten meist sehr lang.
AUF DIE GESAMTSCHAU
KOMMT ES AN
Noch schlimmer ist es bei der Analyse
des Zellinneren, denn hier kann
jede Struktur beliebig in drei Raumrichtungen
gedreht sein. So dauert es
Stunden und Tage, bevor der Rechner
einen 3-D-Datensatz analysiert
und entsprechende Formen lokalisiert
hat, die er dann zur besseren
Unterscheidung farbig markiert. Dass
diese Methode funktioniert, haben
die Forscher an künstlich hergestellten
„Phantomzellen“ getestet, die sie
die sich nur mithilfe nicht invasiver
Methoden untersuchen lässt“.
So erarbeiteten die Forscher beispielsweise
das detaillierte Bild einer
Amöbenzelle: Es zeigt das Skelett
aus Aktinsträngen, die in unterschiedlichen
Winkeln miteinander
und mit der Zellmembran verknüpft
sind. Außerdem erkennt man viele
größere makromolekulare Komplexe,
beispielsweise Ribosomen, die im
Gegensatz dazu eher kugelig geformt
sind. Zu ihrer Überraschung entdeckten
die Wissenschaftler ferner
bei genauer Analyse der Bilder, dass
ein neuartiges „Teilchen“ häufig auftrat:
Es hat eine tassenförmige Gestalt
mit fünf abgerundeten Ecken
und einen Durchmesser von rund 20
Nanometern. Bisher weiß man nicht,
wozu es dient. Aber derartige Entdeckungen
können der funktionellen
Erforschung des Proteoms wertvolle
Anstöße geben.
Es geht also bei solchen Aufnahmen
nicht einfach um „schöne Bilder“,
die man auf Konferenzen vorzeigen
oder in Fachmagazinen publizieren
kann. Viel wichtiger ist der Erkenntnisfortschritt,
der sich aus der
räumlichen Anordnung der Proteine
in einer lebenden Zelle ableiten lässt.
„Ein Bakterium beispielsweise ist
nicht einfach ein Sack voller Enzyme“,
erklärt der Biologe Harald Engelhardt.
„Die Anordnung der Enzyme
gibt uns Auskunft über die chemischen
Vorgänge in der Zelle. Man
kann davon ausgehen, dass die Proteinmoleküle,
die zu einer Stoffwechselkette
gehören, jeweils auch lokal
konzentriert sind.“ Das gilt etwa für
die Synthese von Fettsäuren – eine
zyklische Reaktion, an der sieben
Proteine mitwirken. Einen entsprechenden
Komplex von Enzymen
kann man tatsächlich isolieren. Aber
die spannende Frage ist, ob sich auch
Bereichen arbeiten die Forscher am
Max-Planck-Institut für Biochemie
daran, diesen Wert noch einmal halbieren
zu können.
MIT „SALAMI-TAKTIK“
AN DICKE ZELLEN
Und noch ein anderes Ziel haben
sie sich gesetzt: Viele Zellen sind für
die Durchstrahlung mit Elektronen
einfach zu dick. Um sie der Elektronentomographie
zugänglich zu machen,
wollen die Spezialisten sie erst
einfrieren und den Eisblock dann in
dünne Scheiben schneiden, deren 3-
D-Bilder einen Blick in die Zelle gestatten.
So hoffen die Wissenschaftler,
immer weiter in die Geheimnisse
der Strukturen so unterschiedlicher
Zellen wie Bakterien oder Neuronen
einzudringen und dabei aufregendes
Neuland zu betreten.
Denn dies ist letztlich – so bekennt
Wolfgang Baumeister – der Antrieb
solutions for:
● Video Enhanced Contrast Microscopy
● Near Infrared Imaging
● Fluorescence Detection
● Luminescence Detection
● High Resolution Imaging
● Macroscopic Imaging
● Imaging Systems
● Automated Microscopic Imaging Systems
● Time Resolved Spectroscopy
mit verschiedenen, aber strukturell
ähnlichen Proteinmolekülen gefüllt
hatten.
Gerade die enge Packung der Proteine,
die so viele Probleme bereitet,
erregt aber auch das besondere Interesse
der Martinsrieder Forscher.
„Nicht die Rekonstruktion isolierter
Moleküle ist unser eigentliches Ziel,
sondern vielmehr, solche Strukturen
im Kontext der Zelle anzuschauen“,
sagt Wolfgang Baumeister. „Denn
wir sind davon überzeugt, dass es in
der Zelle jenseits des einzelnen Moleküls
eine übergeordnete Organisation
gibt, eine Organisation in Form
einzelner ‚molekularer Maschinen’,
Kryo-elektronentomographische
Abbildungen einer
in Eis eingebetteten Amöbenzelle
(Dictyostelium discoideum):
Links die Aufnahme
aus einer tomographischen
Kippserie, in der Mitte der
Schnitt durch ein dreidimensional
rekonstruiertes Tomogramm.
