Untersuchungen zu den zytokinartigen Eigenschaften des Hormons ...

2.2 Methoden 2 MATERIAL UND METHODEN
bilden damit eine Bande, deren Lokalisation auf dem Gel von ihrer Masse und damit der
Anzahl der Basenpaare abhängt. Parallel wird eine sog. Leiter aufgetragen, ein Gemisch aus
DNA-Stücken definierter Größe, die ebenfalls durch das elekrische Feld ihrer Masse ent-
sprechend aufgetrennt werden, und anhand derer die Anzahl von Basenpaaren einer Banden
bildenden Struktur abgelesen werden kann.
Wir synthetisierten cDNA aus der mRNA der Zellen unserer Versuchsreihen mit Hilfe des
First Strand cDNA Synthesis Kit der Firma SuperArray (Versuchsanleitungen siehe Appen-
dix). Für die PCR setzten wir Primer eines RT PCR Primer Sets der Firma SuperArray so-
wie mit dem Programm OligoExplorer kreierte Oligonukleotide ein (siehe Ergebnisteil). Als
master mix für die PCR verwendeten wir ReactionReady Sweet PCR master mix der Firma
SuperArray.
2.2.10.2 Nachweis mittels Genexpressions-Analysen (GEArray) Mit Genexpressions-
Analysen wird der Status der Genexpression einer Zellpopulation dargestellt. Dies geschieht
unter Zuhilfenahme der mRNA der Zellen, die den aktuell in der Zelle transkribierten Genen
entspricht.
Diese mRNA wird aus den zu untersuchenden Zellen isoliert (siehe Kapitel 2.2.5) und mit
Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben und radioaktiv markiert.
Man erhält somit komplementäre DNA (cDNA).
Auf einer Nitrozellulosemembran sind vom Hersteller cDNA-Fragmente aufgetragen wor-
den, die den einzelnen Genen entsprechen, die bei der Genexpressions-Analyse untersucht
werden sollen.
In einem Annäherungsschritt wird die cDNA den auf der Membranen aufgebrachten Gen-
proben präsentiert.
Tritt eine Hybridisierung zwischen der aus der mRNA synthetisierten cDNA und den auf
der Membran aufgebrachten DNA-Genen ein, so wird dies sichtbar durch eine radioaktive
Strahlung im definierten Bereich des aufgebrachten Genes auf der Membran.
Autoradiographisch stellt sich dies als Punkt dar, wobei aus dem Hybridisierungsmuster
auf der Membran sowie aus der Hybridisierungsintensität auf die Genexpression zurück-
geschlossen werden kann.
Durch dieses Verfahren werden eine quantitative sowie auch eine qualitative Aussage ge-
macht zu den Genen, die in der untersuchten Zellpopulation exprimiert werden. Die qualita-
tive Aussage lässt sich durch das Vorhandensein eines radioaktiv strahlenden Bereiches auf
der Membran tätigen. Dies zeigt eine Hybridisation der radioaktiv markierten cDNA an.
Die quantitative Aussage entsteht durch den Vergleich der Expression verschiedener Gene
der Zellen bei unterschiedlichen Situationen. So untersuchten wir die Genexpression bei
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