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Interaktionen von humanen Immuneffektorzellpopulationen mit dem
humanpathogenen Pilz Aspergillus fumigatus, sowie der Einfluss von
40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf deren Funktionen
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Vorgelegt von
Ruth Bauer
aus Regensburg
Würzburg, 2011

Eingereicht am : ____________________
Mitglieder der Promotionskommission :
Vorsitzender: ____________________
1. Gutachter: ____________________
2. Gutachter: ____________________
Tag des Promotionskolloquiums : ____________________
Doktorurkunde ausgehändigt am : ____________________

Erklärung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Fakultät für Biologie der Julius-Maximilians Universität
Würzburg in der Medizinischen Klinik und Poliklinik II sowie im Institut für Hygiene und
Mikrobiologie im Zeitraum von Dezember 2007 bis Januar 2011 angefertigt.
Hiermit versichere ich, dass diese Arbeit von mir selbstständig und nur unter Verwendung der
angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt wurde.
Ferner erkläre ich, dass diese Arbeit in gleicher oder ähnlicher Form keinem anderen
Prüfungsverfahren vorgelegt wurde und ich mit Ausnahme des Grades Diplom-Biologe keine
weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht habe.
_______________
Ruth Bauer

Für meine Eltern (Sigrid und Georg)

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ______________________________________________ 1
2 Summary _____________________________________________________ 3
3 Einleitung _____________________________________________________ 5
3.1 Aspergillus fumigatus ______________________________________________ 5
3.1.1 Lebenszyklus ______________________________________________________ 5
3.1.2 Pathophysiologie von Aspergillus-Infektionen ____________________________ 7
3.2 Das Immunsystem in Bezug auf Aspergillus fumigatus ___________________ 8
3.2.1 Neutrophile Granulozyten ____________________________________________ 8
3.2.2 Dendritische Zellen _________________________________________________ 9
3.2.3 Rezeptoren zur Erkennung von Aspergillus fumigatus _____________________ 11
3.2.4 Zytokine _________________________________________________________ 14
3.3 Modellsysteme __________________________________________________ 16
3.3.1 In vitro generierte dendritische Zellen __________________________________ 16
3.3.2 Modell der frühen invasiven Aspergillose in der Lunge ____________________ 17
3.4 Immunsuppressiva _______________________________________________ 18
3.4.1 Überblick über gängige Immunsuppressiva _____________________________ 18
3.4.2 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) _______________________________ 20
3.5 Ziele der Arbeit _________________________________________________ 22
4 Materialien ___________________________________________________ 23
4.1 Zellen und Stämme ______________________________________________ 23
4.2 Gebrauchsfertige Substanzen _______________________________________ 23
4.3 Oligodesoxyribonukleotidsequenzen _________________________________ 24
4.3.1 Primersequenzen __________________________________________________ 24
4.3.2 Sondensequenzen __________________________________________________ 25
4.3.3 siRNAs __________________________________________________________ 26
4.4 Substanzen und Lösungen _________________________________________ 26
4.4.1 Reagenzien für Zellkultur ___________________________________________ 27
4.4.2 Substanzen für Microarray-Analysen __________________________________ 27
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Inhaltsverzeichnis
4.4.3 Substanzen für Gelelektropohorese ____________________________________ 28
4.4.4 Farbstoffe und FACS-Antikörper _____________________________________ 28
4.4.5 Antikörper, Substanzen und Puffer für ELISA ___________________________ 29
4.4.6 Agar-Platten ______________________________________________________ 30
4.5 Geräte _________________________________________________________ 30
4.6 Verbrauchsmaterialien ____________________________________________ 31
4.7 Software _______________________________________________________ 32
5 Methoden ____________________________________________________ 33
5.1 Arbeiten mit Aspergillus fumigatus __________________________________ 33
5.2 Wachstumsexperiment ____________________________________________ 33
5.3 Primärzellen ____________________________________________________ 34
5.3.1 Isolation von PBMCs _______________________________________________ 34
5.3.2 Einfrieren und Auftauen primärer Zellen _______________________________ 35
5.3.3 Zellzahlbestimmung in der Neubauer-Zählkammer _______________________ 35
5.3.4 Isolation von CD14+-Zellen _________________________________________ 36
5.3.5 In vitro Generierung unreifer dendritischer Zellen ________________________ 37
5.3.6 Generierung von Heparin-Serum moDCs _______________________________ 38
5.3.7 Isolation von myeloiden dendritischen Zellen ____________________________ 38
5.3.8 Isolation von CD8+ T-Lymphozyten __________________________________ 39
5.3.9 Isolation von neutrophilen Granulozyten _______________________________ 40
5.3.10 Elektroporation mit siRNA _________________________________________ 40
5.3.11 Durchflusszytometer ______________________________________________ 41
5.4 Zelllinien ______________________________________________________ 42
5.4.1 HPAEC _________________________________________________________ 42
5.4.2 A-549 ___________________________________________________________ 43
5.4.3 Einfrieren von Zelllinien ____________________________________________ 44
5.5 Alveolarepithelmodell ____________________________________________ 44
5.6 Microarray-Analyse ______________________________________________ 45
5.6.1 Amplifikation der RNA _____________________________________________ 45
5.6.2 Labelling und cDNA Synthese _______________________________________ 46
5.6.3 Hybridisierung und Analyse _________________________________________ 46
5.7 Genexpressions- und Proteinstudien _________________________________ 47
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Inhaltsverzeichnis
5.7.1 Infektion der moDCs zur Analyse der Zytokinproduktion __________________ 47
5.7.2 DNA Isolierung und Reinigung _______________________________________ 47
5.7.3 RNA Isolierung und Reinigung _______________________________________ 47
5.7.4 Reverse Transkription ______________________________________________ 48
5.7.5 Realtime Polymerasekettenreaktion ___________________________________ 49
5.7.5.1 Durchführung im LightCycler ___________________________________ 49
5.7.5.2 Durchführung im StepOnePlus ___________________________________ 51
5.7.5.3 Agarose-Gelelektrophorese ______________________________________ 52
5.7.6 ELISA __________________________________________________________ 52
5.7.6.1 Durchführung nach Biosource ___________________________________ 52
5.7.6.2 Home-made ELISA-Assays _____________________________________ 53
5.8 Konfrontationsuntersuchungen _____________________________________ 54
5.8.1 Analyse der Oberflächenmarker ______________________________________ 54
5.8.2 T-Zell-Proliferations Assay __________________________________________ 54
5.8.3 Oxidativer Burst __________________________________________________ 55
5.8.4 Phagozytose-Assay ________________________________________________ 56
5.8.4.1 Durchführung mit Dextran-Beads _________________________________ 56
5.8.4.2 Durchführung mit Aspergillus fumigatus Konidien ___________________ 56
5.8.5 Plattenbasierter Abtötungsversuch ____________________________________ 56
5.9 Statistik ________________________________________________________ 57
6 Ergebnisse ___________________________________________________ 58
6.1 Kontrolle der Reinheit der isolierten, primären Zellen ___________________ 58
6.2 Einfluss von RAD als Beispiel eines Immunsuppressivums auf das
Pilzwachstum ___________________________________________________ 61
6.3 Einfluss von RAD auf neutrophile Granulozyten _______________________ 62
6.4 Einfluss von RAD auf moDCs ______________________________________ 64
6.4.1 Ausdifferenzierung der moDCs _______________________________________ 64
6.4.2 Expression von den Rezeptoren TLR2, TLR4 und Dectin-1 auf moDCs _______ 66
6.4.3 Ausreifen der moDCs nach Konfrontation mit Aspergillus fumigatus oder LPS _ 68
6.4.4 Ausschüttung von Zytokinen _________________________________________ 69
6.4.5 Phagozytose von Dextran-Beads und Aspergillus fumigatus Konidien ________ 72
6.4.6 Killing von Aspergillus fumigatus _____________________________________ 73
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Inhaltsverzeichnis
6.4.7 CD8+ T-Zell Proliferation ___________________________________________ 75
6.5 Interaktion zwischen dendritischen Zellen und Aspergillus fumigatus im
Alveolarepithelmodell ____________________________________________ 76
6.5.1 Microarray-Analyse der dendritischen Zellen zusammen mit A-549-Zellen ____ 76
6.5.2 Expressionsanalyse zur Bestätigung der Microarray-Analyse _______________ 82
6.6 Analysen des CXCL10-Gens _______________________________________ 83
6.6.1 Analyse dreier SNPs im CXCL10-Gen _________________________________ 83
6.6.2 Unterdrückung des CXCL10-Gens mittels siRNA ________________________ 85
6.6.3 Effekte des CXCL10-Knockdowns auf die inflammatorische Immunantwort und
Reifung der moDCs ________________________________________________ 85
7 Diskussion ____________________________________________________ 88
7.1 RAD __________________________________________________________ 88
7.1.1 Einfluss des Antimykotikums RAD in geringer Konzentration auf das
Pilzwachstum ____________________________________________________ 89
7.1.2 Inhibition des oxidativen Bursts neutrophiler Granulozyten durch RAD _______ 89
7.1.3 Die Expression von drei Rezeptoren für Aspergillus fumigatus auf moDCs unter
RAD-Behandlung _________________________________________________ 90
7.1.4 Der Einfluss von RAD auf Reifung und Funktion dendritischer Zellen ________ 92
7.1.5 Phagozytose und Schädigung des Pilzes nach Behandlung mit RAD __________ 94
7.1.6 Einfluss von RAD auf die Proliferation von CD8+-T-Lymphozyten __________ 95
7.2 Regulation der Expression von Zytokinen dendritischer Zellen im
Alveolarepithelmodell nach Konfrontation mit Aspergillus fumigatus _______ 96
7.3 In vitro Untersuchung eines Risikogens für invasive Aspergillose __________ 99
7.3.1 Suppression der Expression des CXCL10-Gens mittels siRNA ______________ 99
7.3.2 Einfluss des Knockdowns auf Zytokinfreisetzung und Reifung der moDCs nach
Konfrontation mit Aspergillus fumigatus ______________________________ 100
8 Literaturverzeichnis __________________________________________ 101
9 Anhang _____________________________________________________ 116
9.1 Abkürzungen __________________________________________________ 116
9.2 Liste der Mircroarray-Oligonukleotide ______________________________ 119
9.3 Publikationsliste ________________________________________________ 126
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Inhaltsverzeichnis
9.3.1 Veröffentlichungen _______________________________________________ 126
9.3.2 Kongressbeiträge _________________________________________________ 127
9.4 Lebenslauf ____________________________________________________ 128
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1 Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Durch die Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation erhöht
sich das Risiko für opportunistische Infektionen wie invasive Aspergillose (IA). IA wird
hauptsächlich durch den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus, der durch die Luft übertragen
wird, verursacht. Deshalb haben Erkennung und Therapie von IA in den letzten Jahren eine
immer größere Bedeutung erlangt. Für eine erfolgreiche Behandlung sind die Mechanismen
des Immunsystems nach Kontaktaufnahme mit dem Pathogen von zentraler Bedeutung.
Die Erstinfektion mit A. fumigatus findet in der Lunge statt. Als Bewohner der Alveolen
wurden deshalb dendritische Zellen (DCs) auf ihre Fähigkeiten hin untersucht, das
Immunsystem anzuregen. DCs besitzen vor allem die wichtigen Aufgaben, das Immunsystem
zu modulieren und T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen.
Ein Großteil dieser Arbeit befasst sich mit der Analyse des Einflusses des Immun-
suppressivums 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf neutrophile Granulozyten und
auf die in vitro Generierung von moDCs sowie deren Fähigkeit mit dem Pathogen
A. fumigatus zu interagieren. RAD bindet an das zytosolische FK506 bindende Protein
(FKBP12), wodurch die Kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibiert und somit
die T-Zellantwort unterdrückt wird. Klinische Anwendung findet RAD bereits, um eine
Immunsuppression bei Patienten nach Stammzell- oder Organtransplantation zu erhalten. Der
oxidative Burst neutrophiler Granulozyten war nach RAD-Behandlung und Konfrontation mit
A. fumigatus signifikant verringert. Die Generierung der moDCs aus Monozyten erfolgte über
7 Tage, wobei ab dem Tag der Isolation der Monozyten 10 nM RAD oder EtOH zur Kontrolle
hinzugegeben wurde. RAD zeigte vielfältige Effekte auf die Immunfunktion dendritischer
Zellen. Obwohl sich keine Änderung in der Differenzierung der moDCs fand, was durch die
Oberflächenmarker CD1a + , CD14 - und HLA-DR + überprüft wurde, zeigte sich eine
signifikante Reduktion der Rezeptoren TLR4 und Dectin-1 sowie der kostimulatorischen
Moleküle CD40, CD83 und CD86. Nach Konfrontation mit A. fumigatus verblieb CD40 unter
RAD Behandlung signifikant reduziert, während CD83 genau dieses Schema als Trend
aufwies. Ferner wies CD86 sowohl in der Kontrolle als auch mit RAD-Behandlung die
gleiche Expression auf. Nach 6 h Konfrontation der moDCs mit A. fumigatus waren die
Zytokine IL-12, TNF-α und CCL20 auf Genexpressionsebene unter RAD reduziert, was sich
auf Proteinebene teilweise bestätigen ließ, da sich hier erst nach 12 h eine signifikante
Reduktion von IL-12, TNF-α und CCL20 in RAD-behandelten Zellen im Vergleich zu
- 1 -