Das rechte Bild zeigt
die gesonderte Darstellung
des Aktin-Zytoskeletts (rot),
der Membran (blau) und
zytoplasmatischer makromolekularer
Komplexe wie
Ribosomen (grün).
FOTOS: SCIENCE 298, 1209-1213 (2002)
andere Komplexe mit der Elektronentomographie
entdecken lassen, die
sich nur in ihrer natürlichen Umgebung
bilden und dort stabil sind.
Das Elektronentomogramm einer
Zelle ist ein Abbild ihres gesamten
Proteoms, das man prinzipiell nach
den verschiedensten Molekülkomplexen
absuchen kann, soweit die
Erkennbarkeit und Auflösung der rekonstruierten
Strukturen dies zulässt.
Die Detail-Auflösung in 3-D, die
man bislang erreichen konnte, liegt
etwa bei vier Nanometern und ist
bisher nur für das Auffinden größerer
Proteinkomplexe geeignet. Durch
viele kleine Verbesserungen in allen
FOTOS: TRENDS IN CELL BIOLOGY. 9(2):81-85 (1999)
eines jeden Grundlagenforschers.
David M. Blow, einer der Pioniere
der Röntgenstrukturforschung, beschrieb
das Gefühl einst mit den
Worten: „Von Zeit zu Zeit kommt
fast jeder Wissenschafter an einen
Ort, an dem vor ihm noch nie ein
Mensch gewesen ist. Es ist begeisternd,
sich dort aufzuhalten. Dabei
mag es sich um einen Kontinent oder
einen winzigen Flecken handeln,
aber (...) selbst wenn die Welt unsere
Entdeckung ignoriert, vergessen wir
niemals, dass sie einmal ausschließlich
uns gehört hat. Das sind die Erinnerungen,
die wir im Alter in Ehren
halten werden.“ BRIGITTE RÖTHLEIN
Das Prinzip eines jeden
tomographischen Verfahrens:
Man nimmt ein
Objekt aus verschiedenen
Richtungen auf und gewinnt
damit eine Serie
von „Projektionen“, aus
denen der Computer
dann die dreidimensionale
Struktur des betreffenden
Objekts errechnet.
Luminescence Detection
AEQUORIA – HPD-LIS
System for Luminescence with Single Photon
Sensitivity
Recording of Luminscence Kinetics with a Temporal
Resolution

FOKUS
Optische HORIZONTE
Mit Elektronen sieht man besser
Moderne Werkstoffe wären ohne Elektronenmikroskopie nicht denkbar. Nur mithilfe kurzwelliger
Elektronenstrahlen können die Wissenschaftler Einblicke in atomare Prozesse gewinnen
und so direkt verfolgen, was in Kristallgittern beim Abkühlen oder Erhitzen, Stauchen oder
Dehnen, Biegen oder Brechen einer Materialprobe vor sich geht. Eine Gruppe um MANFRED
RÜHLE, Direktor am Stuttgarter MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR METALLFORSCHUNG,
hat den „Durchblick“ und dringt mit ihren Instrumenten in die atomare Welt vor.
Die Erfolgsgeschichte der Elektronenmikroskopie
begann am
25. September 1933. Dem 26-jährigen
Physiker Ernst Ruska, der wenige
Wochen zuvor an der TH Berlin
mit einer Arbeit über „magnetische
Linsen“ promoviert worden war, gelang
es damals, mit einem selbst gebastelten
Elektronenmikroskop einen
hauchdünnen verkohlten Baumwollfaden
in 8000facher Vergrößerung
abzubilden. Damit konnte er erstmals
die hohe Überlegenheit eines
Elektronenmikroskops gegenüber
den – bestenfalls 2000fach vergrößernden
– Lichtmikroskopen zeigen.
