Lichtblicke in die Nanowelt - Max-Planck-Gesellschaft

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FOKUS Optische HORIZONTE Neuland in drei Dim ensionen Im Inneren der Zelle herrscht Gedrängel, die verschiedenen Proteinstrukturen schwimmen keineswegs ungehindert umher. Woher die Forscher das wissen? Aus den sensationellen dreidimensionalen Aufnahmen lebender Zellen. Die „Fotografen“: Wissenschaftler um WOLFGANG BAUMEISTER, Direktor am MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR BIOCHEMIE in Martinsried. Das Verfahren: die Kryo-Elektronentomographie. „Zellkino“: Drei unterschiedliche makromolekulare Proteinkomplexe, die Wissenschaftler mit der Kryo-Elektronentomographie innerhalb einer Zelle lokalisiert haben. Selbst in den Naturwissenschaften halten sich manche Legenden über Jahrzehnte hinweg und länger. Mehr als 300 Jahre lang glaubte man beispielsweise, jede lebende Zelle enthalte in der Hauptsache Wasser, in der vereinzelte Partikel treiben. Dass dies nicht so ist, ahnte man zwar schon seit längerem, und vor etwa 20 Jahren hat man erkannt, dass sehr viele Makromoleküle das Zellinnere bevölkern. Aber erst die Aufsehen erregenden Darstellungen der Martinsrieder Wissenschaftler schufen Klarheit – nach mehr als zehnjähriger Forschungs- und Entwicklungsarbeit auf dem Gebiet der zellulären Kryo-Elektronentomographie. Trotzdem war die Idee, diese Methode auf mikroskopisch kleine lebende Objekte wie Zellen zu übertragen, reichlich verwegen, und das hat mehrere Gründe. Erstens: Zellen sind einen bis wenige Mikrometer groß, die Dimension ihrer inneren Strukturen bewegt sich aber im Nanometerbereich; deshalb ist eine Abbildungsmethode mit hoher optischer Auflösung notwendig. Elektronenstrahlen, wie man sie im Elektronenmikroskop verwendet, sind hier geeignet. Zweitens: Die Durchleuchtung mit Elektronenstrahlen geschieht im Hochvakuum, und in diesem kann keine Zelle überleben – sie würde sofort platzen, ihre Flüssigkeit verdampfen. bis 5000 Elektronen auf einer Fläche von einem Quadrat-Nanometer die obere Grenze bilden – lächerlich wenig, wenn man diese Zahl auch noch auf Hunderte von Bildern verteilen muss. Gleichzeitig benötigt aber die Tomographie viele Einzelaufnahmen. Je mehr verschiedene Projektionen eines Objekts der Computer kombiniert, desto höher ist die erreichbare Auflösung, desto „schärfer“ werden die 3-D-Bilder. Viele Aufnahmen bedeuten jedoch auch eine hohe Strahlenbelastung. Die Idee, Elektronentomographie für wissenschaftliche Zwecke zu betreiben, ist schon 35 Jahre alt. Im Jahr 1968 veröffentlichten drei For- Architektur des Herpes simplex Virus 1: Links ein mikroskopisches Bild, in der Mitte das rekonstruierte und entrauschte Tomogramm, rechts die gesonderte Darstellung der Hauptbestandteile des Virus. FOTOS: PNAS USA 97, 14245-14250 (2000) UND PNAS USA 99, 14153-14158 (2002) FOTOS: SCIENCE 302, 1396-1398 (2003) Das Prinzip gleicht dem der Computertomographie, die inzwischen in allen großen Kliniken gang und gäbe ist und es erlaubt, Schichtbilder vom Inneren des Menschen herzustellen. Dazu umkreisen eine Röntgenquelle und eine Kamera den Patienten. Die Kamera nimmt dabei Röntgenbilder aus vielen Winkeln auf, die anschließend im Computer miteinander kombiniert werden. So errechnen sich schließlich dreidimensionale Bilder, auf denen sich die inneren Organe zeigen. Das Verfahren ist heute technisch ziemlich ausgereift und liefert zuverlässige Einblicke in den menschlichen Körper. Dies ist auch der Grund, warum man unter dem Elektronenmikroskop von jeher getrocknete Präparate betrachtet hatte, die meist in Kunststoff eingebettet oder mit Schwermetallen fixiert und gefärbt waren. ZU VIELE ELEKTRONEN SIND DER ZELLE TOD Außerdem hält das fragile Gebilde einer lebenden Zelle energiereiche Strahlung wie etwa Elektronen nur sehr begrenzt aus. Wird die Bestrahlungszeit und damit die Dosis zu hoch, „verkohlt“ die Zelle und ist für eine weitere Untersuchung verloren. Die Erfahrung hat gezeigt, dass 2000 schergruppen erste prinzipielle Studien dazu, die jedoch wegen der damals verwendeten Technik in ihrer Anwendbarkeit äußerst limitiert waren. Erst im Laufe der neunziger Jahre hatten sich die Geräte- und vor allem die Computertechnik und Informatik so weit entwickelt, dass man allmählich an einen Einsatz für Auflösungen im Nanometerbereich auch bei intakten Zellen denken konnte. „Wahrscheinlich führen beim heutigen Stand des Wissens neue Methoden und Techniken häufiger zu Erkenntnisfortschritten als neue Hypothesen“, sagt Wolfgang Baumeister, der seit 1988 als Direktor am 24 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003 4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 25