1 Zusammenfassung
Kontrollzellen zeigte. Des Weiteren war das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 signifikant
reduziert. Die Phagozytose sowohl von FITC-Dextran-Beads als auch von A. fumigatus
Konidien und zugleich die Schädigung von A. fumigatus Keimschläuchen war in unreifen
RAD-behandelten moDCs signifikant reduziert. Ob moDCs, die mit RAD behandelt wurden,
schlechter in der Lage waren, CD8 + -T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, geht nicht
mit Sicherheit aus dieser Studie hervor, da große spenderabhängige Unterschiede auftraten.
Es wurde zudem ein Vergleich von in vitro aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) und
myeloiden DCs (mDCs) angefertigt. Mittels eines home-made Microarrays, der vor allem
Gene mit einschloss, die für Zytokine und Rezeptoren von Immunzellen kodieren, konnten in
einem Modell der frühen IA in der Lunge differentiell regulierte Gene nach Konfrontation mit
A. fumigatus identifiziert werden. Es wurden insgesamt 30 Gene mehr als 2-fach reguliert,
wie zum Beispiel die Interleukine und Chemokine IL-1β, IL-8, CXCL2, CCL3, CCL4 und
CCL20, der Immunrezeptor PTX3 und der Transkriptionsfaktor Nf-κB. Generell konnte
beobachtet werden, dass moDCs mehr regulierte Gene aufwiesen als mDCs.
Zuletzt wurde betrachtet, ob der Knock-down von CXCL10, dessen Fehlen ein erhöhtes
Risiko für IA nach sich zieht, einen Einfluss auf moDCs hat, so dass sie schlechter auf
A. fumigatus reagieren können. Diese Hypothese konnte in dieser Studie nicht bestätigt
werden, da kein Unterschied in der Zytokinproduktion oder Expression kostimulatorischer
Moleküle zwischen Kontroll-moDCs und moDCs, in denen das CXCL10-Gen ausgeschaltet
wurde, festgestellt werden konnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die Microarray-Analyse wichtige Gene in
moDCs und mDCs identifizierbar waren, die nach Konfrontation mit A. fumigatus reguliert
wurden. Zudem fanden sich lediglich minimale Unterschiede zwischen artifiziellen DCs und
myeloiden DCs, die direkt aus dem Körper isoliert wurden. Eine Behandlung mit RAD erhöht
das Risiko eines Patienten an invasiver Aspergillose zu erkranken unabhängig von der
Eigenschaft des RAD, die Proliferation von T-Lymphozyten zu inhibieren.
- 2 -