Ernst Ruska, der von 1955 bis zu seinem
Tod im Jahr 1988 als Wissen-
Durchbruch, nämlich am 25. September
2003, nahm das amerikanische
Wissenschaftsmagazin SCIENCE eine
Arbeit zur Veröffentlichung an, die
vom Stuttgarter Max-Planck-Institut
für Metallforschung eingereicht worden
war. Das Paper, für das Zaoli
Zhang, Wilfried Sigle, Fritz Phillipp
und Manfred Rühle verantwortlich
zeichnen, trägt den Titel „Direct
Atom-Resolved Imaging of Oxides
and Their Grain Boundaries“ und
wurde in der Ausgabe vom 31. Oktober
abgedruckt. Die Autoren berichten
darin, dass es ihnen gelungen ist,
mit einem Hochspannungs-Höchstauflösungsmikroskop
detaillierte Einblicke
in die atomare Struktur der
scher Materialien ganz wesentlich
durch die Anwesenheit von Sauerstoff
bestimmt werden. Dabei spielen
Korngrenzen – Grenzflächen zwischen
Kristallbereichen unterschiedlicher
Orientierung – eine besondere
Rolle. Denn an derartigen „Kristallbaufehlern“
weicht die Konzentration
des Sauerstoffs unter Umständen
deutlich von der im ungestörten Gitter
ab. Dadurch können sich die
Korngrenzen aufladen und die Bewegung
elektrischer Ladungen im Material
behindern. Die Stuttgarter Forscher
konnten erstmals zeigen, dass
sich die Konzentration des Sauerstoffs
auch in der Nähe solcher Kristallbaufehler
direkt abbilden lässt.
Aufnahmen eines Hochleistungswerkstoffs
aus Si 3 N 4 -Körnern, der mit einer
Aluminiumlegierung infiltriert wurde.
Das Schwarz-Weiß-Bild zeigt die Kornstruktur
des Materials, das farbige die mit dem
ESI-Verfahren gewonnene elektronenspektroskopische
Aufnahme, bei der dem Silizium
die (Falsch)-Farbe Rot, dem Stickstoff das
Grün und dem Sauerstoff einer oxidischen
Substanz das Blau zugeordnet wurde.
Zu den „jüngsten“ Elektronenmikroskopen am Stuttgarter Max-Planck-Institut
zählt das EM 912. Sein Filtersystem lässt sich so einstellen, dass jeweils nur die
an einem bestimmten chemischen Element gestreuten Elektronen zur Abbildung
beitragen. Mit diesem „Electron Spectroscopic Imaging“-Verfahren (ESI) kann
man die räumliche Verteilung der Elemente ermitteln.
FOTO: WOLFGANG FILSER
FOTOS: MPI FÜR METALLFORSCHUNG
schaftliches Mitglied dem Fritz-Haber-Institut
der Max-Planck-Gesellschaft
in Berlin angehörte, wurde
1986 „für seine fundamentalen Arbeiten
zur Elektronenoptik und für
den Entwurf des ersten Elektronenmikroskops“
mit dem Nobelpreis für
Physik ausgezeichnet – gemeinsam
mit Heinrich Rohrer und Gerd Binnig,
den Erfindern des Raster-Tunnelmikroskops.
Zufällig genau 70 Jahre nach dem
Oxidkeramik Strontiumtitanat (SrTiO 3 )
zu gewinnen. Auf den Aufnahmen
sind selbst die leichten und deshalb
Elektronen nur schwach streuenden
Sauerstoffatome zu erkennen, deren
Kontraste sonst meist von denen
schwererer und damit stärker streuender
Atome überdeckt werden.
Die Messung der lokalen Sauerstoffkonzentration
mit atomarer Auflösung
ist von großem Interesse, da
die elektrischen Eigenschaften oxidi-
Die Untersuchungen erfolgten an
dem größten Elektronenmikroskop,
das den Stuttgarter Wissenschaftlern
zur Verfügung steht – und das zu
den leistungsfähigsten weltweit gehört:
dem Hochspannungs-Höchstauflösungsmikroskop
JEM-ARM
1250 mit einer Beschleunigungsspannung
für Elektronen von 1250
Kilovolt und einer Punktauflösung
von 0,12 Nanometern (millionstel
Millimeter). Dass man damit in ato-
30 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 31

FOKUS
MODELLIERTE WIRKLICHKEIT
Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops – der Abstand zweier Punkte, die gerade noch als getrennt
zu erkennen sind – ist begrenzt durch die Wellenlänge der abbildenden Strahlen. Beim Lichtmikroskop
liegt dieser Abstand je nach Lichtwellenlänge zwischen 400 und 200 Nanometern. Elektronenmikroskope
verwenden statt Licht Elektronenstrahlen und statt Linsen elektrische oder magnetische Felder. Den
Elektronen lassen sich Wellen zuordnen, deren Wellenlänge von der Beschleunigungsspannung abhängt.
Bei 1000 Kilovolt beträgt sie etwa 0,004 Nanometer – rund ein Hunderttausendstel der Wellenlänge des
sichtbaren Lichts. Allerdings treten bei Elektronenmikroskopen stärkere Linsenfehler auf als bei Lichtmikroskopen.
