Lichtblicke in die Nanowelt - Max-Planck-Gesellschaft

FOKUS
Optische HORIZONTE
kleiner das Loch in der Mitte, desto
kleiner der Fluoreszenzfleck (siehe
Bild im Kasten auf Seite 23).
Natürlich unterliegt auch der
STED-Puls der Abbeschen Beugungsgrenze
und bildet ebenfalls einen
langgestreckten Fokus. Das heißt,
man kann ihm kein beliebig kleines
Loch verpassen. Den Ausweg hat Stefan
Hell jedoch sofort erkannt: Er
liegt in dem nichtlinearen Zusammenhang
zwischen Abregung und
Intensität des Pulses. „Je intensiver
der STED-Puls ist, desto besser regt
er ab“, sagt Hell. „Überschreitet die
Intensität eine gewisse Schwelle, hat
das Molekül kaum eine Chance,
spontan zu fluoreszieren. Man sagt,
die Abregung ist gesättigt. Wird die
Intensität weiter gesteigert, nimmt
der von der Abregung betroffene Bereich
immer weiter zu – die fluoreszierende
Region wird immer weiter
eingeschnürt“.
Das ist laut Hell der eigentliche
Trick des Verfahrens: „Je mehr man
die Sättigungsschwelle überschrei-
tet, desto kleiner wird der Fluoreszenzfleck
und umso besser kann
man auflösen“. Abbes Gesetz ist damit
ausgehebelt. Der Faktor, um den
man die Sättigungsschwelle überschreitet,
bestimmt die Auflösung;
diese hängt jetzt nicht mehr von der
Wellenlänge des verwendeten Lichts
ab. Stefan Hell hat berechnet, dass
die Auflösung mit der Wurzel des
Sättigungsfaktors zunimmt. Überschreitet
man die Schwelle um das
Neunfache, so verdreifacht sich die
Auflösung. Überschreitet man sie
um das Hundertfache, ist der Gewinn
verzehnfacht.
„Die Beugung des Lichts verschwindet
natürlich nicht, aber sie
ist nicht mehr die Grenze“, sagt der
Erfinder der neuen Technik. Ohne
physikalische Gesetze zu verletzen,
könne man nun einen Fluoreszenzfleck
von der Größenordnung eines
Moleküls erzeugen und damit Auflösungen
bis hinunter zur molekularen
Skala erreichen. Man braucht
dazu jedoch Fluoreszenzmoleküle,
die eine möglichst niedrige Abregungsschwelle
haben. Beliebig hoch
kann man die Intensität des STED-
Pulses nämlich nicht wählen, da
zu intensives Licht den Molekülen
schaden würde.
AUF DER SUCHE NACH
DER NEUEN GRENZE
Hinter Kabeln
und Haltern versteckt:
das erste
4Pi-Mikroskop,
das wie ein richtiges
Mikroskop
aussieht, wurde
von Max-Planck-
Forschern in Kooperation
mit der
Firma Leica Microsystems
entwickelt.
Der Physiker Jörg
Bewersdorf und
die Biologin Tanja
Rosenmund bereiten
gerade eine
Probe vor.
Die Abregungsschwelle hängt von
den Eigenschaften des Moleküls und
der verwendeten Abregungs-Wellenlänge
ab. Das Team um Stefan Hell –
seit Oktober 2002 ist er Leiter der
neu gegründeten Abteilung „Nano-
Biophotonik“ am Göttinger Max-
Planck-Institut – sucht jetzt nach
den tatsächlichen Grenzen. Die Wissenschaftler
testen alle Farbstoffe;
organische wie anorganische kommen
infrage, aber auch von der Zelle
selbst erzeugte Proteine. Dazu muss
man die Wellenlänge des Lichts variieren
und die chemische Umgebung
(zum Beispiel den pH-Wert) verändern.
„Wir haben einen Faden gefunden.
Nun schauen wir, bei welcher
Auflösung er endet“, beschreibt
Hell die Situation.
„Noch handelt es sich um Grundlagenforschung“,
meint der Physiker.
„Wir haben gezeigt, dass die STED-
Mikroskopie funktioniert und sich
die zu Grunde liegende physikalische
Idee experimentell bestätigen lässt.
Jetzt wollen wir herausfinden, wie
gut das Prinzip mit der Palette vorhandener
fluoreszierender Moleküle
zu realisieren ist.“ Auch über Alternativen
zu STED denkt Hell bereits
nach. Statt die Randmoleküle gezielt
aus dem angeregten Energiezustand
abzuregen, sei es beispielsweise
denkbar, sie schon vor der eigentlichen
Fluoreszenzanregung aus
dem Grundzustand zu entfernen. In
Betracht ziehen die Forscher außerdem
die lichtinduzierte Umlagerung
von Atomgruppen innerhalb der
Moleküle, welche die Fluoreszenz
ein- und ausschalten.
Besonders aufmerksam verfolgen
Biologen die Göttinger Entwicklungen.
Die Lichtmikroskopie ist für sie
nämlich die einzige Möglichkeit, das
Innere lebender Zellen zu beobachten.
Elektronen- und Rasterkraftmikroskopie
erreichen zwar die gewünschte
Auflösung. Aber sie arbeiten
unter Bedingungen (Vakuum
oder tiefe Temperaturen), unter denen
jede lebende Zelle stirbt. Und
mit Rastersondenmikroskopen kann
man ohnehin nur Oberflächen abtasten.