2 Summary
2 Summary
Following a stem cell or solid organ transplant immunosuppressed patients have an increased
risk of developing opportunistic infections such as invasive aspergillosis (IA), which is
mainly caused by the most prevalent airborne mold, Aspergillus fumigatus. The diagnosis and
therapy of IA have become increasingly relevant in recent years, making it essential to
understand the mechanisms of the immune system.
The infection generally spreads from the lung. Dendritic cells (DCs), whose major task is to
activate T-lymphocytes, were therefore investigated for their ability to influence the immune
system. 40-0-[2-Hydroxy-ethyl]rapamycin (RAD), a novel immunosuppressive drug, was
analysed for its in vitro influence on the interaction of neutrophils and monocyte-derived
dendritic cells (moDCs) with the pathogenic mould, A. fumigatus. RAD acts by bonding with
the cytosolic FK506 binding protein (FKBP12) causing inhibition of the lipid kinase
mammalian target of rapamycin (mTOR) which in turn results in the repression of T-cell
activation. It is clinically used to prevent graft-versus-host disease or the rejection of solid
organ and bone marrow transplants. RAD-treatment significantly decreased the oxidative
burst of neutrophils after confrontation with A. fumigatus. moDCs were derived from
monocytes through culture with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and
interleukin-4 in the presence or absence of 10 nM RAD. Although there was no difference in
the expression of the surface markers CD1a + , CD14 - and HLA-DR + , RAD had various
modulating effects on the immune function of moDCs. It reduced the expression of innate
immunity receptors (TLR4 and dectin-1) and impaired the maturation capacity of moDCs as
was observed in the reduction of co-stimulatory factors (CD40, CD83 and CD86). CD40
remained significantly reduced even after treatment with A. fumigatus, while CD83 only
exhibit a downstream trend and CD86 did not stay reduced. RAD treatment significantly
reduced the cytokine expression levels of IL-12, TNF-α, and CCL20 after 6 h stimulation of
the moDCs with the mold. This was to some extent confirmed at protein level, where the
same cytokines as well as IL-10 were significantly reduced in RAD-treated moDCs by
comparison with reference cells after 12 h of stimulation with A. fumigatus. The phagocytosis
and binding rate of dextran beads and conidia as well as the damage to A. fumigatus germ
tubes were significantly reduced in DCs treated with the agent. It cannot be determined for
certain whether moDCs under RAD-treatment were also less able to activate CD8 + -T-
lymphocytes because of the wide donor related discrepancies that they displayed.
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2 Summary
A home-made RNA microarray, which included genes coding for cytokines and receptors of
immune cells, was used to identify several differentially regulated genes after confrontation
with A. fumigatus. Furthermore, a comparison between monocyte-derived dendritic cells
(moDCs) and myeloid dendritic cells (mDCs) was performed, revealing that only a few genes
were regulated more than 2-fold and that fewer of these genes occured in mDCs than in
moDCs. Among them were genes, such as the cytokines IL-1β, IL-8, CXCL2, CCL3, CCL4
and CCL20, the immune receptor PTX3 and the transcription factor Nf-κB.
Finally, it was investigated whether the knock-down of the CXCL10-gene in moDCs
potentially impaired the response of the immune cells to A. fumigatus. It is proven that the
lack of CXCL10 results in a higher risk of IA. However, there was no difference in the
cytokine production or the expression of co-stimulatory factors in control moDCs compared
to moDCs treated with CXCL10 siRNA.
In conclusion, important genes which had been up-regulated after confrontation with
A. fumigatus in moDCs and mDCs, were successfully identified. Moreover, treatment with
RAD during the generation of moDCs had a considerable effect on the ability of these cells to
kill A. fumigatus and modulate the immune response. RAD treatment could thus increase the
patient's risk of contracting invasive aspergillosis regardless of the drug's capacity to inhibit
T-cell activation.
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3 Einleitung
3 Einleitung
3.1 Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus ist ein weltweit verbreiteter Schimmelpilz, der der Abteilung der
Ascomycota (= Schlauchpilze) zugeordnet wird. Aspergillus (= Gießkannenschimmel)
bezeichnet eine Gattung von Schimmelpilzen mit aspergillförmigen (lat.: aspergillum;
aspergere = bespritzen) Sporenträgern. Der Name fumigatus leitet sich aus der rauchgrünen
Farbe (lat. fumus = Rauch) des Pilzes ab, die von dem Pigment 1,8-Dihydroxynaphtalin-
Melanin in den Sporen herrührt. A. fumigatus ist ein Saprobiont, der von sich zersetzenden
organischen Substanzen lebt und bei Temperaturen zwischen 12 - 56 °C wächst, wobei er
Temperaturen bis zu 70 °C toleriert (Latgé, 2001). Seit dem letzten Jahrzehnt ist die
Forschung an dem opportunistischen, durch die Luft übertragenen Pathogen A. fumigatus von
zunehmendem Interesse, da er invasive Erkrankungen bei immunsupprimierten Patienten
hervorrufen kann, die oft tödlich verlaufen. Zudem ist A. fumigatus Auslöser schwerer
Allergien (Latgé, 1999).
3.1.1 Lebenszyklus
A. fumigatus gehört zu den sogenannten Deuteromyceten, da lange Zeit ausschließlich ein
asexueller Vermehrungszyklus bekannt gewesen ist. Durch asexuelle Vermehrung werden zur
Verbreitung von A. fumigatus in der Umwelt Sporen (= Konidien) gebildet, die
widerstandsfähig gegen viele Umweltfaktoren, wie hohe Temperaturen und Trockenheit sind.
Sobald Konidien Wärme und Feuchtigkeit ausgesetzt sind, fangen sie an, auszukeimen. Dabei
bilden sich zuerst kurze Keimschläuche, die sich durch weiteres Wachstum zu Hyphen
verzweigen und schließlich ein Geflecht ausbilden, das als Myzel bezeichnet wird. An der
Oberfläche des Myzels formen sich sogenannte Konidiophoren, die bis zu 10 000 neue
Sporen produzieren können (Abb. 3.1A) und durch den Wind in der Luft verteilt werden. In
unseren Breiten befinden sich sowohl in Außen- als auch in Innenräumen ca. 1 – 100
Konidien / m³ Luft.
Durch die vollständige Sequenzierung des Genoms von A. fumigatus wurden die Gene
mating-type-Locus (MAT) 1-1 und MAT1-2 gefunden, die in anderen filamentösen Pilzen
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3 Einleitung
wichtig für die sexuelle Vermehrung sind (Varga, 2003; Paoletti et al., 2005). Im Januar 2009
publizierten Gorman et al., dass A. fumigatus einen kompletten sexuellen Zyklus über
Kleistothezienbildung und Ascosporen aufweist (Abb. 3.1B). Durch sexuelle Vermehrung
wird die genetische Variation erhöht, die es ermöglicht, besser auf Umweltvariabilität zu
reagieren. Zudem kann in den Nachkommen von A. fumigatus durch genetische Variation
eine höhere Pathogenität und Antimykotikaresistenz auftreten (Dyer, Paoletti, 2005).
Abbildung 3.1: Aspergillus fumigatus. Abbildung eines Myzels mit Konidiophoren (A) (Quelle:
http://www.pasteur.fr/recherche/unites/aspergillus/rech1-intro.htm) und des asexuellen (B,
oben) und sexuellen (B, unten) Vermehrungszyklus von A. fumigatus (Quelle:
http://www.fao.org/inpho/content/compend/img/ch31/fig_4_1_4b.jpg).
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3 Einleitung
3.1.2 Pathophysiologie von Aspergillus-Infektionen
Viele Aspergillus-Arten können Krankheiten auslösen, die allgemein als Aspergillosen
bezeichnet werden. Es handelt sich dabei um eine exogene Infektion, da die Aspergillus-
Konidien eingeatmet werden, bevor sie eine Erkrankung verursachen können. Bei gesunden
Personen werden die inhalierten Konidien schnell durch alveolare Makrophagen und
neutrophile Granulozyten zerstört. Ist das Immunsystem geschwächt, wie es nach lang
anhaltender Neutropenie, nach Behandlung mit Corticosteroiden oder zytotoxischen
Substanzen oder bei AIDS-Patienten der Fall sein kann, können die Konidien aufgrund ihrer
Größe (3 µm) leicht in die Lungenalveolen eindringen und dort Krankheiten auslösen.
Allergisch bronchopulmonale Aspergillose (ABPA) ist eine durch Aspergillus verursachte
Erkrankung der Lunge, die häufig in Verbindung mit Asthma oder Mukoviszidose auftritt
(Hinson et al., 1952; Banerjee, Kurup, 2003). Konidien können aber auch bestehende Höhlen
in der Lunge besiedeln, die z.B. als Narbengewebe nach Tuberkulose zurückbleiben, und ein
Aspergillom bilden (Latgé, 1999). Fangen Konidien in den Alveolen an zu keimen und
letztendlich ein Myzel auszubilden, kann Aspergillus invasiv ins Lungengewebe wachsen und
sich in die Blutgefäßen ausbreiten. Der Verlauf dieser Infektion ist gekennzeichnet durch eine
Ausbreitung des Schimmelpilzes in die inneren Organe, unter anderem auch Gehirn und Herz
(Latgé, 2001) und wird als invasive Aspergillose (IA) bezeichnet. Der häufigste Auslöser von
IA, der für ca. 90 % der Fälle verantwortlich ist, ist der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus.
Daneben sind auch A. terreus, A. flavus und A. niger Verursacher von IA. Durch neuartige
Therapien, die eine Immunsuppression des Patienten nach sich ziehen, wie z.B. Stammzell-
oder Organtransplantation, wurde im letzten Jahrzehnt ein Anstieg der Erkrankungen an IA
beobachtet.
Jährlich sind in Deutschland geschätzt nur einige tausend Patienten von einer IA betroffen,
jedoch ist der Krankheitsverlauf oft sehr schwerwiegend. Das Risiko an einer IA zu erkranken
ist mit 42 % der Aspergillosen bei Leukämiepatienten bedeutend höher als nach
Stammzelltransplantation (25,8 %) oder Organtransplantation (13 %) (Herbrecht et al., 2005).
In 50 % der Fälle, bis 95 % in besonderen Situationen, ist die Erkrankung mit IA tödlich
(Latgé, 1999, Denning 1998, Balloy, Chignard, 2009). Hinzu kommt, dass eine frühe
Diagnose für eine erfolgversprechende Therapie von entscheidender Bedeutung ist (Denning,
2000). Deshalb erhält die Diagnose und Therapie dieser Infektion immer größere Bedeutung
(Groll et al., 1996).
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3 Einleitung
3.2 Das Immunsystem in Bezug auf Aspergillus fumigatus
Wird A. fumigatus von einem immunkompetenten Menschen eingeatmet, werden diese von
der mukoziliären Clearance, dem Selbstreinigungsmechanismus der Bronchien, und
Phagozyten neutralisiert. Alveolare Makrophagen machen den größten Anteil an Zellen des
angeborenen Immunsystems in den Alveolen aus und bilden die erste Verteidigung gegen
A. fumigatus. Sie können Konidien z.B. durch Phagozytose und die Produktion von reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) zerstören (Philippe et al., 2003). Neutrophilen Granulozyten spielen
ebenso eine Rolle in der Abwehr von Konidien (Brackhage, 2005). Entkommen Konidien den
Abwehrmechanismen der ersten Verteidigungslinie keimen sie in den Alveolen aus und
wachsen ins Lungenepithel. Dort treffen die Hyphen erneut auf neutrophile Granulozyten und
werden von diesen zerstört. Hyphen werden im Epithelgewebe auch von dendritischen Zellen
(DCs) erkannt, die durch ihre Eigenschaften, den Pilz durch Phagozytose zu zerstören und in
die Lymphknoten abzuwandern und dort das Pilzantigen den T-Lymphozyten zu präsentieren,
essentiell für eine erfolgreiche Abwehr des Pathogens sind. Deshalb soll im Folgenden
genauer auf neutrophile Granulozyten und DCs eingegangen werden.
3.2.1 Neutrophile Granulozyten
Neutrophile Granulozyten gehören der Gruppe der polymorphkernigen Leukozyten (PMNs)
an. Der Name Granulozyten entwickelte sich aus ihrer cytoplasmatischen Granula und dem
unregelmäßig geformten Zellkern. Man unterscheidet drei Arten von Granulozyten –
neutrophile, eosinophile und basophile – aufgrund des unterschiedlichen Färbeverhaltens ihrer
Granula. Eosinophile Zellen sind der primäre Abwehrmechanismus gegen Parasiten, sie
haben aber auch andere Funktionen, z.B. verbinden sie das angeborene und adaptive
Immunsystem, um Gewebeneuaufbau zu kontrollieren (Shamri et al., 2011), wogegen die
Funktion basophiler Zellen noch unbekannt ist. Die größte Gruppe bilden die neutrophilen
Granulozyten. Es sind freibewegliche Phagozyten, die einen wichtigen Bestandteil des
angeborenen Immunsystems darstellen. Neutrophile können Pilzstrukturen phagozytieren und
zerstören sie effektiv in intrazellulären Vesikeln mit Hilfe von Enzymen, die in der Granula
gespeichert werden. Sind die Pilzstrukturen zu groß, um phagozytiert zu werden, wenden
Neutrophile andere Mechanismen an, um sie abzutöten. Auf einen dieser Effektor-
mechanismen soll im Folgenden genauer eingegangen werden.
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3 Einleitung
Neutrophile Granulozyten haben die Fähigkeit, toxische Substanzen zu produzieren, zum
Beispiel Sauerstoffderivate, Stickoxid und antimikrobielle Peptide (Defensine und kationische
Proteine). Es wurde beobachtet, dass bei einer Konfrontation von Neutrophilen mit
Pathogenen vermehrt Wasserstoffperoxid (H2O2) gebildet wird (Iyer et al., 1961; Babior et al.,
1973). Daraus entwickelte sich der Name respiratorische Entladung oder oxidativer Burst.
Das membranassoziierte Enzym NADPH-Oxidase spielt eine zentrale Rolle beim oxidativen
Burst, indem es durch Elektronenübertragung molekularen Sauerstoff in das Superoxidanion
(O2 - ) umwandelt. O2 - kann in andere Oxidantien umgewandelt werden, worunter sich z.B.
Wasserstoffperoxid (H2O2), Peroxynitrit (ONOO-), hypochlorige Säure (HOCl) oder
Nitrylchlorid (NO2Cl) befinden. Da diese Oxidantien hochreaktiv sind, können sie DNA,
Proteine und Lipide des Pilzes schädigen. Der oxidative Burst der Neutrophilen wird vor
allem durch Zellwandbestandteile von A. fumigatus, wie das β-Glucan, induziert. Neuere
Studien haben gezeigt, dass hauptsächlich β-1,6-Glucan, das im Aufbau der Zellwand seltener
vorkommt, und nicht das vorherrschende β-1,3-Glucan, die Stimulation der Neutrophilen
reguliert (Rubin-Bejerano et al., 2007).
A. fumigatus besitzt verschiedene Mechanismen, um sich vor den reaktive Sauerstoffspezies
(ROS) der Neutrophilen zu schützten. Konidien haben einen hydrophoben Pigmentfarbstoff,
der die Produktion von ROS verhindert (Jahn et al., 2000). Der Pigmentfarbstoff beeinflusst
auch die Virulenz und die Antimykotikaresistenz des Pilzes, da er möglicherweise dazu
beitragen kann, die durch pathogenassoziierte molekulare Muster (PAMPs) induzierte
Zytokinfreisetzung vor dem Immunsystem zu verbergen (Brakhage et al., 1999; Chai et al.,
2010). Zusätzlich besitzt A. fumigatus Katalasen, die als Schutzmechanismen gegen
Wasserstoffperoxid wirken, wie z.B. die Superoxiddismutase (Hamilton, Holdom, 1999;
Shibuya et al., 2006; Lessing et al., 2007).
3.2.2 Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DCs) sind Phagozyten mit langen, fingerförmigen Fortsätzen, ähnlich
den Dendriten der Nervenzellen (Abb. 3.2). Sie sind sehr langlebig und kommen in den
meisten Geweben dauerhaft vor. Steinman und Cohn beschrieben 1973 als erste die
Fähigkeiten von DCs, das Immunsystem zu regulieren. Unreife DCs nehmen partikuläres
Material, extrazelluläre Flüssigkeiten und deren Inhaltsstoffe durch rezeptorvermittelte
Endozytose, die sich in Makropinozytose und Phagozytose unterteilen lässt, auf. Sobald sie
auf einen Mikroorganismus oder lösliche Antigene treffen, werden diese von den DCs
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3 Einleitung
prozessiert und präsentiert. Dadurch reifen die DCs aus, wodurch sich ihre Expression an
Haupthistokompatibilitätskomplex (=MHC)-Proteinen und kostimulatorischen B7-Molekülen
(CD80/CD86) erhöht, und sie verlieren ihre phagozytotische Aktivität (Garrett et al., 2000;
West et al., 2000). Die Antigene werden auf der Zelloberfläche als sogenannte Peptid-MHC-
Komplexe präsentiert, weshalb DCs zur Gruppe der antigenpräsentierenden Zellen (APCs)
gehören. Auch Makrophagen und B-Lymphozyten können Antigene präsentieren und gehören
der Gruppe der APCs an.
Abbildung 3.2: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme humaner dendritischer Zellen (40x). Die
Zellkerne wurden mit DAPI in blau angefärbt, das Actin-Filament mit Alexa Fluor 568
Phalloidin in rot. Quelle: angefertigt am Institut für Hygiene und Mikrobiologie von Andrea
Villwock, AG Kurzai.
Durch die Präsentation von Antigenen können DCs unter anderem T-Lymphozyten zur
Proliferation anregen. CD8 + -T-Lymphozyten können Peptide erkennen, die von MHC-Klasse-
I-Molekülen der DCs präsentiert werden, CD4 + -T-Lymphozyten Peptide, die von MHC-
Klasse-II-Molekülen der DCs präsentiert werden. Zur Aktivierung von naiven
T-Lymphozyten ist zur Präsentation über MHC-Moleküle ein zusätzliches Signal durch
kostimulatorische Moleküle essentiell, die auf der Oberfläche von ausgereiften DCs
exprimiert werden (Théry, Amigorena, 2001). Es handelt sich um die Transmembran-
glykoproteine B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86). Zudem wird nach Kontakt mit einem Pathogen
in DCs der nuclear factor κB (NF-κB) aktiviert, was die Ausschüttung von Zytokinen zur
Folge hat, die als Botenstoffe des Immunsystems sowohl das angeborene als auch das
adaptive Immunsystem beeinflussen. CD4 + -T-Lymphozyten differenzieren sich zum Beispiel
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3 Einleitung
abhängig vom Zytokinprofil nach Aktivierung durch DCs in eine der CD4 + -Untergruppen
(TH1, TH2 oder TH17) aus (Ni, O'Neill, 1997).
DCs werden in zwei Subpopulationen unterteilt, plasmacytoide dendritische Zellen (pDCs)
und myeloide dendritische Zellen (mDCs). Sie unterscheiden sich im Ursprung, dem
Phänotyp, dem Vorkommen und in ihren Aufgaben. pDCs exprimieren unter anderem die
Marker IL-3R, BDCA-2, Toll-like Rezeptoren (TLR) 7 und TLR9 (Liu, 2005). TLR7 und
TLR9 erkennen beide Nukleinsäure-ähnliche Strukturen und werden nicht auf der Oberfläche
exprimiert. pDCs sind auf Virusinfektionen spezialisiert und können nach Kontakt große
Mengen Typ I Interferone (IFN) freisetzen (Colonna et al., 2004) und T-Lymphozyten gegen
virale Antigene zur Proliferation anregen. mDCs bilden die weit größere Gruppe, die sich
noch weiter in lymphoide und nicht-lymphoide mDCs unterteilen lässt, und exprimieren die
Oberflächenmarker CD1c, CD11c (O'Doherty et al., 1994) sowie bevorzugt TLR2, TLR3 und
TLR4. Eine genaue Auflistung der exprimierten Oberflächenmarker kann bei Piccioli et al.
(2007) nachgelesen werden. Lymphoide mDCs zirkulieren im Blut, bis sie auf ein Pathogen
treffen, ausreifen und in das Lymphknotengewebe einwandern, wo sie T-Lymphozyten zur
Proliferation anregen, während nicht-lymphoide mDCs in verschiedenen Geweben, wie
Lunge, Herz oder Nieren, zu finden sind.
3.2.3 Rezeptoren zur Erkennung von Aspergillus fumigatus
Die Zellwand von A. fumigatus dient zum Schutz des Pilzes vor der Umwelt und dem
Immunsystem, ist aber auch die Quelle der meisten Antigene. Sie setzt sich aus den
Polysacchariden α- und β-(1,3)-Glucan, Chitin, Galactomannan und β-(1,3),(1,4)-Glucan
zusammen.
Die Erkennung eines Pathogens geschieht mittels Mustererkennungsrezeptoren (PRR, pattern
recognition receptors), wobei die Toll-like Rezeptoren (TLR) eine zentrale Rolle einnehmen.
Ursprünglich wurde Toll in der Taufliege Drosophila melanogaster entdeckt, wo er eine
Funktion in der Entwicklung innehat. Später fand man heraus, dass der Toll Signalweg
wichtig für die Immunität gegen Pilze ist (Lemaitre et al., 1996). 1997 wurde das erste
Homolog von Toll im Menschen entdeckt, welches heute als TLR4 bezeichnet wird
(Medzhitov et al., 1997). Im Menschen wurden bisher 10 verschiedene TLRs über
Datenbanken identifiziert (Rock et al., 1998; Akira, Takedo, 2004). Sie sind Typ1 integrale
Membranglykoproteine, die zu einer größeren Superfamilie gehören, die den Interleukin-1
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3 Einleitung
Rezeptor (IL-1Rs) mit einschließt. Sie dienen jeweils zur Erkennung anderer
pathogenassoziierter molekularer Muster (sog. PAMPs, pathogen associated molecular
patterns). Eine genaue Auflistung der Funktionen der einzelnen TLRs findet sich in Tab. 3.1.
Tabelle 3.1: Toll-like Rezeptoren und ihre Funktionen.
Toll-like Rezeptor Ligand
TLR1:TLR2
Heterodimer
TLR2:TLR6
Heterodimer
Peptidoglykan Lipoproteine,
Liporabionomannan (Mycobakterium), GPI
(T. cruzi), Zymosan (Hefe)
TLR3
TLR4 Dimer (plus
MD-2 und CD14)
TLR5
TLR7
TLR8
TLR9
TLR10
dsRNA (Viren), poly I:C (synthetisch)
LPS (Gramnegative Bakterien),
Lipoteichonsäuren (grampositive Bakterien)
Flagellin (Bakterien)
ssRNA (Viren)
Oligonucleotide mit hohem G-Gehalt (Viren)
nichtmethylierte cpG-DNA (Bakterien / Viren)
unbekannt
Eine inflammatorische Immunantwort auf A. fumigatus wird beispielsweise über die
Rezeptoren TLR2 und TLR4 ausgelöst. Zunächst wurde von Wang et al. (2001) demonstriert,
dass TLR4 und CD14 in humanen Monozyten wichtig für die Erkennung von A. fumigatus
sind, über die auch LPS erkannt wird. Dies wurde erneut in humanen embryonalen
Nierenzellen (HEK-293, human embyonic kidney cells) und in murinen Makrophagen von
Meier et al. (2003) bestätigt, die für die Erkennung von A. fumigatus eine Rolle von sowohl
TLR4 als auch TLR2 nachweisen konnten, aber nicht von weiteren TLR-Proteinen (TLR1,
TLR3, TLR5-10). Nach Infektion mit A. fumigatus wurde in TLR2 knockout-Mäusen
beobachtet, dass die Produktion des inflammatorischen Zytokins TNF-α nachlässt (Mambula
et al, 2002), was sich in der humanen THP-1 Zelllinie wiederholen ließ.
Alle TLRs besitzen einen gemeinsamen Signalweg, in dem durch das Adapterprotein
myeloider Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) eine Signalkaskade ausgelöst wird, welche zur
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3 Einleitung
Aktivierung von NF-κB führt. Dadurch werden schließlich pro-inflammatorische Zytokine,
vor allem TNF-α und IL12, freigesetzt (Barton, Medzhitov, 2003; Akira, Takeda, 2004;
Beutler, 2004). Die MyD88 Signalkaskade trägt zur Abwehr von A. fumigatus bei und das
MyD88 abhängige Signal auf DCs wird für eine TH1-Antwort gegen A. fumigatus benötigt
(Bellocchio et al., 2004). Es gibt aber auch MyD88 unabhängige Signalkaskaden, z.B. kann
TLR4 über das Adapterprotein TRIF (Toll/IL-R1-domain-containing adapter-inducing
interferon-β) IRF3 (Interferon (IFN)-regulierender Faktor) anregen und es kommt zur
Aktivierung von NF-κB und somit zur Expression von IFN-β (Akira, Takeda, 2004)
(Abb.3.3).
Abbildung 3.3: Reaktionswege vom Toll-like Rezeptor 4 (TLR4). Die Stimulation von TLR4
resultiert in der Anbindung von MyD88 (myeloider Differenzierungsfaktor 88). Dadurch
wird eine Signalkaskade ausgelöst, die letztendlich NF-κB freigesetzt, das in den Zellkern
wandert und die Transkription verschiedener Gene anregt. (B) Bei TLR4 gibt es zusätzlich
eine MyD88 unabhängige Signalkaskade, um die Produktion des antiviralen Proteins IFN-β
zu stimulieren. Über das Adapterprotein TRIF wird IRF3 (Interferon (IFN)-regulierender
Faktor) angeregt und es kommt zur Aktivierung von NF-κB und somit zur Expression von
IFN-β (Quelle: Akira, Takeda, 2004).
Anhand einer höheren Infektionsrate an IA bei PTX3-Null Mäusen (Garlanda et al., 2002)
wurde die Bedeutung von Pentraxin3 (PTX3) an der Erkennung von A. fumigatus identifiziert.
Mezger et al. (2008-1) konnten zeigen, dass die PTX3-Expression nach Konfrontation mit
A. fumigatus Keimschläuchen stark hochreguliert wurde.
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3 Einleitung
Zudem konnten C-Typ Lektine (CLRs oder CLECs) auf Makrophagen und dendritischen
Zellen als Rezeptoren zur Detektion von A. fumigatus identifiziert werden. Dazu gehören DC-
SIGN (dendritic-cell specific, ICAM-3-grabbin nonintegrin) (Serrano-Gómez et al., 2004),
welches Galactomannan bindet, und Dectin-1, auch bekannt als CLEC7a (Steseele et al.,
2005; Mezger et al. 2008). Dectin-1 gehört zu den TypII Transmembranrezeptoren, die eine
einzige Kohlenhydraterkennungsdomäne besitzen, und ist bekannt als ein Rezeptor für
β-(1,3)-Glucan (Ariizumi et al., 2000; Brown, Gordon, 2001; Brown, 2006). Ein
Oligosaccharidmicroarray hat gezeigt, dass Dectin-1 spezifisch an das β-(1,3)-Glucan bindet
(Palma et al., 2006).
Als weiterer Rezeptor für A. fumigatus, dessen Lektindomäne an β-Glucan bindet, ist der
Komplementrezeptor 3 (CD11 / CD18) zu nennen, der auch als CR3 bezeichnet wird
(Thornton et al., 1996). CR3 kann die Chemotaxis von Neutrophilen in vitro (Tsikitis et al.,
2004) und in vivo (LeBlanc et al., 2006) und ebenso den oxidativen Burst beeinflussen
(Lavigne et al., 2006). Außerdem bindet β-Glucan an Lactosylceramid (Zimmermann et al.,
1998) und den Scavanger-Rezeptor (Pearson et al., 1995).
3.2.4 Zytokine
Zytokine sind kleine Proteine (etwa 25 kDa), die von Zellen, z.B. DCs, nachdem sie ein
Pathogen phagozytiert und intrazellulär abgebaut haben, produziert und durch spezielle
Rezeptoren anderer Zellen erkannt werden. So dienen sie zur Kommunikation zwischen den
Zellen, können aber auch die Zelle beeinflussen, die sie freigesetzt hat. Zytokine sind
wichtige Mediatoren bei Verletzung und Infektion (Heinrich et al., 1998). Man kann Zytokine
in die fünf Hauptgruppen der Interferone, Interleukine, kolonie-stimulierenden Faktoren,
Tumornekrosefaktoren und Chemokine unterteilen.
Chemokine lösen einen Vorgang aus, den man als Entzündung bezeichnet. Sie locken
Moleküle und Zellen des angeborenen Immunsystems zum Infektionsherd und aktivieren
Lymphozyten, die eine adaptive Immunabwehr auslösen. Ihr Name wurde aus diesen
chemotaktischen Eigenschaften abgeleitet. Zudem werden sie abhängig von der Anordnung
der zwei N-terminalen Cysteine in zwei Gruppen aufgeteilt, je nachdem, ob zwischen den
ersten beiden Cysteinen eine Aminosäure ist (CXC) oder die ersten beiden Cysteine direkt
aneinander hängen (CC) (Zlotnik, Yoshie, 2000). In Bezug auf A. fumigatus sind die beiden
Chemokine (C-X-C motif) Ligand 10 (CXCL10) und (C-C motif) Ligand 20 (CCL20)
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3 Einleitung
relevant. Denn das Vorkommen von Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) im CXCL10-
Gen hat einen entscheidenden Einfluss auf das Risiko, an invasiver Aspergillose zu erkranken
(Mezger et al., 2008-2). CXCL10 wurde ursprünglich durch seine Expression in Monozyten
gefunden, die mit IFN behandelt wurden (Luster et al., 1985). Es ist ein Mediator der
inflammatorischen Immunantwort, das durch Interferon-gamma (IFN-γ), aber auch durch
Lipopolysaccharid (LPS), induziert wird (Ohmori, Hamilton, 1990). Ein alter Name für
CXCL10 ist deshalb auch IFN-inducible protein 10 (IP-10). Dieses Zytokin löst eine
TH1-Antwort aus, eine Erhöhung der T-Zell-Adhäsion an Endothelzellen (Luster, Leder,
1993; Taub et al., 1993) und ist außerdem ein chemischer Lockstoff für Monozyten. Alle
Rezeptoren von Chemokinen gehören zu der 7-transmembran G-Protein gekoppelten Klasse
der Rezeptoren (Phadke, Mehrad, 2005). CXCL10 bindet an den spezifischen Rezeptor
CXCR3 (Loetscher et al., 1996).
CCL20 ist das nach einer Konfrontation mit A. fumigatus am stärksten hochregulierte Gen
(Mezger et al., 2008-1). Dieses Chemokin wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen
unabhängig voneinander als ein neuartiges Chemokin identifiziert und hatte die Namen liver
activation regulated chemokine (LARC), da es in der Leber exprimiert wird (Hieshima et al.,
1997), und human macrophage inflammatory protein 3α (MIP-3α), da es in Geweben
exprimiert wird, in denen Entzündungsreaktionen ablaufen (Rossi et al., 1997). Die Synthese
von CCL20 wird durch IFN und LPS induziert und durch das Zytokin IL10 unterdrückt. Auf
Monozyten hat es keine chemotaktischen Effekte, dagegen auf Lymphozyten (CD4 + -, CD8 + -
T-Lymphozyten und B-Lymphozyten) und in schwächerer Form auf Granulozyten. Auf
diesen Zellen befindet sich der Chemokinrezeptor 6 (CCR6), der spezifisch CCL20 bindet
(Baba et al., 1997; Williams et al., 2006).
Eines der ersten Zytokine, das nach Kontakt zu einem Pathogen ausgeschüttet wird, ist der
Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α). Er wird hauptsächlich von Monozyten und Zellen, die
sich aus ihnen ableiten, wie alveolare Makrophagen oder DCs, produziert und bindet an die
Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2, die über eine Signalkaskade NF-κB aktivieren. Viele
Funktionen teilt TNF-α auch mit Interleukin-1β (IL1β) und Interleukin-6 (IL6) (Dinarello et
al., 1986; Andus et al., 1988; Ramador et al., 1988). Man nennt diese Substanzen auch
Pyrogene, da sie nach einer Infektion eine Erhöhung der Körpertemperatur bewirken. Sie
lösen die Akute-Phase-Reaktion (APR) aus, in der von Leberzellen Proteine produziert
werden, die Erreger binden, zum Beispiel Serumamyloidprotein (SAP), C-reaktives Protein
(CRP), Fibrinogen und das mannosebindene Lektin (MBL) (Ceciliani et al., 2002).Ein
weiteres pro-inflammatorisches Zytokin, das nach Kontakt von Immunzellen mit A. fumigatus
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3 Einleitung
gebildet wird, ist IL12. Es wird von dendritischen Zellen produziert, um natürliche
Killerzellen zu aktivieren und die Differenzierung von CD4 + -T-Lymphozyten zur TH1-
Subpopulation anzuregen. Im Mausmodell wurde bereits beobachtet, dass die Ausschüttung
von den Zytokinen TNF-α, IFN-γ und IL12, die eine TH1-Antwort bedingen, eine Resistenz
gegen A. fumigatus bewirken kann (Cenci et al., 1997; Cenci et al., 1998; Cenci et al., 1999).
Dahingegen fördern die Zytokine IL4 und IL10 die Bildung von CD4 + -TH2-Lymphozyten und
somit ein Fortschreiten der Krankheit. Außerdem konnte gezeigt werden, dass bei Mangel an
TNF-α die Abtötung der Pilze reduziert war und somit die Sterberate anstieg (Mehrad et al.,
1999).
3.3 Modellsysteme
3.3.1 In vitro generierte dendritische Zellen
In vitro können aus isolierten Monozyten (CD14 + ) unter Zugabe von GM-CSF und IL4 in
Zellkulturmedium mit fetalem Kälberserum (FCS) unreife dendritische Zellen generiert
werden (moDCs) (Sallusto, Lanzavecchia, 1994; Grigoleit et al., 2002; Ahn, Agrawal, 2005).
CD1 Membranproteine werden als humane DC-Marker gewählt, da sie früh in der
Entwicklung von DCs exprimiert werden (Brigl, Brenner, 2004). moDCs exprimieren in
hohem Maße CD1a, CD1b und CD1c, weisen aber wenig CD1d auf (Spada et al., 2000).
Für T-Zell-Proliferationsassays ist es notwendig, in serumfreiem Medium unter GMP-
Bedingungen (Good Manufacturing Practice; Gute Herstellungspraxis) zu arbeiten, da dieser
Assay von klinischer Relevanz ist. Die Zukunft dieses experimentellen Ansatzes sieht vor,
einem Patienten mit invasiver Aspergillose Donor-Lymphozyten, die bereits Antigene von
A. fumigatus aufweisen, zu injizieren (Bozza et al., 2004; Shao et al., 2005). Dazu gibt es
Hinweise darauf, dass moDCs das FCS den T-Lymphozyten als lösliches Antigen
präsentieren können (Weksler et al., 1978). Aber bei der Generierung von moDCs mit
humanem Serum oder Plasma statt FCS wird die Expression der CD1 Marker durch die
Phospholipide Cardiolipin und Lysophosphatidylsäure unterdrückt, was einen Einfluss auf die
Proliferation CD1-spezifischer T-Lymphozyten hat (Leslie et al., 2008). Durch Zugabe von
Heparin kann bei der Generierung dendritischer Zellen aus Monozyten der Anteil CD1a + -
Zellen konzentrationsabhängig erhöht werden, da es die Bindung der Monozyten von IL4
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3 Einleitung
steigert (Xia, Kao, 2002; Dekker et al., 2007). DCs, die unter Einfluss von Heparin generiert
werden, zeigen eine höhere IL10 und weniger IL12 Produktion. Ob CD1a + -Zellen wirksamer
sind, allogene und autologe CD4 + -T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, wird
kontrovers diskutiert (Chang et al., 2000; Pietschmann et al., 2000; Xia, Kao, 2002). Xia und
Kao (2002) konnten zeigen, dass DCs, die unter dem Einfluss von Heparin generiert wurden,
naive CD4 + -T-Lymphozyten besser anregen konnten als unbehandelte Zellen. Sowohl CD1a -
als auch CD1a + DCs kommen in vivo vor, wobei erstere sich durch ihre Fähigkeit zur
Internalisierung von Antigenen auszeichnen, letztere durch ihre Fähigkeit, hohe Mengen an
IL12-p70 und CCL1 zu produzieren (Gogolak et al., 2007).
3.3.2 Modell der frühen invasiven Aspergillose in der Lunge
Um die Pathogenese invasiver Aspergillose besser zu untersuchen, kann mit einem in vitro
Modell des humanen Lungengewebes gearbeitet werden. Das Modell besteht aus einem
Bilayer aus humanen alveolaren Epithelzellen (A-549) und humanen Endothelzellen (Human
Pulmonary Artery Endothelial Cell, HPAEC). In diesem Modell wird darauf geachtet, die
Umgebung im Organismus mit verschiedenen Medien nachzustellen. So wird den
Endothelzellen FCS gegeben, wodurch das Blut simuliert wird. Außerdem ermöglicht FCS
die Bindung von Reagenzien an Proteine, wie es klinisch und in vivo beobachtet wurde. Das
Epithelgewebe wird ohne FCS kultiviert, da in vivo in den Alveoli kein Albumin vorkommt.
Dieses Modell wurde zuerst entwickelt, um Vorgänge während einer Infektion mit
Mycobacterium tuberculosis zu untersuchen (Birkness et al., 1999; Bermudez et al., 2002).
Hope et al. (2007) konstruierten daraus ein Modell, um frühe IA besser zu untersuchen, da ein
Überblick über die Keimung der Pilzsporen und das darauf folgende Durchbrechen der
Alveolarepithelzellen von den Hyphen in die Endothelzellen dargestellt wird (Abb. 3.4).
Deshalb kann durch dieses Modell die humane Pathogenese nachgestellt werden. Die
biologische Validierung dieses Modells wurde erreicht, indem der Galactomannanlevel im
Überstand der Epithelzellen bzw. Endothelzellen mit dem Level dieses Antigens in der Lunge
und im Blut von Kaninchen verglichen wurde. In das Modell können auch verschiedene
Primärzellen zugegeben werden, zum Beispiel Makrophagen oder dendritische Zellen, die
natürlicherweise im Lungengewebe vorkommen, und somit kann der Einfluss dieser Zellen
untersucht werden. Es wurde bereits festgestellt, dass Makrophagen in der Lage sind, die
Keimung von A. fumigatus zu verzögern (Hope et al. 2007).
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3 Einleitung
Abbildung 3.4:Schematische Darstellung des in vitro Modells der frühen IA in der Lunge.
Darstellung der Membran, die A-549 Zellen von HPAEC trennt, und der Aspergillus
Morphologien, die auf die Membran hinzugefügt werden und die Membran infiltrieren.
3.4 Immunsuppressiva
Immunsuppressiva sind Medikamente, die das Immunsystem unterdrücken. Sie werden nach
Stammzell- oder Organtransplantation, bei einer Autoimmunerkrankung oder allergischem
Asthma eingesetzt. Der große Nachteil ist, dass sie ein sehr breites Wirkungsspektrum haben,
weshalb neue Studien sich damit befassen, monoklonale Antikörper zur Immunsuppression
einzusetzen (Murphy et al., 2008).
3.4.1 Überblick über gängige Immunsuppressiva
Diverse Substanzen, die sich in drei größere Gruppen unterteilen lassen, können
immunsuppressiv wirken. Darunter finden sich Glucocorticoide, z.B. Prednisol, Cortisol und
Corticosteron, zytotoxische Medikamente, z.B. Azathioprin, Mycophenolsäure und
Cyclophosphamide, sowie Pilz- und Bakterienderivate, z.B. Cyclosporin A, Tacrolimus und
Rapamycin. Neuere Forschungen haben ergeben, dass DCs von Medikamenten aller drei
Gruppen an unterschiedlichen Stellen in ihrer Funktion, T-Lymphozyten zu aktivieren,
gehemmt werden (Hackstein, Thomson, 2004).
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3 Einleitung
Corticosteroide sind sehr wirksame anti-inflammatorische Medikamente, die vor allem
Monozyten, Makrophagen und CD4 + -T-Lymphozyten beeinflussen (Abe, Thomson, 2003).
Steroide können am Steroidrezeptorkomplex, der im Cytoplasma anzutreffen ist, binden,
indem sie ein Chaperon ersetzten, wodurch das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) freigesetzt
wird. Danach sind sie in der Lage, in den Zellkern einzudringen und dort die Transkription
spezifischer Sequenzen anzuregen oder mit NF-κB zu interagieren und folglich die
Transkription der Zielgene von NF-κB zu inhibieren. Eingesetzt werden Corticosteroide vor
allem bei Autoimmunerkrankungen oder Organtransplantationen.
Zytotoxische Substanzen inhibieren die DNA Synthese und wirken auf die Zellteilung. Vor
einer Stammzelltransplantation werden sie in hoher Dosis eingesetzt, um alle Lymphozyten
zu eliminieren, die gerade in der Zellteilung sind. In niedriger Dosis wirken sie zusammen mit
Corticosteroiden immunsupprimierend. Mycophenolsäure ist eine solche zytotoxische
Substanz, die in der Lage ist, die Synthese von Purin, einem wichtigen Bestandteil der DNA,
zu unterdrücken, indem es das Enzym Inosin-monophosphat-Dehydrogenase inhibiert
(Sintchak et al., 1996).
Pilz- und Bakterienderivate wirken vor allem auf Lymphozyten, sind durch ihre willkürlichen
Nebeneffekte aber oft toxisch für die Nieren und andere Organe. Cyclosporin A und
Tacrolimus zeigen ein ähnliches Wirkungsspektrum, da beide den Calcineurin Signalweg, der
auch als Signal I (gemäß der zuletzt entwickelten Nomenklatur von Charles Janeway)
bezeichnet wird, inhibieren (Neuhaus et al., 2001). Signal I bewirkt einen intrazellulären Ca 2+ -
Anstieg. Bindet Calcineurin an diese Ca 2+ -Ionen, wird es aktiviert und setzt in den T-Zellen
die Transkriptionsfaktoren für IL2, IL4 und IL6, die die Proliferation der T-Zellen regulieren,
frei (Murphy et al., 2008). Durch die Bindung von Cyclosporin A oder Tacrolimus an
Calcineurin wird verhindert, dass dieses durch Ca 2+ aktiviert werden kann, und dadurch wird
das IL2 Signal unterdrückt (Liu et al., 1991). Des Weiteren wurde beobachtet, dass
Cyclosporin A auch die Maturierung von DCs inhibieren kann (Duperrier et al., 2002).
Rapamycin oder sein Derivat RAD werden den Patienten oft zusammen mit Tacrolimus und
Cyclosporin A verabreicht. Da sich ein Großteil dieser Dissertation mit RAD befasst, wird im
Folgenden intensiv darauf eingegangen.
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3 Einleitung
3.4.2 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD)
40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD; Handelsname: Everolimus; Abb. 3.5) ist ein neues
immunsuppressives Medikament, welches von der Firma Novartis ursprünglich als Mittel
gegen Tumore entwickelt wurde (Houghton, 2010). RAD ist ein Derivat von Rapamycin
(RAPA, Sirolimus), das natürlich in dem Bakterium Streptomyces hygroscopicus vorkommt.
Da S. hygroscopicus auf den Osterinseln entdeckt wurde, leitet sich der Name Rapamycin von
dem polynesischen Wort für Osterinseln (=Rapa Nui) ab.
Abbildung 3.5: Chemische Struktur von RAD. Rot ist der Teil markiert, der im Vergleich zu
Rapamycin chemisch verändert wurde.
In seinen chemischen Eigenschaften wird Rapamycin als ein weißer, kristalliner,
wasserunlöslicher Feststoff klassifiziert, der aber z.B. in Methanol, Ethanol oder Aceton
löslich ist (Sehgal et al., 1975). Vénzia et al. (1975) fanden heraus, dass Rapamycin schon in
geringer Konzentration (0,02 bis 0,2 µg / ml) gegen Candida albicans wirkt. Seine Wirkung
auf Microsporum gypseum (12,5 µg / ml) und Trichophyton granulosum (>1000 µg / ml) war
hingegen schwächer. Die ursprüngliche Wirkungsweise von RAPA ist somit antimykotisch,
aber schnell wurden seine immunsuppressiven Eigenschaften erkannt (Martel et al., 1977),
wodurch RAPA in letzter Zeit in der Medizin eine immer bedeutsamere Rolle als
Immunsuppressivum bekam. Auch sein Derivat RAD wurde vor kurzem von der U.S. Food
and Drug Admnistration (FDA) zur klinischen Anwendung freigegeben. Es darf nach
Nierentransplantation oder bei Nierenzellkarzinom eingesetzt werden (Gabardi, Baroletti,
2010; Houghton, 2010).
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3 Einleitung
Rapamycin bindet an die FKBP-Familie der Immunophiline, genauer an das zytosolische
Protein FK506 binding protein Tacrolimus (FKBP12), da es eine homologe Struktur zum
Liganden hat. FK506, der Namensgeber von FKBP12, ist ein Immunsuppressivum, das
parallel zu RAPA entdeckt wurde (Kino et al., 1987) und große strukturelle Ähnlichkeiten zu
RAPA aufweist (Findlay, Radics, 1980; Tanaka et al., 1987). Der Rapamycin:Immunophilin
Komplex inhibiert eine Serin/Threonin-Kinase, auch bekannt als mTOR (= mammalian target
of rapamycin). mTOR ist ein Teil des Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) / Proteinkinase B
(Akt) Signalwegs, der abhängig von der intrazellulären Kinase Ras ist und somit in der
T-Lymphozyten-Aktivierung auf das Signal III wirkt. Wird der PI3K/Akt Signalweg nach
Bindung von IL2 an den IL2 Rezeptor blockiert, wird die Bildung von Transkriptionsfaktoren
und damit die T-Zellproliferation unterdrückt, da die Zellen in der G1-Phase bleiben und
durch Apoptose absterben (Bierer et al., 1990; Dumont et al., 1990; Metcalfe, Milner, 1991).
RAPA inhibiert zudem die IL-2-abhängigen p33 cdk2 - und p34 cdc2 -Kinasen, die ebenfalls an
dem Übergang von der G1-Phase zur S-Phase beteiligt sind (Morice et al., 1993-1; Morice et
al., 1993-2). Bisher wird davon ausgegangen, dass RAD das gleiche Wirkungsspektrum
besitzt wie RAPA, da es die gleichen downstream-Effekte bei Signal III zeigt (Neuhaus et al.,
2001).
Obwohl die immunsupprimierende Wirkung vor allem auf die T-Lymphozyten zielt, wurde
entdeckt, dass RAPA auch direkte Effekte auf Neutrophile, Makrophagen und dendritische
Zellen hat. Eine frühe Studie ging davon aus, dass RAPA nicht die Maturierung (CD40, CD80
und CD86) in murinen bone-marrow derived DCs (BM-DCs), aber die allo-stimulatorische
Aktivität, wobei hier nur IFN-γ und nicht IL12 betroffen war, inhibierte (Chiang et al., 2002).
Ebenso wurde für humane DCs beobachtet, dass RAPA keine Inhibition der Differenzierung
oder durch CD40-Liganden induzierte Reifung auslöst aber dafür Apoptose in moDCs
induzierte (Woltman et al., 2001; Woltman et al., 2003). Im Vergleich dazu zeigte eine Studie
über murine BM-DCs, dass die IL4 abhängige Reifung der Oberflächenmarker nach 7 Tagen
Generierung der Zellen unter Einfluss von RAPA deutlich reduziert war (Hackstein et al.,
2003). In humanen moDCs wurde auch eine Reduktion in den Reifemarkern festgestellt und
eine Reduktion der Zytokine IL12 und IL10 gefunden (Monti et al., 2003; Feodirc, Krishnan,
2008). Außerdem ist sowohl in murinen als auch in humanen DCs die Endozytose von FITC-
gefärbtem Dextran, die über den Mannoserezeptor (MR) reguliert wird, reduziert (Monti et
al., 2003; Hackstein et al., 2002).
- 21-