Sie begrenzen das Auflösungsvermögen auf einen Wert, der etwa dem Hundertfachen dieser
Wellenlänge entspricht. Doch auch damit liegt man schon im Bereich atomarer Dimensionen.
Wegen dieser Linsenfehler ist allerdings eine direkte, „naive“ Interpretation der mit einem Hochspannungs-Elektronenmikroskop
gewonnenen Bilder nicht möglich. Jede Aufnahme wird deshalb mit simulierten
Bildern verglichen, die unter Berücksichtigung der Mikroskop-Parameter für eine physikalisch
sinnvolle Modellkonfiguration berechnet wurden. Diese Modellkonfiguration verändert man am Computer
so lange, bis experimentell beobachtetes und simuliertes Bild übereinstimmen, die modellierte
Atomanordnung also der wirklichen entspricht.
MICHAEL GLOBIG
mare Dimensionen vordringen kann,
deutet bereits das Kürzel ARM an: Es
steht für „Atomic Resolution Microscop“.
Mit seinen Hochspannungsgeneratoren
erreicht die gigantische
Anlage eine Höhe von insgesamt
acht Metern (drei Meter davon misst
allein die Mikroskopsäule), und ihr
Gewicht beträgt 35 Tonnen. Das
Anordnung der Atome im
Strontiumtitanat. Links unten
sind die drei Atomarten
dargestellt, rechts das mit
Hilfe der Computersimulation
erzeugte Bild. Gewonnen
wurden die Aufnahmen mit
dem größten Elektronenmikroskop
am Institut –
dem ARM 1250 (rechts).
ganze Mikroskop ruht erschütterungsfrei
auf einem 235 Tonnen
schweren Schwingfundament. Dem
wissenschaftlichen Betrieb übergeben
wurde das von der japanischen
Firma JEOL (Japanese Electron Optics
Laboratory) gebaute und in
Stuttgart-Büsnau installierte Elektronenmikroskop
im Frühjahr 1994.
Im Jahr 1968 war zum ersten Mal
ein Hochspannungs-Elektronenmikroskop
in Stuttgart in Betrieb ge-
32 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
nommen worden – das von der japanischen
Firma Hitachi gebaute (und
damals als erstes kommerzielles
Gerät außerhalb Japans installierte)
HU 500 mit 500 Kilovolt Spannung.
Es wurde 1987 abgebaut, um Platz
für eine neue Mikroskopgeneration
zu schaffen. Ein „Dinosaurier“ aber
steht noch immer im Max-Planck-
FOTO: MPI FÜR METALLFORSCHUNG
Institut und wird nach wie vor intensiv
genutzt: das im Jahr 1974 in Betrieb
gegangene AEI EM7. Seine Beschleunigungsspannung
lässt sich
zwischen 100 und maximal 1200 Kilovolt
variieren; um das Gerät zu
schonen, ist die Höchstspannung allerdings
auf 1000 Kilovolt begrenzt
worden. Dieses Mikroskop wurde im
Institut so umgebaut und mit speziellen
Probenhaltern ausgerüstet, dass
man damit bei Temperaturen zwi-
schen minus 255 Grad und plus
1600 Grad Celsius Direktmessungen
an unterschiedlichsten Materialien
vornehmen kann. Außerdem ist es
möglich, die Proben während der
Messung mechanisch zu verformen.
„HEISSE SZENEN“INS
BILD GESETZT
Auf diese Weise haben die Wissenschaftler
unter anderem das Verformungsverhalten
von stark aufgeheizten
Nickel-Aluminium- und Eisen-Aluminium-Hochtemperaturlegierungen
aufgeklärt. Für die technische
Anwendung solcher Materialien
ist es wichtig, dass sie sich unter anhaltender
Belastung möglichst wenig
plastisch verformen, insbesondere
bei hoher Temperatur. Beim Verformen
setzen sich Versetzungen im
Kristallgitter in Bewegung. Durch
Einlagern mikroskopischer Oxidteilchen
lässt sich diese Bewegung ver-
hindern. Solche Experimente zeigen,
welche atomaren Prozesse dabei ablaufen,
das heißt, wie die Versetzungen
mit den eingelagerten Oxidpartikeln
wechselwirken. Diese Erkenntnisse
bilden eine wichtige Basis für
die Entwicklung geordneter Hochtemperaturlegierungen.
Einen ganz anderen Mikroskoptyp
verkörpert das dritte Beispiel aus
dem Arsenal der insgesamt neun
Elektronenmikroskope des Max-
FOTO: WOLFGANG FILSER
FOTO: WOLFGANG FILSER
Optische HORIZONTE
Planck-Instituts für Metallforschung.