FOKUS Optische HORIZONTE Max-Planck-Institut für Biochemie die treibende Kraft des Tomographieprojekts ist. „Das steht in einem sonderbaren Kontrast zu der verhältnismäßig geringen Wertschätzung, die der methodisch orientierten Forschung zuteil wird.“ Es gab sogar Diskussionen darüber, ob die Entwicklung eines bildgebenden Verfahrens überhaupt Aufgabe der Max- Planck-Gesellschaft sei – oder ob nicht vielmehr die Industrie solche Tomographen entwickeln und herstellen müsse. Der Biophysiker gibt hierauf eine klare Antwort: „Wenn die Industrie nicht willens ist, dieses Risiko einzugehen und uns diejenigen Instrumente zur Verfügung zu stellen, die wir für unsere wissenschaftlichen Fragestellungen brauchen, dann müssen wir sie eben selbst produzieren.“ Man tat dies allerdings in enger Kooperation mit einschlägigen Firmen. „vakuumfähig“ zu machen und die Zellen in ihrem natürlichen Zustand zu bewahren, wird es schockgefroren. Dazu bringt man es blitzschnell in eine Flüssigkeit von minus 196 Grad Celsius. Die Zellen kühlen so rasch ab, dass die Wassermoleküle in ihnen und um sie herum keine Zeit haben, Eiskristalle zu bilden. So bleiben die feinen Strukturen intakt – viele Zellen könnten sogar nach dem Auftauen weiterleben. Das Präparat befestigt man nun auf einem speziellen Probenhalter, der es mit flüssigem Stickstoff kühlt, damit die Probe während der Untersuchung nicht auftauen kann. Da seit einiger Zeit bekannt ist, dass Zellen der Strahlung umso besser standhalten, je kälter sie sind, beginnen die Martinsrieder Forscher neuerdings damit, die Proben noch weit unter die Stickstofftemperatur zu kühlen. Man benutzt dazu flüssiges Helium von minus 269 Grad. Gruppen beschäftigen sich mittlerweile mit der Elektronentomographie. Konkurrenz belebt natürlich das Geschäft, doch noch haben wir einen Wissensvorsprung.“ PARALLELRECHNER „ENTSCHLEIERT“ DIE BILDER Im Gegensatz zur Computertomographie in der Klinik ist es bei der Elektronentomographie nicht sinnvoll, das Mikroskop rund um das Objekt zu führen. Hier wird die Zelle gedreht, während die „Lichtquelle“, also die Quelle der Elektronenstrahlen, an ihrem Platz bleibt. Das klingt einfach, ist aber in der Praxis mit einer Reihe von Problemen verbunden. So verschiebt sich bei jedem Kippschritt das Gesichtsfeld ein wenig – der Elektronenstrahl muss deshalb neu ausgerichtet und wieder genau auf das Objekt fokussiert werden. Würde man dies von Hand machen, FOTOS: BIOPHYSICAL JOURNAL 72, 1031-1042 (1998) UND JOURNAL OF STRUCTURAL BIOLOGY 138, 105-113 (2002) wäre die Zelle unter dem Elektronenbeschuss schon nach den ersten Bildern verkohlt. Die Martinsrieder nehmen eine höchst empfindliche CCD-Kamera und den Computer zu Hilfe. Er wertet bei jedem Schritt das registrierte Bild aus, positioniert die Zelle wieder exakt und fokussiert auf die richtige Stelle – alles automatisch. Und während der ganzen Zeit wird der Elektronenstrahl zur Seite abgelenkt und kann deshalb das Objekt nicht schädigen. „Auf diese Weise gelingt es uns, rund 97 Prozent der Strahlendosis für das Aufnehmen der Bilder zu verwenden“, sagt Harald Engelhardt, „nur drei Prozent benötigen wir für die Einstellung des Mikroskops.“ Eine weitere Schwierigkeit: Die Probe lässt sich nicht aus allen Richtungen durchleuchten; ein gewisser Winkel wird immer durch den Probenhalter verdeckt. Diese Daten fehlen später bei der Rekonstruktion der Bilder zum 3-D-Objekt. Neuerdings versuchen die Forscher, diese Informationslücke dadurch zu verringern, dass sie die Probe in einem eigens konstruierten Dreh-Kipphalter nach einer Bilderserie um 90 Grad drehen und dann eine zweite Sequenz aufnehmen. Sind die Bilder erst einmal im Kasten, sprich Computer, beginnt die zeitaufwändige Verarbeitung der Daten. Aufgrund der extrem geringen Dosis sind die Einzelbilder sehr verrauscht – oft erkennt das menschliche Auge darauf nur schemenhafte Schleier. Die Aufgabe der Martinsrieder Bildverarbeiter um Reiner Hegerl ist es nun, diese