3 Einleitung
3.5 Ziele der Arbeit
Für klinisch eingesetzte Substanzen ist es wichtig zu wissen, welche Risiken sie aufweisen.
RAD wirkt immunsuppressiv ohne nephrotoxisch zu sein. Deshalb wird es klinisch eingesetzt
um der Graft-versus-Host-Reaktion (= GvHD, Transplant-Wirt-Reaktion, Graft-versus-Host-
Disease) vorzubeugen, oder um die Abstoßung nach Organtransplantation oder
Stammzelltransplantation zu verhindern. Dadurch kann es jedoch zu einem erhöhten Risiko
für opportunistische Infektionen, wie invasiver Aspergillose, kommen. Deshalb wurde in
dieser Arbeit der Einfluss von RAD auf den oxidativen Burst neutrophiler Granulozyten, die
mit alveolaren Makrophagen die erste Verteidigungslinie gegen A. fumigatus bilden, und auf
moDCs, welche die Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem bilden,
untersucht. In Bezug auf die moDCs war von Interesse, ob ein 7 tägiger Einfluss von RAD
während der Generierung der moDCs aus Monozyten nach Konfrontation mit A. fumigatus:
1. die Differenzierung und Reifung der moDCs reduziert.
2. die Zytokinantwort beeinflusst.
3. die Expression der Rezeptoren für A. fumigatus verändert.
4. die Phagozytose und das Killing der moDCs reduziert.
Um die Pathogenese der frühen IA nachzustellen, wurde ein Modell aus zwei Zelllinien
betrachtet. Durch Zugabe von dendritischen Zellen in dieses Modell konnte die Bedeutung der
Zellen in der Abwehr von A. fumigatus nachgewiesen werden.
- 22-