Es handelt sich um das erste ausgelieferte
Gerät des Ende der achtziger
Jahre des 20. Jahrhunderts entwickelten
EM 912 von Zeiss/LEO, das
mit einer Beschleunigungsspannung
von 120 Kilovolt arbeitet. Es besitzt
einen so genannten Omega-Filter,
der aus vier trickreich angeordneten
Magneten besteht und die Elektronen
nach ihren Energien sortiert. Bei
den Untersuchungen wird die Probe
zum Beispiel mit einem feinen, möglichst
monochromatischen Elektronenstrahl
abgerastert – die Magneten
lenken dann die an der Probe gestreuten
Elektronen, die unterschiedliche
Energieverluste erlitten und dadurch
unterschiedliche Geschwindigkeiten
angenommen haben, auf verschiedene
Bahnen. Aus den dabei
gewonnenen Informationen lassen
sich Aussagen über Bindungsenergien
und -zustände gewinnen.
Oder man wählt mit dem Filter
Energiebereiche aus, die für bestimmte
chemische Elemente charakteristisch
sind und beleuchtet die
Probe mit parallelen Elektronenstrahlen.
Mit diesem Verfahren, „Electron
Spectroscopic Imaging“ (ESI) genannt,
ist es möglich, sich schnell
ein Bild von der räumlichen Verteilung
der Elemente innerhalb einer
Probe zu machen. MICHAEL GLOBIG
Bereits im Jahr
1974 ging das
AEI EM7 in Betrieb.
Dieses Instrument
nutzen die Forscher
noch immer zur
Untersuchung von
Proben, die während
der Messung
erhitzt und verformt
werden.
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4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 33

FOKUS
Optische HORIZONTE
Mikroskopie im op tischen Schnitt
Klassische optische Mikroskope erreichten bereits vor hundert Jahren ihre größtmögliche
Auflösung. Im 20. Jahrhundert wurden diese wichtigen Instrumente dann in vielfältiger
Weise weiterentwickelt. WINFRIED DENK, heute Direktor am MAX-PLANCK-INSTITUT
FÜR MEDIZINISCHE FORSCHUNG in Heidelberg, hat ein Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskop
erfunden, das es unter anderem ermöglicht, Transportvorgänge im Innern von
Zellen oder die neuronale Aktivität in der Netzhaut im Detail zu studieren.
Eine lebende Netzhaut, aufgenommen
mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop.
Das Gewebe ist
grün gefärbt, während einzelne
Interneurone rot erscheinen.
FOTOS: MPI FÜR MEDIZINISCHE FORSCHUNG – EULER
Was wären die Naturwissenschaften
ohne das Mikroskop?
Ende des 16. Jahrhunderts von holländischen
Brillenmachern erfunden,
trat es einen Siegeszug quer durch
alle Forschungsdisziplinen an. Insbesondere
die Biologie hat von der
wunderbaren Fähigkeit, Strukturen
und Vorgänge an lebendem Gewebe
studieren zu können, enorm profitiert.
Nachdem Ernst Abbe 1873 die
erste exakte Theorie der mikroskopischen
Abbildung auf der Grundlage
der Beugung aufgestellt und Carl
Zeiss seine qualitativ hochwertigen
Mikroskop-Objektive gefertigt hatte,
war diese Technik auf einem vorläufigen
Höhepunkt angelangt. Im 20.
Jahrhundert folgte eine Spezialisierung
der Instrumente, mit denen sich
in jüngster Zeit sogar die von Abbe
ermittelte maximale Auflösung noch
unterbieten ließ.
Die herkömmliche Lichtmikroskopie
stößt rasch an ihre Grenzen, sobald
man beispielsweise Vorgänge
im Innern eines Gewebes untersuchen
will. Ursache hierfür ist die
vielfache Streuung und Brechung
des Lichts an den unterschiedlich
dichten Strukturen. Dieser Vorgang
verringert das Auflösungsvermögen
und den Kontrast. Eine Lösung des
Problems bietet die so genannte konfokale
Mikroskopie: Bei dieser bereits
1961 erfundenen Methode richtet
man einen Laserstrahl auf einen
Punkt des zu untersuchenden Objekts.
Nur das von dort reflektierte
Licht wird dann vom Detektor des
Mikroskops aufgefangen. Alles Licht
aus der Umgebung des beleuchteten
Flecks wird durch eine Blende mit
einem feinen Loch in der Mitte weitgehend
abgelenkt, wodurch sich
Streulicht vermeiden lässt.
