Basismodul Biologie Praxis I Molekulare Pflanzenphysiologie

Von jeder der beiden Proben werden jeweils 400 µL Überstand in je zwei 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und auf Eis gelagert.Zu je einem der Gefäße jeder Probe werden 200 µL 1 M Zinksulfatlösung gegeben.Ansatz(Anzuchtbedingung)(Inhibitor)(A)-+NO 3−Zn(B)+NO 3-+Zn(C)-−NO 3−Zn(D)−NO 3-+ZnKaliumphosphatpuffer 400 µL 400 µL 400 µL 400 µLKNO 3 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLNADH 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL_ZnSO 4200 µL200 µL-Extrakt +NO 3 400 µL 400 µL__-Extrakt −NO 3_ _400 µL 400µL1h RT 1h Eis 1h RT 1h EisDie Ansätze ohne Zinksulfat (Ansätze (A) und (C)) werden eine Stunde bei Raumtemperaturinkubiert, die Ansätze mit Zinksulfat (Ansätze (B) und (D)) werden auf Eis belassen!In dieser Zeit wird die Eichkurve vorbereitet.3. Nitrit – Eichkurve:Für die Eichkurve werden folgende Ansätze einer 0,1 mM KNO 2 -Lösung in Reagenzgläserpipettiert:_Ansatz Nummer 1 2 3 4 5 6 7 8KNO 2 0,0 20 µL 50 µL 100 µL 200 µL 300 µL 400 µL 500 µLH 2 O 1000 µL 980 µL 950 µL 900 µL 800 µL 700 µL 600 µL 500 µLnmol KNO 2 abs. _(bitte ausrechnen)Extinktion NullprobeBeispiel zur Berechnung der Nitritmenge:Probe 8 enthält 500 µl einer 100 µMolaren KNO 2 – Lösung:1 l 100 µmol, 500 ml 50 µmol, 500 µl 50 nmol4. Nitrit – Nachweis:Die Versuchsansätze und die Proben für die Eichkurve werden parallel weiterbearbeitet.Nach der Inkubation bei Raumtemperatur werden die Reaktionen in den Versuchsansätzen(A) und (C) durch Zugabe von je 200 µL 1 M Zinksulfatlösung gestoppt.Die Eppendorf-Reaktionsgefäße (Ansätze (A)-(D)) werden 1 min auf höchster Stufezentrifugiert. Je 1 mL des klaren Überstandes wird in beschriftete Reagenzgläser überführt.10