4 Materialien
4 Materialien
Unter Materialien sind die für die Durchführung der Versuche benötigten gebrauchsfertigen
Substanzen, sogenannte Kits, Oligodesoxyribonukleotidsequenzen, Chemikalien und daraus
hergestellte Lösungen, Geräte und Software aufgelistet. Alle nicht extra aufgeführten
Materialien wurden von der Firma Merck (Darmstadt, D) oder Roth (Karlsruhe, D) in p.a.-
Qualität bezogen.
4.1 Zellen und Stämme
HPAEC (Clonetics ®
Pulmonary Artery Endothelial
Cell System)
A-549 (human lung
carcinoma)
Monozyten und dendritische
Zellen
Medium: EGM TM -2 ohne GA
1000
Medium: EBM-2 + 10 % FCS DSMZ
Medium: RPMI 1640 + 10 %
FCS
Granulozyten Medium: RPMI 1640 + 5 %
FCS
ATCC 46645 (Aspergillus
fumigatus wt)
Medium: RPMI 1640 + 5 %
FCS oder 10 % FCS
4.2 Gebrauchsfertige Substanzen
Lonza (Walkersville, USA)
- 23-
primäre Zellen von freiwilligen
Spendern
primäre Zellen von freiwilligen
Spendern
Jena
Aufgelistet sind die in dieser Studie verwendeten gebrauchsfertigen Reagenziensätze.
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent (Böblingen, D)
Hu IL-12+p40, hu TNF-α Cytoset Biosource (Darmstadt, D)
LabelStar TM Array Kit Qiagen (Hilden, D)
MessageAmp TM II aRNA Amplification Kit Applied Biosystems (Foster City, USA)
QuantiTect Reverse Transcription Kit Qiagen (Hilden, D)
QuantiFast TM Probe PCR + ROX Vial Kit Qiagen (Hilden, D)
QIAamp ® DNA Blood Mini Kit Qiagen (Hilden, D)
RNeasy ® Mini Kit (RNeasy ® Mini Protocol for
Isolation of Total RNA from Animal Cells)
Dazu wurde benötigt:
Qiagen (Hilden, D)