Im Unterschied zum konventionellen
Mikroskop erzeugt das konfokale
Mikroskop also zunächst nur einen
Bildpunkt. Um ein Objekt vollständig
abzubilden, muss man dieses Punkt
für Punkt rastern oder scannen. Bei
den meisten modernen Konfokalmikroskopen
führt man hierzu den Laserstrahl
über das Objekt. Das Bild
entsteht dann durch digitale Verarbeitung
im Rechner. Diese Laserscanning-Konfokalmikroskopie
ließ
sich erst Ende der achtziger Jahre
des 20. Jahrhunderts mit dem Aufkommen
geeigneter Laser und digitaler
Datenverarbeitungsmethoden
realisieren.
MIT ROTEM LICHT
ZU BLAUEM LEUCHTEN
Das Ausblenden von Bereichen,
die außerhalb der Fokusebene liegen,
führt zu einem „optischen Schnitt“.
Er ermöglicht es, in ein Gewebevolumen
hineinzusehen, ohne es tatsächlich
zerschneiden zu müssen. Deshalb
ist diese Methode auch auf lebendes
Gewebe anwendbar. Die Moleküle
im Fokus des Laserstrahls
nehmen dessen Licht auf, werden
durch diese Energieaufnahme angeregt
und strahlen nun selbst Licht ab.
Diesen Vorgang nennt man Fluoreszenz.
Bei dickeren Präparaten kann
in einem konfokalen Mikroskop oft
nur die Fluoreszenz eines kleinen
Bruchteils aller angeregten Moleküle
verwendet werden, da die Blende die
Lichtausbeute beschränkt. Das ist ein
Nachteil, denn „dieser verschwenderische
Umgang hat zur Folge, dass
das ganze Präparat ausbleicht und
photochemisch geschädigt wird, obwohl
Information nur von einer
dünnen Schicht gewonnen wird“, erklärt
Winfried Denk.
Eine grundlegende Eigenschaft der
Fluoreszenz besteht nun darin, dass
das eingestrahlte Licht mindestens
genauso energiereich sein muss wie
das vom Molekül wieder abgegebene.
Es ist also nicht möglich, ein blau
fluoreszierendes Molekül (hohe Energie)
mit rotem Licht (geringe Energie)
anzuregen. Wünschenswert aus Sicht
des Mikroskopikers ist es aber, Licht
mit möglichst geringer Energie einzustrahlen,
weil sich damit die Gefahr
von Schäden am Gewebe verringert.
Den Ausweg aus dieser Zwickmühle
fand Winfried Denk in einem
Vorgang, den Physiker Zwei-Photonen-Absorption
nennen. Dieses Phänomen
tritt erst bei sehr hohen
Lichtintensitäten auf. Dann nämlich
kann ein Molekül zwei Photonen fast
gleichzeitig verschlucken und dabei
die doppelte Energie aufnehmen.
Dieser Vorgang basiert auf der quantenphysikalischen
Vorstellung, wonach
Licht auch ein Strom von Teilchen
(Photonen) ist.
Die deutsche Physikerin Maria
Goeppert-Mayer hat diesen Prozess
schon 1931 theoretisch vorhergesagt,
doch erst 30 Jahre später ließ er sich
erstmals experimentell nachweisen.
Warum das so ist, veranschaulicht ein
Beispiel: In hellem Sonnenlicht
nimmt ein Molekül des Farbstoffs
Rhodamin-B etwa ein Photon pro Sekunde
auf. Die Zwei-Photonen-Absorption
würde statistisch gesehen
nur alle zehn Millionen Jahre eintreten.
Erst bei sehr hohen Intensitäten,
wie sie in einem Laserstrahl herrschen,
schluckt ein solches Molekül
auch einmal zwei Photonen und gibt
anschließend ein Photon mit der doppelten
Energie ab. Nur so ist es möglich,
ein Molekül mit rotem Licht zu
blauem Leuchten anzuregen. Und da
rotes Licht energieärmer ist, wird das
Vor allem neuronale
Netzwerke werden
unter dem Zwei-
Photonen-Mikroskop
„durchschaubar“.
Gewebe geschont. Das
Entscheidende dabei:
Nur jene Moleküle werden
angeregt, die sich
im Fokus des Laserstrahls
befinden, wo
die Intensität besonders hoch ist.
„Das Präparat außerhalb der Fokusebene
bleibt von Anregung und damit
von Ausbleichen fast völlig verschont
– was besonders dann wichtig
ist, wenn durch sukzessives Abbilden
übereinander liegender Schichten ein
Volumenbild aufgenommen werden
soll“, sagt Denk. Was außerdem für
seine Methode spricht: Rotes (langwelliges)
Licht wird in Gewebe nicht
so stark gestreut wie blaues (kurzwelliges)
– was die Abbildung tiefer
liegender Gewebeschichten erlaubt.
