Untersuchungen zu den zytokinartigen Eigenschaften des Hormons ...

2.2 Methoden 2 MATERIAL UND METHODEN
2.2.2 Zellkulturverfahren
2.2.2.1 Kulturen von PBMC: Das benötigte Endvolumen der Kultur von 4 ml wurde aus
Zellsuspensionen mit einer Konzentration von 5 x 10 5 Zellen/ml auf sterile, pyrogenfreie 6-
Loch-Platten ausgesät. Als Kulturmedium verwendeten wir RPMI 1640 Medium der Firma
Bio Whittaker mit Zusätzen (siehe Appendix, Kapitel A1.1).
Es wurden jeweils möglichst geringe Volumina (insgesamt max. 10 %) der Stimulantien
zugegeben. In Kontrollexperimenten wurde statt dessen das entsprechende Volumen des je-
weiligen Mediums, das zur Verdünnung der Stimulantien bzw. Zusätze verwendet wurde,
zugesetzt.
Zum zeitlichen Ablauf der Kostimulation und den einzelnen Endkonzentrationen sei auf Ka-
pitel 3 verwiesen.
Die anschließende Inkubation erfolgte bei 37 ◦ C, 5 % CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeit
ohne Medienwechsel bis zu 72 Stunden.
2.2.2.2 Vollblutansätze: Zur Erfassung der Effekte von PRL auf die Zytokinsynthese via
ELISA nutzten wir Vollblutansätze nach einem im Institut etablierten und in [41] publizierten
Verfahren.
Blutproben wurden zehn gesunden Blutspendern in Sarstedt-Monovetten (15 IU Li-Heparin/ml
Blut) abgenommen. 100 µl wurden zu 800 µl RPMI-Medium mit Zusätzen (siehe A1.1) pi-
pettiert, das entweder 0 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml oder 300 ng/ml rekombinantes PRL
enthielt. Nach einer Stunde Vorinkubation wurden Aliquoten von 100 µl Kulturlösung oder
LPS-Aliquoten (Endkonzentration: 100 ng/ml) hinzugegeben. Nach zwölf Stunden Inkuba-
tion wurden die Überstände für Messung von IL-10, IL-12 und TNF-α via ELISA abgenom-
men.
2.2.2.3 Präparation der Stimulantien: LPS und PMA wurden in RPMI-Medium unter
sterilen Bedingungen ohne weitere Zusätze aliquotiert. PRL, cptcAMP, Noradrenalin und
PHA wurden in sterilem Wasser aliquotiert. Dabei kamen die folgenden Endkonzentrationen
zum Einsatz:
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