4 Materialien
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Ethanol (Absolut) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
QIAshredderTM Qiagen (Hilden, D)
RNase-Free DNase Set Qiagen (Hilden, D)
TaqMan ® Universal PCR MasterMix
Dazu wurden folgende Primer- und Sondenkits
Applied Biosystems (Foster City, USA)
verwendet:
Hs00963533_m1 ALAS1 Applied Biosystems (Foster City, USA)
Hs01011368_m1 CCL20 Applied Biosystems (Foster City, USA)
Hs99999029_m1 IL1b Applied Biosystems (Foster City, USA)
Hs99999034_m1 IL8 Applied Biosystems (Foster City, USA)
4.3 Oligodesoxyribonukleotidsequenzen
4.3.1 Primersequenzen
Im Folgenden sind die verwendeten Primersequenzen aufgelistet.
Gen Name Sequenz 5’ – 3’
CCL20
CXCL10
Dectin-1
h-Alas
IL10
IL12
TLR2
MIP3a F CTG TCT TGG ATA CAC AGA CCG TA
MIP3a R GGT TCT TTC TGT TCT TGG GCT A
SCYB10_S ACG TGT TGA GAT CAT TGC TAC AA
SCYB10_A GAT TTT GCT CCC CTC TGG T
Dectin1_F GCT ATA TCT ATT CAG GGG CTC TC
Dectin1_R ATT ACC AAG CAT AGG ATT CCC A
h_ALAS_fwd AAT GAG TCG CCA CCC ACG
h_ALAS_rev CAG CTC CCG CTC TAA GTC CA
hu IL10 D GTA GAT GCC TTT CTC TTG GAG C
hu IL10 U TGC TGG AGG ACT TTA AGG GTT AC
IL12p40 F CTC GTG GCC ATA TGG GAA C
IL12p40 R TGG CCA GCA TCT CCA AAC T
TLR2 F TGT CTT GTG ACC GCA ATG GTA
TLR2 R GCT TGA ACC AGG AAG ACG AT
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4 Materialien
TLR4
TNF-α
TLR4 F GGA GCC CTG CGT GGA GA
TLR4 R TAT GCC CCA TCT TCA ATT GTC
TNFa F ACA AGC CTG TAG CCC ATG TT
TNFa A AAG AGG ACC TGG GAG TAG ATG A
SNP Name Sequenz 5’ – 3’
rs1554013
rs3921
rs4257674
4.3.2 Sondensequenzen
rs1554013 F GTT GTG GAA TCG AGG TGT TC
rs1554013 A ATA AAC CCC TTT CTA GTC AGT TTA AT
rs3921 S CAG TAG AGC TTA CAT TAT AGT GCC AG
rs3921 A TTG CAG TTA CAC TAA AAG GTT ACC
rs4257674 F2 CAC AAT TTT AAC TGG ATG ATG AAT CG
rs4257674 R CAT GGA TAC TGC TAA ATT TCC ACT C
Im Folgenden sind die verwendeten Sondensequenzen aufgelistet. Dabei sind die FL- Sonden
immer 5’ – – Sequenz– – FL aufgebaut, die LC-Sonden 5’ – LC640– Sequenz – – PH.
Gen Name Sequenz 5’ – 3’
CCL20
CXCL10
Dectin_1
h-Alas
IL10
MIP3a_FL GTT GTC TGT GTG CGC AAA TCC AAA
MIP3a_LC CAG ACT TGG GTG AAA TAT ATT GTG CGT C
SCYB10_FL AGT AAA TTC TTG ATG GCC TTC GAT TCT
SCYB10_LC GAT TCA GAC ATC TCT TCT CAC CCT TCT TTT
Dectin1_FL CAA TTA CAC TTC GAC TCT CAA AGC AAT
Dectin1_LC CCA GGA TAG CTG TTG TTT CAG AG
AL 2 FL CCT GCC CCA GCA CCA TGT TGT TTC
AL 2 R640 GTG TCC ATA ACT GCC CCA CAC ACC
hu IL10 FL CGG CGC TGT CAT CGA TTT CTT CCC T
hu IL10 LC TGA AAA CAA GAG CAA GGC CGT GGA GC
IL12 IL12 FL AGG CAG ATC TTT CTA GAT CAA AAC ATG CTG
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4 Materialien
IL12 IL12 LC CAG TTA TTG ATG AGC TGA TGC AGG CCC
TLR2
TLR4
TNF-α
TLR2 FL CTA CAG AGG TGT GTG AAC CTC CAG GC
TLR2 LC CTG GTG CTGACA TCC AAT GGA ATT AAC
TLR4 FL CCC TTC ACC CCG ATT CCA TTG CT
TLR4 LC CCT GCT AAA TGC TGC CGT TTT ATC ACG
TNF-α FL GCA TGG CCC GGC GGT TC
TNF-α LC CCA CTG GAG CTG CCC CTC AGC T
SNP Name Sequenz 5’ – 3’
rs1554013
rs3921
rs4257674
4.3.3 siRNAs
Sensor [C] TCA CAG TGT GGA CTT CCC C
rs1554013 An CCT CTC GGC AGC TGT TGT TAG TAT TAA ACT
Anchor rs3921 CAT TAA CCT TCC TAC AGG AGT AGT AGC AGC
rs3921 C GAT TTG GTG ACC CAT CAT TGG T
Sensor [G] GCT AGC TAC TAC GAA TAA TCA GTC A
rs4257674 R AGT ACT ATT GAA TGC TGT GAA ATT AAG TTT
Die in dieser Studie verwendeten siRNAs wurden von Qiagen mittels des Algorithmus von
Novartis entworfen und synthetisiert. Die siRNAs waren 21 bp lang und besaßen am 5'-Ende
einen zwei Nukleotid langen Überhang.
CXCL10_1 (Sequenz nicht bekannt) Qiagen (Hilden, D)
CXCL10_2 (Sequenz nicht bekannt) Qiagen (Hilden, D)
non-silencing control (Sequenz nicht bekannt) Qiagen (Hilden, D)
4.4 Substanzen und Lösungen
Im Folgenden sind die verwendeten Substanzen und die daraus hergestellten Puffer und
Lösungen aufgelistet.
Formaldehydlösung (37%) Merck (Darmstadt, D)
Fluoprep bioMérieux (Marcy l'Etoile, F)
RNase ZAP Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
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4 Materialien
4.4.1 Reagenzien für Zellkultur
ACK Lysing Buffer Lonza (Walkersville, USA)
AIM-V-Medium GIBCO, Invitrogen Corp. (Karlsruhe, D)
Biocoll separation solution (density 1,077
g/ml)
Biochrom AG (Berlin, D)
CD1c (BDCA-1) + Dendritic Cells Isolation KitMiltenyi (Bergisch Gladbach, D)
CD8 + T Cell Isolation Kit Miltenyi (Bergisch Gladbach, D)
CD14 MicroBeads Miltenyi (Bergisch Gladbach, D)
CD69 MicroBead Kit II Miltenyi (Bergisch Gladbach, D)
CellGro ® DC Cell Genix (Freiburg, D)
DMSO (Dimethylsulfoxid) 99,5% Roth (Karlsruhe, D)
EBM ® -2 (Endothelial Cell Basal Medium-2) Lonza (Walkersville, USA)
EGM TM -2 SingleQuots Lonza (Walkersville, USA)
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid
disodium salt solution) 0,5 M (pH 8)
Everolimus
(RAD; 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin)
Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Novarits (Basel, Ch)
FCS (fetas calf serum) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Gentamyinsulfat (Refobacin ® 80mg) Merck (Darmstadt, D)
HBSS Hanks' Balanced Salt (1x) GIBCO, Invitrogen Corp. (Karlsruhe, D)
Heparin Sodium Salt Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Human cytomeglovirus antigen pp65 Mitlenyi Biotech (Bergisch Gladbach, D)
Human IL-4 (premium grade) Mitlenyi Biotech (Bergisch Gladbach, D)
Leukine sargramostim (GM-CSF) Bayer HealthCare (Seattle, WA, USA)
M-Typ Phytohemagglutinin (PHA) Invitrogen (Karlsruhe, D)
LPS (Lipopolysaccharid) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
PMA (Phorbol 12-myrisate 13-acetate) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Polymorphprep TM (density 1,113 g / ml) Axis-shield
RPMI 1640 (ungefärbt) GIBCO, Invitrogen Corp. (Karlsruhe, D)
RPMI 1640 + GlutaMAX TM -I
Dazu wurde gegeben: Refobacin (120 ml / l)
Trypanblau 0,4% Fluka (Seelze, D)
4.4.2 Substanzen für Microarray-Analysen
GIBCO, Invitrogen Corp. (Karlsruhe, D)
20 x SSC pH 7,0 3 M NaCL, 0,3 M Na-citrat in Aqua demin.
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4 Materialien
Na-Citrat Fluka (Seelze, D)
NaCL Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Nexterion Block E Peqlab (Erlangen, D)
Nexterion Oligo Hyb ® Peqlab (Erlangen, D)
Trition X100 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Puffer I 0,1 % Triton-X100 in Aqua demin.
Puffer II 1 mM HCL in Aqua demin.
Puffer III 100 mM Kcl in Aqua demin.
Waschpuffer I 2 x SSC + 0,2 % FCS
Waschpuffer II 2 x SSC
Waschpuffer III 0,2 x SSC
4.4.3 Substanzen für Gelelektropohorese
Agarose Roth (Karlsruhe, D)
DNA-Ladder (100bp) Invitrogen (Karlsruhe, D)
Gel Ladepuffer (blue juice) Invitrogen (Karlsruhe, D)
10x TAE Buffer Invitrogen (Karlsruhe, D)
4.4.4 Farbstoffe und FACS-Antikörper
CFSE Invitrogen (Karlsruhe, D)
DCF (2',7'-Dichlorofluorescein Diacetat) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Dextran Conjugates Invitrogen (Karlsruhe, D)
FITC (Fluorescein 4(6)-isothiocyanat) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Mouse IgG2a APC Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Mouse IgG2a FITC Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Mouse IgG1 PE Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Mouse IgG2a PE Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Mouse IgG2b PE Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Mouse IgG1 PerCP Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Monoclonal Mouse Anti-Human CD1a/FITC DakoCytomation / Biozol (Eching, D)
APC Mouse Anti-Human CD11c Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, D)
FITC Mouse Anti-Human CD14 Becton Dickinson (Heidelberg, D)
PE anti-h Dectin-1/Clec7A R&D Systems (Minneapolis, USA)
PE Mouse Anti-Human CD1c Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, D)
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4 Materialien
PE Mouse Anti-Human CD1d Becton Dickinson (Heidelberg, D)
PE Mouse Anti-Human CD40 Beckman Coulter (Krefeld, D)
PE Mouse Anti-Human CD66 Becton Dickinson (Heidelberg, D)
PE Mouse Anti-Human CD80 Becton Dickinson (Heidelberg, D)
PE Mouse Anti-Human CD83 Becton Dickinson (Heidelberg, D)
PE Mouse Anti-Human CD86 Becton Dickinson (Heidelberg, D)
PE Mouse Anti-Human CD282 (TLR2) BioLegend (Uithoorn, NL)
PE Mouse Anti-Human CD284 (TLR4) BioLegend (Uithoorn, NL)
PE Mouse Anti-Human HLA-DR Becton Dickinson (Heidelberg, D)
PerCP Mouse Anti-Human CD3 Becton Dickinson (Heidelberg, D)
4.4.5 Antikörper, Substanzen und Puffer für ELISA
Monoclonal anti-human CCL20 / CXCL10 /
IL-10 Antibody
Recombinant human CCL20 / CXCL10 / IL-
10
Biotinylated anti-human CCL20 / CXCL10 /
IL-10 Antibody
R&D Systems (Minneapolis, USA)
R&D Systems (Minneapolis, USA)
R&D Systems (Minneapolis, USA)
Salzsäure 2N Roth (Karlsruhe, D)
Tween 20 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
10x PBS (Phosphat Buffered Saline) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Albumin Fraktion V (BSA) Roth (Karlsruhe, D)
Substrat Reagent Pack R&D Systems (Minneapolis, USA)
Waschpuffer 1 x PBS; 0,05 % Tween 20; pH 7,4
Blocking-Lösung 1 x PBS; 1 % BSA; 5 % Sucrose,0,05 %
Natriumazid
Standardpuffer 20 mM Trizma base; 150 mM NaCl; 0,1 %
BSA in Aqua demin.
Streptavidin-Puffer 1 x PBS; 1 % BSA
Substratlösung Reagenz A + Reagenz B (1 : 1)
Stopp Lösung 1 M Schwefelsäure
- 29-

