Untersuchungen zu den zytokinartigen Eigenschaften des Hormons ...

2.2 Methoden 2 MATERIAL UND METHODEN
Zunächst werden die Zellen nach Stimulierung geerntet und gewaschen. Sodann werden im
ersten Schritt die Zellmembranen lysiert und mit dem Zytosol entfernt. Die übrig bleiben-
den Zellkerne werden anschließend lysiert und das Karyoplasma freigesetzt. DNA sowie die
Trümmer der Kernmembranen werden entfernt, wobei die Kernextrakte mit den darin ent-
haltenen Kernproteinen und Transkriptionsfaktoren im Überstand übrig bleiben. Aus etwa
4 x 10 6 Zellen wurden 50 µl Kernextrakt mit einer Protein-Konzentration von 4-6 µg/µl
erreicht und in Aliquots von 10 µl bei -80 ◦ C tiefgefroren. Die Protein-Konzentration der
Kernextrakte wurde mit Hilfe des Bio-Rad-Protein-Bestimmungs-Kits und des Hitachi-U-
3000-Photometers gemäß der Testanleitung des Herstellers durchgeführt.
Für Einzelheiten zur Herstellung von Kernextrakten sei auf Kapitel A.2 der Appendix ver-
wiesen.
2.2.4 Überstände
Die Überstände der Stimulierungsexperimente enthielten die von den Immunzellen produ-
zierten Zytokine und wurden zu deren Messung (via ELISA) steril abgenommen und bei
-80 ◦ C ohne zwischenzeitliches Auftauen bis zur Messung tiefgefroren.
2.2.5 RNA-Extraktion
Als Voraussetzung für das Arbeiten mit RNA müssen alle Materialien und Lösungen frei von
RNAsen sein. Das heißt, dass die Materialien autoklaviert und acht Stunden bei 160 ◦ C ste-
rilisiert sein müssen. Lösungen werden mit 0,02 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt,
was zu einer unspezifischen Alkylierung der RNAsen führt. Ferner sind sämtliche Arbeiten
mit Einmal-Latex-Handschuhen durchzuführen, um eine nachträgliche Kontamination mit
RNAsen zu vermeiden.
Die RNA-Isolierung wurde entsprechend der Arbeitsvorschrift des Testherstellers mit Hilfe
des RNA-Isolierungs-Kits von Invitrogen und des Kits von Quiagen durchgeführt.
Durch spektralphotometrische Messung der optischen Dichte lässt sich sowohl die Menge
als auch die Reinheit der zuvor isolierten RNA quantifizieren. Nukleinsäuren weisen bei
einer Wellenlänge von 260 nm ein Maximum ihrer Lichtabsorption auf, während das von
Proteinen bei 280 nm liegt. Die absolute Extinktion der Lösung in einer Quarzküvette gegen
Wasser bei 260 nm ist dabei gemäß dem Lambert-Beerschen Gesetz linear vom RNA-Gehalt
abhängig. Über den Quotienten beider Extinktionswerte (260 nm/280 nm) kann der Konta-
minationsgrad der Probe mit Proteinen beurteilt werden. Der Quotient sollte zwischen 1,6
und 2,0 liegen.
Die Proben wurden entweder sofort für die Gen-Expressions-Analyse eingesetzt oder bei -
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