Ein Hauptanwendungsgebiet der
Zwei-Photonen-Mikroskopie ist die
Neurobiologie: Die Zellen sind untereinander
vernetzt und streuen das
Licht stark. Hier hat die Methode
völlig neuartige Einblicke in das intakte
Gewebe ermöglicht. Zum Beispiel
gelang es Denk, biochemische
Abläufe in den Gehirnzellen von
Ratten sichtbar zu machen. Hierzu
wurden intrazelluläre Botenstoffe
zunächst mit bestimmten Molekülen
„markiert“. Dann wurde die Wellenlänge
des abtastenden Laserstrahls
genau so eingestellt, dass er nur diese
Markermoleküle anregte; nur sie
sandten Fluoreszenzlicht aus, das
sich im Mikroskop nachweisen ließ.
Auf diese Weise zeigten sich Veränderungen
in der Konzentration der
Botenstoffe, woraus die Forscher auf
die Arbeitsweise und die Kommunikation
der Zellen schließen konnten.
Ebenso war es möglich, die Verteilung
von Rezeptoren auf lebenden
Zellen zu charakterisieren. Selbst tief
in der intakten Gehirnrinde gelingt
es mit Denks Methode, noch Signale
in den feinsten Verästelungen von
Nervenzellen nachzuweisen.
34 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 35

FOKUS
Vergleich eines Konfokalmikroskops (links) mit
einem Zwei-Photonen-Mikroskop (rechts). In beiden
Geräten wird das Anregungslicht (von links
kommend) von einem Laser erzeugt und über einen
halbdurchlässigen Spiegel und eine Objektivlinse
in die Probe fokussiert. Das dort entstehende Fluoreszenzlicht
gelangt auf einen Photodetektor.
Beim konfokalen Mikroskop blockt eine Blende
Fluoreszenzlicht ab, das nicht aus der Fokusebene
stammt. Beim Zwei-Photonen-Mikroskop ist keine
Blende nötig; hier nutzt man die Tatsache, dass die
Energie, die zur Anregung eines Farbstoffmoleküls
benötigt wird, statt von einem energiereichen Photon
von zwei Photonen kommt. Fluoreszenz entsteht
nur im Fokus, wo die Photonendichte für diesen
Prozess ausreichend hoch ist. Da keine Fluoreszenz
außerhalb des Fokus entsteht, kann man das gesamte
Fluoreszenzlicht aus der Probe verwenden.
Darüber hinaus erlaubt das Verfahren
sogar, die Zwei-Photonen-
Mikroskopie mit einem Infrarot-Laser
zu betreiben. Das hat einen
großen Vorteil bei der Untersuchung
der Signalverarbeitung in der Netzhaut
(Retina) des Auges. Da die
lichtempfindlichen Zellen in der Retina
– die Photorezeptoren – kein Infrarotlicht
„sehen“, werden sie auch
nicht geblendet. Dies hat es ermöglicht,
die neuronale Aktivität in den
informationsverarbeitenden Schichten
der Netzhaut zu studieren. Erst
kürzlich erzielte Denks Mitarbeiter
Thomas Euler zusammen mit Kollegen
von der University of Washington
bedeutende Fortschritte bei der
Erforschung neurophysiologischer
Vorgänge in der Retina (MAXPLANCK-
FORSCHUNG 3/2002, S. 12).
Die Retina besteht aus mehreren
Schichten und enthält mehr als 60
verschiedene Typen von Nervenzellen.
In der äußersten Schicht befinden
sich die Photorezeptoren, die
GRAFIKEN: MPI FÜR MEDIZINISCHE FORSCHUNG
Licht in elektrische Signale umwandeln.
So genannte Bipolarzellen leiten
die Signale dann von den Photorezeptoren
in die innere Retina. Hier
sind die Fortsätze verschiedener Typen
von Neuronen zu komplexen
„Schaltkreisen“ verknüpft. Schließlich
werden die Signale an die Ausgangsneurone
(Ganglienzellen) weitergeleitet,
wo sie in eine Folge von
elektrischen Signalen umkodiert und
über den optischen Nerv ans Gehirn
gesendet werden.
GANGLIENZELLEN SIND AUF
MUSTER GEPRÄGT
Viele Ganglienzelltypen reagieren
am besten auf komplexe Lichtmuster.