4 Materialien
4.4.6 Agar-Platten
Die Pilzplatten wurden vom Institut für Hygiene und Mikrobiologie des
Universitätsklinikums Würzburg hergestellt.
Bierwürzplatten Bierwürze in 1 l Aqua demin.
Sabouraud-Dextrose Agar 16 g Agar-Agar (Merck); 40 g Glucose
(Merck); 10 g Bacton Peptid (BD) in 1 l Aqua
demin.
4.5 Geräte
Des Weiteren sind die verwendeten Geräte aufgeführt.
Alpha Innotech Biozym (Hess. Oldendorf, D)
Bioanalyzer 2100 Agilent (Böblingen, D)
Brutschrank Heraeus BBD6220 Thermo / Kendro (Schwerte, D)
Colony Counter ProtoCol Synbiosis (Cambridge, UK)
Shandon Cytospin 2 HY-203 Thermo Scientific (Schwerte, D)
Elektroporationsgerät EPI 2500 Fischer (Heidelberg, D)
ELISA Reader GENios FL Tecan (Männedorf, CH)
ELISA Washer hydroFlex Tecan ( Männedorf, CH)
FACS Calibur Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Fluoreszenzmikroskop AXIO Imager.Z1 Zeiss (Oberkochen, D)
Gefrierschänke -20°C / -80°C Liebherr (Ulm, D) / Heraeus (Hanau, D)
Gel-Kammer Horizon 11.14 Biometra (Göttingen, D)
Hybridisierungsofen ShelLab (Cornelius OR, USA)
Kryoeinfriergerät
Kühlzentrifuge Mulitfuge 3 s-r
Hartenstein (Würzburg, D)
Heraeus (Hanau, D)
LightCycler 1.5 Roche Applied Science (Penzberg, D)
QuadroMACS TM Separator (for LS Columns) Miltenyi (Bergisch Gladbach, D)
Magnetrührer Monotherm Variomag / Thermo (Schwerte, D)
Mastercycler ep Eppendorf (Hamburg, D)
Microplate Reader Model 680 Biorad (Hercules, USA)
Mikroskop Eclipse 50i und TS100 Nikon (Düsseldorf, D)
Mikrowelle MM 41568 Micromaxx (Mühlheim a. d. Ruhr, D)
Multi-image Light Cabinet Biozym (Hess. Oldendorf, D)
- 30-

4 Materialien
Multipette ® plus Eppendorf (Hamburg, D)
Nanodrop ND-1000 Peqlab (Erlangen, D)
Neubauer-Zählkammer Hartenstein (Würzburg, D)
pH Meter pH211 Hanna Instruments (Michigan, USA)
Pipetten:
Reference 2,5µl; 10µl; 100µl; 1000µl
Multipette ® plus
Research pro 300
Eppendorf (Hamburg, D)
Pipetus ® -Akku Hirschmann ® Laborgeräte (Eberstadt, D)
Präzisionswaage GF-200 A & D Instruments (Tokyo, J)
ScanArray 4000 BioChip Technologies (Billerica MA, USA)
Schüttler TH30 Edmund Bühler GmBH (Hechingen, D)
Shandon Filter Cards Thermo Electon Corporation (Pittsburgh, US)
Shandon Cytoträger (ca. 76 × 26 × 1 mm) Thermo Electon Corporation (Pittsburgh, US)
Spannungsgerät Blue Power 500 Serva (Heidelberg, D)
StepOnePlus Applied Biosystems (Foster City, USA)
Tischzentrifuge Centrifuge 5415D und 5415R Eppendorf (Hamburg, D)
Tischzentrifuge EBA12 Hettich (Beverly, USA)
Wasserbad Memmert WB7 Memmert (Nürnber / Heilbronn, D)
Zeitschaltuhr theben (Haigerloch, D)
9800 Fast Thermal Cycler Applied Biosystems (Foster City, USA)
4.6 Verbrauchsmaterialien
Im Folgenden sind die zur einmaligen Verwendung gedachten Materialien aufgelistet.
Cell Strainer 40 µm Nylon Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Combitibs plus (2,5 ml, 5 ml, 10 ml) Eppendorf (Hamburf, D)
CryoTube TM Vial 1,8ml Nunc
Deckgläser (24 × 32 mm) Knittel Gläser (Braunschweig, D)
Elektroporationsküvetten 0,4cm Elektrode Biorad (München, D)
ELISA-Platte (F-Form, 96 Well) Greiner-bio-one (Frickenhausen, D)
FACS-Röhrchen (5 ml, 12 × 75 mm) Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Gasket Slide Agilent (Böblingen, D)
Klebefolie, optisch klar Sarstedt (Nümbrecht, D)
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4 Materialien
LightCycler ® Capillaries (20 µl) Roche Applied Science (Penzberg, D)
MACS ® Separation Columns LS Miltenyi (Bergisch Gladbach, D)
Multifly ® Fast PCR-Plate Sarstedt (Nümbrecht, D)
Multifly ® μStrip Pro8-s trip Sarstedt (Nümbrecht, D)
Pasteurpipetten (einzeln steril verpackt) Hartenstein (Würzburg, D)
Pipettenspitzen:
TipOne Filter Tips (100 µl, 1000 µl)
Pipettenspitzen:
SafeSeal-Tips (10 µl, 1250 µl)
StarLab (Ahrensburg, D)
Biozym (Hess. Oldendorf, D)
Plate sealer (non toxic) Greiner-bio-one (Frickenhausen, D)
Reaktionsgefäße (1,5 ml Safelock) Eppendorf (Hamburg, D)
Reaktionsgefäße (0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml) Sarstedt (Nümbrecht, D)
S- Monovetten (7,5 ml Z, 9 ml K3E) Sarstedt (Nümbrecht, D)
Serologische Pipetten
Cellstar (1 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) Greiner bio-one (Frickenhausen, D)
Costar Stripette (5 ml, 10 ml, 25 ml) Vitaris (Baar, D)
Transwell Permeable Supports (3,0 µm
Polyester Membrane; 6,5 mm Insert, 24 Well
Plate)
Costar / Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)
Zellkulturflaschen (25 cm², 75 cm², 175 cm²) Greiner bio-one (Frickenhausen, D)
Zellkulturplatten (6 Well, 24 Well, 96 Well) Falcon / Becton Dickinson (Heidelberg, D)
Zellkulturplatten für Suspensionszellen (24
Well)
4.7 Software
Sarstedt (Nümbrecht, D)
AxioVision 4.7 Zeiss (Oberkochen, D)
CellQuest Pro Becton Dickinson (Heidelberg, D)
GIMP 2.6.10 (2008) Gnu
LightCycler Software version 3 (1999) Roche Applied Science (Penzberg, D)
Microplate Manager 5.2.1 Build 106 Biorad (München, D)
NanoDrop 3.1.0 (1998) PeqLab (Erlangen, D)
OpenOffice.org 3 (2008) Sun Microsystems Inc.
ScanAlyze 2.5 (Michael Eisen) (2002) EisenLab (University of California, USA)
Statistica 8.0 (2008) StatSoft, Inc (Tulsa, USA)
StepOne Software version2.1 (2009) Applied Biosystems (Foster City, USA)
- 32-