Die optische Mikroskopie war jedoch
aufgrund der Beugungsgrenze
in ihrer Anwendung bislang begrenzt.
Würden Stefan Hells Methoden
den Sprung in die breite Anwendung
schaffen, wäre das neben dem
schon erzielten physikalischen Durchbruch
ein echter Gewinn auch für die
Biologie. „Am Anfang“ erinnert er
sich, „wollte kaum jemand daran
glauben. Aber jetzt ist klar: Die Vision
der lichtoptischen Nanoskopie hat
eine echte Chance.“ INA HELMS
DIE 4PI-MIKROSKOPIE
Schon mit dieser Methode gelang es, die optische Auflösung von den
vorher möglichen 500 Nanometern auf 70 bis 140 Nanometer entlang
der optischen Achse zu verbessern. Zwar blieb die Abbesche Beugungsgrenze
noch unangetastet, doch mit der 4Pi-Idee hatte Stefan Hell
Anfang der neunziger Jahre erstmals gezeigt, dass die Lichtmikroskopie
noch lange nicht am Ende ist. Doch selbst als er die Theorie der Methode
schlüssig bewiesen hatte, glaubte zunächst kaum jemand, dass sie in der
Praxis umsetzbar sei. Dennoch entwickelten die Göttinger Max-Planck-
Forscher die 4Pi-Mikroskopie unbeirrt weiter. Den letzten Beweis hat
Alexander Egner erbracht: Während seiner Promotionsarbeit gewann
er hoch auflösende 3-D-Bilder, welche die Verteilung von Proteinen im
so genannten Golgi-Apparat zeigen – das sind Zellorganellen, in denen
Proteine sortiert und verzuckert werden (siehe Foto rechts). Außerdem
haben die Göttinger Forscher in Kooperation mit der Firma Leica Microsystems
Heidelberg ein 4Pi-Mikroskop in einer physikalisch besonders
leistungsfähigen Form realisiert. Statt eines einzigen Objektivs, so der
Grundgedanke der 4Pi-Mikroskopie, verwendet man zwei Objektive, die gegeneinander gerichtet sind.
Die Lichtwellen beider Objektive werden so überlagert, dass sie im Fokuspunkt ihr Feld verstärken (konstruktive
Interferenz). Auf diese Weise simuliert man eine beinahe kugelförmige Lichtwelle, die fast aus
allen Richtungen auf den Fokuspunkt zuläuft. Der volle Raumwinkel von 4Pi wird dadurch viel besser abgedeckt.
Aus dem ovalen Brennfleck wird ein schmalerer, fast runder Fokus. Allerdings entstehen oberund
unterhalb des Brennpunkts noch zwei kleinere Brennflecken. Diese ausreichend klein zu halten, war
die größte Herausforderung bei der Entwicklung der Methode. Es galt, physikalische Bedingungen zu finden,
unter denen die Intensität der beiden Satelliten mindestens kleiner als 50 Prozent des Hauptbrennflecks
ist. Dann nämlich kann man ihre Auswirkung auf das Bild wegrechnen. Gelungen ist dies mithilfe
der Zwei-Photonen-Anregung (siehe den Beitrag „Mikroskopie im optischen Schnitt“, Seite 34 ff.), die
jedoch nur eine erste pragmatische Lösung sein soll. Denn bei dieser Art der Anregung ist eine zusätzliche
Laserquelle erforderlich, und man muss mit gepulster Strahlung arbeiten. In Zukunft, so die Vorstellungen
in Göttingen, soll die 4Pi-Mikroskopie auch ohne Zwei-Photonen-Anregung auskommen und damit leichter
handhabbar werden. Die Göttinger Forscher sind jedenfalls überzeugt, dass es sich lohnt, das Auflösungsproblem
systematisch und von mehreren Seiten anzugehen. Unabhängige Ansätze wie die STED- und die
4Pi-Mikroskopie könnten dann kombiniert werden und würden sich gegenseitig verstärken.
DIE STED-MIKROSKOPIE
Der entscheidende Bestandteil der STED-Mikroskopie ist die Sättigung der Molekül-Abregung durch stimulierte
Emission. Ein Lichtpuls (STED), unmittelbar nach der Fluoreszenzanregung losgeschickt, zwingt die
Moleküle vom angeregten Energiezustand zurück in den Grundzustand (a). Wenn sich Anregungs- und Abregungspuls
geschickt überlagern (c), werden die Moleküle abgeregt, die sich im Randbereich des Brennflecks
befinden – noch ehe sie dazu kommen, spontan zu fluoreszieren. Insgesamt nimmt die spontane
Fluoreszenz eines Moleküls mit steigender Intensität des STED-Pulses ab (b). Wird eine bestimmte Schwelle
überschritten, kann die Fluoreszenz fast vollkommen unterbunden werden. Der grüne Brennfleck, der ohne
STED-Puls entsteht, schnürt sich mit zunehmender Intensität des Abregungspulses immer mehr ein. Das
Ergebnis: ein fokaler Fleck, der deutlich kleiner ist als der von der Beugung limitierte Abbesche Fleck (d).
(a)
(b)
(c)
(d)
DATEN AUS KLAR ET ETAL, PNAS, 97, 2000
AUFNAHMEN: MPI FÜR BIOPHYSIKALISCHE CHEMIE
22 M AXP LANCKF ORSCHUNG 4/2003
4/2003 M AXP LANCKF ORSCHUNG 23