So gibt es Zellen, die Linien oder
Kanten erkennen. Andere Zellen
antworten fast ausschließlich, wenn
sich ein Lichtstimulus in einer bestimmten
Richtung durch ihr empfindliches
Feld bewegt, und wiederum
andere Zellen kodieren Helligkeits-
oder Farbinformationen. Die
Ganglienzellen besitzen eine komplizierte
räumliche Struktur und
feine Verästelungen (Dendriten),
können in verschiedene Schichten
der inneren Retina vordringen und
die Signale unterschiedlicher „Schaltkreise“
anzapfen. Eulers Gruppe gelang
es mithilfe der Zwei-Photonen-
Mikroskopie, die lokalen Ereignisse
in den Dendriten unterschiedlicher
Zelltypen in der Retina sichtbar
zu machen. Auf diese Weise lässt
sich eine Menge über die informa-
tionsverarbeitenden Mechanismen
erfahren.
Bedeutende Fortschritte erwarten
die Heidelberger Forscher auch von
einer miniaturisierten Variante ihres
Mikroskops. „Wir zielen dabei direkt
auf die Neurowissenschaften ab“,
sagt Fritjof Helmchen, der als Gruppenleiter
in der Abteilung des Nobelpreisträgers
Bert Sakmann am Heidelberger
Max-Planck-Institut arbeitet.
Große Hoffnungen setzen die
Wissenschaftler auf neuartige stabförmige
Linsen mit nicht einmal einem
Millimeter Durchmesser. Mit
diesen Optiken sollte es zukünftig
möglich sein, auch an lebenden Tieren
im Labor Messungen vorzunehmen
und längerfristige Veränderungen
im Gehirn zu untersuchen.
Zuvor gilt es aber, einige technische
Hürden zu überwinden. So wird
das Laserlicht über Glasfasern in die
Optik geleitet. Voraussetzung für das
Funktionieren der Zwei-Photonen-
Mikroskopie sind kurze Laserpulse
in rascher Folge. Im Innern der
Glasfasern werden die Pulse jedoch
auseinander gezogen und gleichsam
verschmiert. „Wir glauben aber, dass
wir auch diese Problem durch den
Einsatz neuer Glasfaserarten in den
Griff bekommen“, hofft Helmchen.
Dann wird eine Stoßrichtung der
Forschung die Bildung von Eiweißablagerungen
sein, die für viele
neurodegenerative Krankheiten, wie
etwa der Alzheimerschen, typisch
sind.
THOMAS BÜHRKE
Eine lebende Netzhaut, aufgenommen mit einem Zwei-Photonen-
Mikroskop. Ganglienzellen erscheinen in Magenta, der Bereich, in dem
Bipolarzellen zusammenwirken, ist Rot bis Grün gefärbt.
FOTOS: MPI FÜR MEDIZINISCHE FORSCHUNG/EULER
Pate gesucht!
Seit September bietet der Verlag Spektrum der Wissenschaft – unter der Schirmherrschaft
der Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie sowie des Max-Planck-
Instituts für Astronomie – Oberstufenklassen in den naturwissenschaftlich-mathematischen
Fächern hochwertige, an aktueller internationaler Forschung orientierte
Zusatzmaterialien zur Ergänzung des Lernstoffes – und dies kostenlos für die Schulen.
Die Aktion umfasst den kostenlosen Bezug der Zeitschriften Spektrum der Wissenschaft
sowie Sterne und Weltraum. Jeweils ein Thema pro Ausgabe wird durch
erfahrene Schulbuchredakteure des PAETEC-Verlags didaktisch aufbereitet und
Schülern sowie Lehrern im Internet zur Verfügung gestellt. Finanziert wird die
Kampagne jeweils zur Hälfte vom Verlag sowie von Sponsoren aus der Wirtschaft.
Die Resonanz in den Schulen auf dieses Angebot ist überwältigend hoch:
mehr als 5.000 Schüler haben sich bereits für eine Teilnahme angemeldet.
Ermöglichen auch Sie Schülern
die Teilnahme an einem praxisnahen
Unterricht und werden Sie Pate!
Diese Firmen haben bereits die Patenschaft für eine oder mehrere Schulklassen übernommen:
Biotronik GmbH . Evotec . Harald Meyer Brandschutz . Vermessungsbüro Reinhard Brenke
Stiebel Eltron . Henkel KgaA . GWU GmbH . Aventis . Frankfurter Buchmesse
Buchhandlung Bindernagel . Merck KgaA . IVO Industrievereinigung Odenwald
Maschinenfabrik Rheinhausen . CEMA AG
Ausführliche Informationen finden Sie im Internet: www.wissenschaft-schulen.de
Wir schicken Ihnen gerne ausführliche Informationen zu.
36 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH
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