Schleier zu lüften und die Bilder so zu kombinieren und aufzubereiten, dass man aus der Datenflut Objekte herausfiltern kann, die sich klar von der Umgebung abgrenzen lassen. „Man muss die relesellschaft in Garching sowie eine Reihe leistungsfähiger Workstations im Institut. Ist das räumliche Bild der Zelle erst einmal bestimmt und erscheint auf dem Computerbildschirm, geht es darum, das Gewirr in ihrem Inneren zu gliedern und in fassbare Strukturen einzuteilen – Segmentieren nennen das die Fachleute. Oft scheitert diese Methode jedoch daran, dass in der übervölkerten Zelle viele Proteinkomplexe zu eng aneinander liegen. Der Computer kann dann nicht mehr erkennen, wo der eine aufhört und der nächste anfängt. Welche Enzyme in einer Zelle arbeiten, ist zum großen Teil bekannt, und soweit man deren räumliche Struktur mit physikalischen Methoden – etwa der Röntgenstrukturanalyse oder der Elektronenmikroskopie – ermittelt hat, kennt man auch ihre Form. Diese Kenntnis wol- Die Entwicklung der zellulären Kryo-Elektronentomographie war eine Sisyphusarbeit: Hatten die Forscher ein Problem gelöst, so tauchte meist gleich das nächste auf. Trotzdem ließ sich Baumeisters Team, das unter anderem aus Biologen, Chemikern, Physikern und Informatikern besteht, nicht entmutigen. Und so entstand ein Verfahren, das die neuesten technologischen Erkenntnisse und Fortschritte kombiniert. Zunächst gibt man die Lösung mit den Zellen, die man betrachten will, auf ein feines Netzchen, das so konstruiert ist, dass die Zellen nicht durchrutschen, trotzdem aber durch die Maschen hindurch sichtbar bleiben. Um das empfindliche Objekt In elegantem Hellgrau präsentiert sich die neueste Errungenschaft des Instituts: Das heliumgekühlte Transmissions-Elektronenmikroskop namens „Polara“ steht in einem Bunker des eigens für die Elektronenmikroskopie errichteten Neubaus, der gegen Erschütterungen und elektromagnetische Felder von außen gut abgeschirmt ist. Unspektakulär sieht es aus, und für mehrere Millionen Euro kann jeder so ein Gerät kaufen. Dass gerade die Forscher rund um Wolfgang Baumeister derart aufregende Bilder damit machen können, liegt an ihrer umfassenden Erfahrung. „Das Gebiet ist heute für viele Wissenschaftler attraktiv“, sagt Jürgen M. Plitzko, „und eine Reihe von „Schnappschüsse“ aus einem zellulären Tomogramm nach 3-dimensionaler Bildanalyse eines vollständig in Eis eingebetteten Archaebakteriums (Pyrodictium abyssi): Sichtbar sind die regelmäßig geformte Oberflächenschicht (hellblau), eine Gruppe von Vesikeln (dunkelblau) und ein „Röhrchen“ (ebenfalls dunkelblau). Außerdem erkennt man verschiedene an die Vesikel angelagerte Proteinkomplexe (weiß). Trotzdem ist es noch eine Herkulesarbeit für den Computer, diese Komplexe im Inneren der Zelle auszumachen. Es ist das alte Problem, das Informatiker mit dem „Blick in einen Werkzeugkasten“ umschreiben: Der Mensch ist intuitiv in der Lage, auf einen Blick zum Beispiel einen Schraubenschlüssel aus der Fülle anderer Werkzeuge herauszufinden. Der Rechner kann das nicht. Er muss mühsam das Bild des Werk- „Polara“, ein Transmissionselektronenmikroskop der neuesten Generation, ermöglicht neben der herkömmlichen Stickstoffauch Heliumkühlung. Am Max- Planck-Institut für Biochemie wird dieses Gerät seit Anfang 2003 zur Aufzeichnung von Kippserien für die Tomographie verwendet. FOTO: MPI FÜR BIOCHEMIE vanten Daten erkennen und vom überlagernden Rauschen befreien“, schildert Harald Engelhardt das Vorgehen, „wir erproben zur Zeit unterschiedliche Verfahren. Die Astronomen haben übrigens ähnliche Probleme, wenn sie winzige Lichtsignale aus dem Rauschen des Nachthimmels herausfiltern wollen.“ Gigabyte von Informationen müssen bei dieser Aufgabe transportiert, durchforstet und gegeneinander verrechnet werden. Noch vor wenigen Jahren wären die Computer an dieser gigantischen Aufgabe gescheitert. Erst heute stehen potente Parallelrechner zur Verfügung, etwa ein Linux-Cluster in Martinsried, das Rechenzentrum der Max-Planck-Gelen die Martinsrieder Forscher nutzen, um die Muster bestimmter Molekülkomplexe in den 3-D-Datensätzen zu finden. DER COMPUTER MUSS ALLES ERTASTEN 26 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003 4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 27
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