Basismodul Biologie Praxis I Molekulare Pflanzenphysiologie

einer Küvette mit 1,98 mL Medium B verdünnt (entspricht einer 1:100 Verdünnung), undgemischt. Die Extinktion wird im Photometer bei 600 nm gegen Medium B gemessen.Die Extinktion in der Ausgangssuspension entspricht also dem Hundertfachen desgemessenen Wertes, wenn man von einem linearen Konzentrations- / Extinktions-Verhältnisausgeht.Die Thylakoidsuspension wird nun auf eine Extinktion von 2,0 verdünnt, indem dieentsprechend berechnete Menge der Ausgangssuspension mit Medium B auf ein Volumenvon 5 mL aufgefüllt wird.2. Versuchsansätze:Jetzt werden 8 verschiedene Ansätze in Reagenzgläser pipettiert:Ansatz 1:Ansatz 2:Ansatz 3:erhitzte Probe; durch die Behandlung bei 60°C werden die Proteinkomponentender Elektronentransportkette denaturiert und dadurch inaktiviert.Dunkelprobe; dieses Röhrchen wird dicht mit Aluminiumfolie umwickelt.Ohne Belichtung können keine Elektronen auf DCPiP übertragen werden.LichtprobeAnsatz 4 – 8: Hemmung des Elektronentransports durch steigende Mengen an DCMU.Zunächst wird Ansatz 1 hergestellt (DCPiP noch nicht zugeben!).Während Ansatz 1 10 min bei 60 °C im Wasserbad inkubiert wird, werden die anderenAnsätze vorbereitet.Ansatz 2 wird dicht mit Alufolie umwickelt.Von den fünf DCMU-Stammlösungen A - E (s.o.) werden in die Ansätze 4 – 8 je 200 µLpipettiert.Das DCPiP wird erst unmittelbar vor der Lichtinkubation zu den Ansätzen zugegeben.Ansätze:Ansatz-Nr.1 2 3 4 5 6 7 8erhitzt Dunkel Licht DCMU DCMU DCMU DCMU DCMUThylakoide 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µLH 2 0 300 µL 300 µL 300 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µLMedium B 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL 3.0 mL 3.0 mLDCMU - - -200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL„A“ „B“ „C“ „D“ „E“DCPiP 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µLDie Reagenzgläser werden mit Parafilm verschlossen und durch mehrmaliges Invertieren gutgemischt. Dann werden die Proben vor eine Lichtbank gestellt und beobachtet. Wenn dieFärbung von Probe 4 die von Probe 3 erreicht hat, spätestens aber nach 10 min werden dieReagenzgläser noch einmal invertiert.3. Photometrischer Nachweis der DCPiP-Reduktion:Danach werden aus jedem Ansatz 2 mL in ein 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert undin der Tischzentrifuge 10 min bei 16000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig in4