5 Methoden
5 Methoden
5.1 Arbeiten mit Aspergillus fumigatus
Der Stamm ATCC46649 wurde im Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität
Würzburg in der Dauerform Konidie aufbewahrt. Zur Vermehrung der Konidien wurden diese
auf Bierwürzplatten ausgestrichen und ca. 36 h bei 37 °C aufbewahrt. Sobald neue Sporen
gewachsen waren, wurde steriles Wasser hinzu gegeben und mittels eines Wattestäbchens die
hydrophoben Konidien von der Agarplatte gelöst. Mit Hilfe eines Zellsiebs wurden
unerwünschte Agarstücke und größere Pilzstrukturen entfernt, und im Anschluss konnte die
Konidienzahl mittel Neubauer-Zählkammer (siehe 5.3.3) bestimmt werden. Die weitere
Verwahrung erfolgte in Wasser gelöst bei 4 °C.
Zur Herstellung von Keimschläuchen wurde eine bestimmte Anzahl Konidien aus der
wässrigen Stocklösung genommen und in RPMI-Medium mit 5% FCS für 12 – 16 h
synchronisiert. Durch anschließende Inkubation bei 37 °C unter Schütteln für 5 – 8 h bildeten
die Konidien kurze bis lange Keimschläuche aus. Die Morphologie des Pilzes wurde jeweils
unter dem Mikroskop überprüft. Danach wurden die Keimschläuche entweder sofort
weiterverwendet oder für spätere Versuche bei -20 °C eingefroren.
Für Versuche mit Infektionszeiten über 12 h wurden inaktivierte Keimschläuche verwendet,
da somit ein Wachstum von Hyphen und die daraus resultierende Beeinflussung des
Experiments vermieden werden konnte. Es wurden 1 × 10 8 Keimschläuche für mindestens
20 min in 20 ml 70 % igem Ethanol aufgenommen und danach dreimal mit RPMI-Medium
mit 5 % FCS gewaschen. Anschließend wurde der Pilz bei -20 °C gelagert.
5.2 Wachstumsexperiment
RAD ist bekannt als Antimykotikum. Mit diesem Versuch sollte nachgewiesen werden,
inwieweit RAD in der eingesetzten Konzentration (10 nM) auf A. fumigatus toxisch wirkt.
Dazu wurden 2 × 10 7 kurze Keimschläuche von A. fumigatus angezogen und in 1 ml weißem
(= ohne Phenolrot) RPMI-Medium aufgenommen. Anschließend wurden die Keimschläuche
- 33-

5 Methoden
mit 0,1 mg Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) 15 min bei 37 °C angefärbt. Es folgten
mindestens 5 Waschschritte mit weißem RPMI-Medium (2000 × g, 2 min), bis keine
gelbliche Färbung des Mediums durch FITC mehr erkennbar war. Je 2 × 10 6 gefärbte
Keimschläuche wurden in 50 µl farblosem RPMI-Medium mit RAD (10 nM) bzw. mit EtOH
(10 -4 % ig) als Kontrolle 2 h bei 37 °C inkubiert. Durch Zentrifugation (5 min, 120 rpm) in
einer Zytospinzentrifuge wurden die Keimschläuche auf Objektträger gebracht und sofort mit
3,7 % Formaldehyd 20 - 30 min fixiert. Die Fixierlösung wurde mit 1 × PBS abgewaschen.
Nachdem der Objektträger an der Luft getrocknet war, wurde mit einem Tropfen Fluoprep ein
Deckglas fixiert. Am nächsten Tag folgte die Analyse am Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, D).
Es wurde der Durchlicht- und der GFP-Kanal aufgenommen. Da die anfängliche Länge der
Keimschläuche grün fluoreszierte, der weitergewachsene Teil hingegen nur im Durchlicht
erschien, konnte die Länge des gewachsenen Teils mittels AxioVision Software vermessen
werden. Pro Ansatz wurden 80 - 100 Keimschläuche vermessen. Das Wachstum wurde mit
folgender Formel ermittelt:
Wachstum [%] = Länge (ungefärbter Teil) × 100 / Länge (fluoreszierender Teil)
5.3 Primärzellen
Bei der gesamten Aufreinigung von Zellen wurde immer mit gekühlten Lösungen gearbeitet.
5.3.1 Isolation von PBMCs
Zur Isolation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs, peripheral blood
mononuclear cells) wurden Leukozyten-Reduktions-System Kammern (LRSCs,
leukoreduction system chambers) (Dietz et al., 2006), die ein Leukozytenkonzentrat von
freiwilligen, gesunden, humanen Spendern enthielten, aus der Transfusionsmedizin des
Uniklinikums Würzburg verwendet. Zu dem 10 ml Konzentrat wurden 90 ml HBSS (+ 2 mM
EDTA + 1 % FCS) gegeben und gemischt. Jeweils 25 ml der Lösung wurden langsam auf
20 ml des Kohlenhydrat-Polymer FICOLL ® (ρ = 1,077 g / ml) geschichtet und für 20 min bei
800 × g ohne Bremse zentrifugiert. Diese Dichtegradientenzentrifugation bewirkte, dass sich
die mononukleären Zellen, die sich hauptsächlich aus Lymphozyten und Monozyten
zusammensetzten, in der Interphase sammelten. Die Erythrozyten und die polymorphkernigen
Leukozyten mit ihrer höheren Dichte hingegen setzten sich unten ab. Mit Hilfe einer
- 34-

5 Methoden
Pasteurpipette wurde die Interphase abgenommen und in einem Falcon-Röhrchen gesammelt,
mit HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) auf 50 ml aufgefüllt und anschließend bei 300 × g,
10 min und 4 °C zentrifugiert. Dieser Schritt wurde nochmals zum Waschen der Zellen
wiederholt. Daraufhin konnten die Zellen sofort weiterverwendet oder kurz bei 4 °C
aufbewahrt werden.
5.3.2 Einfrieren und Auftauen primärer Zellen
Da für den T-Zellproliferationsassay CD14 + -Zellen und 7 Tage danach CD8 + -T-Lymphozyten
von demselben unbekannten Spender isoliert werden mussten, war es nötig, die PBMCs am
Tag 0 direkt nach der Isolation einzufrieren. Dazu wurden je 1,5 × 10 8 Zellen in 1 ml
Einfriermedium aus humanem Serum mit 8 % DMSO aufgenommen, in gekühlte Kryotubes
umgefüllt und diese in einem Kryoeinfriergerät (Hartenstein, D) sofort zu -80 °C gestellt. Am
nächsten Tag wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert.
Das Auftauen primärer Zellen musste schnell erfolgen. Deshalb wurden die gefrorenen Zellen
in 37 °C warmes HBSS mit 10 % Serum resuspendiert und zu 10 ml frischem HBSS mit 10 %
Serum gegeben. Die Suspension wurde bei 300 × g für 5 min zentrifugiert und im Anschluss
zweimal gewaschen. Nach Bestimmung der Zellzahl wurde mit der Isolation von
CD8 + -T-Lymphozyten begonnen.
5.3.3 Zellzahlbestimmung in der Neubauer-Zählkammer
Die Zellzählung erfolgte mittels einer Lebend-Tot-Färbung durch den Azofarbstoff
Trypanblau, der nur tote Zellen blau anfärbt, da er nicht in lebende Zellen eindringen kann.
Die eigentliche Zellzählung erfolgte mikroskopisch in einer Neubauer-Zählkammer. Auf
dieser Kammer sind zwei 3 × 3 mm große Zählnetze eingraviert, die sich jeweils aus neun
1 × 1 mm großen Quadraten zusammensetzen (Abb. 5.1). Um das Zählen zu erleichtern, sind
diese wiederum in 16 kleinere Quadrate mit 0,25 × 0,25 mm unterteilt. Der Abstand zwischen
Deckglas und Objektträger beträgt 0,1 mm Tiefe. Daraus errechnet sich ein gezähltes
Volumen von 0,1 mm³. Mit Hilfe dieses Volumens, dem Volumen, aus dem das Zellaliquot
für die Zellzählung entnommen worden ist, und der Verdünnung mit HBSS und Trypanblau,
lässt sich die ursprüngliche Zellzahl errechnen:
(Gezählte Zellen / Anzahl Quadrate) × Verdünnungsgrad × Gesamtvolumen / Kammerfaktor
(1 / 10 4 )
- 35-

5 Methoden
Abbildung 5.1: Gitternetz der Neubauer-Zählkammer. (Modifiziert nach: http://elearning.studmed.unibe.ch/hemosurf_demo/Lab-Images/chambre_scheme.jpg)
5.3.4 Isolation von CD14 + -Zellen
Aus den vorher gewonnen PBMCs (5.3.1) können CD14 + -Zellen, die zu 95 % aus Monozyten
bestehen, isoliert werden. Dazu wurde ein System mit magnetischen MicroBeads angewendet,
an die ein α-CD14-Antikörper gekoppelt war. Dieser Antikörper heftet sich an CD14 + -Zellen,
die dann auf eine Säule, die sich in einem magnetischen Feld befand, gebracht wurden. Die
CD14 + -Zellen bleiben in der Säule hängen, während die ungelabelten Zellen – hauptsächlich
Lymphozyten – durchfließen. Nachdem die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt
worden ist, können die CD14 + -Zellen eluiert werden.
Es wurden für die Durchführung der Isolation pro benötigte LS-Säule 2,5 × 10 8 PBMCs in
850 µl kaltem HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) aufgenommen und 15 min mit 150 µl
α-CD14-MicroBeads bei 4 °C inkubiert. Anschließend folgte ein Waschschritt mit 20 ml
HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) und eine Zentrifugation bei 300 × g, 10 min und 4 °C.
Das Zellpellet wurde aufgeschabt, um die Zellen zu vereinzeln, und erneut in 1 ml HBSS
(+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) resuspendiert. Für einen optimalen Durchfluss war es nötig,
eine Einzelzellsuspension herzustellen, da Zellklumpen die Säule verstopfen können. Zuvor
wurden die benötigten LS-Säulen in den Magnethalter gespannt und mit 3 ml HBSS (+ 2 mM
EDTA, + 1 % FCS) befeuchtet. Jetzt konnten die Zellen auf die Säulen gegeben und dreimal
mit je 3 ml HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) gewaschen werden, jedes Mal wenn sich das
Reservoir der Säule komplett geleert hatte. Die positiv selektierten Zellen wurden nach
Entfernen der Säule aus dem Magnethalter mit Hilfe von 2 ml HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 %
FCS) und dem mitgelieferten Stempel aus der Säule in ein 15 ml Falcon-Röhrchen gedrückt.
Daraufhin wurde die Zellzahl bestimmt (5.3.3).
- 36-

5 Methoden
5.3.5 In vitro Generierung unreifer dendritischer Zellen
Durch Zugabe der Zytokine Interleukin 4 (IL4) und Granulozyten-Makrophagen-
koloniestimulierender Faktor (GM-CSF, granolocyte macrophage colony-stimulation factor)
können aus Monozyten in vitro dendritische Zellen (moDCs) generiert werden (Romani et al.,
1996; Grigoleit et al., 2002). Dazu wurden jeweils 2,5 × 10 6 der frisch isolierten CD14 + -
Zellen in 3 ml RPMI-Medium mit 10 % FCS und 120 mg / l Refobacin resuspendiert. Für die
in vitro Generierung der moDCs wurden 10 ng / ml IL4 (= 100 U / ml) und 100 ng/ ml GM-
CSF dazugegeben. Die Zellsuspension wurde in 6-Well Platten ausplattiert, wobei jeweils
3 ml in jedes Well gegeben wurden. Die Dauer der Generierung der moDCs betrug 5 bis 7
Tage und wurde unter den Inkubationsbedingungen 37 °C und 5 % CO2 vollzogen. Jeden
zweiten Tag wurde aus den Wells je 1 ml abgenommen und gepoolt zentrifugiert (300 × g,
10 min). Um keine Zellen zu verlieren, wurde das daraus gewonnene Zellpellet in je 1 ml
frischem RPMI-Medium – versetzt mit 10% FCS und 120 mg / l Refobacin aber der gleichen
Menge an Zytokinen wie am Tag 0 – pro Well aufgenommen und in die Wells
zurückgegeben. Die Zelldifferenzierung wurde in regelmäßigen Abständen am
Lichtmikroskop beobachtet. Nachdem die moDCs vollständig ausdifferenziert waren, wurden
sie mit Hilfe eines Zellschabers vom Plattenboden gelöst und gesammelt. Nach erneutem
Spülen der Wells mit kaltem HBSS, um die Ausbeute an moDCs zu erhöhen, wurde die
Zellsuspension abzentrifugiert (300 × g, 10 min), der Überstand dekantiert und die Zellen in
einem bestimmten Volumen HBSS aufgenommen. So konnte die Zellzahl bestimmt werden
(5.3.3).
Für die Versuche mit RAD wurde in jedes Well mit 3 ml frisch isolierten CD14 + -Zellen 30 µl
RAD (1 µM) oder 30 µl EtOH (1 : 10 4 verdünnt) für die Kontrollzellen gegeben. Das ergibt
eine RAD-Endkonzentration von 10 nM. Zusätzlich wurde bei jedem Mediumwechsel erneut
RAD hinzugefügt, wobei zu 1 ml Medium mit 10 % FCS 10 µl RAD (1 µM) bzw. 10 µl
EtOH (1 : 10 4 verdünnt) gegeben wurden. Dazu wurde das RAD aus der 10 -2 M Stocklösung
immer frisch verdünnt, da RAD in so geringer Konzentration nicht stabil ist. moDCs wurden
immer 7 Tage lang mit RAD bzw. EtOH inkubiert. Die mit RAD behandelten Zellen werden
auch als RAD-DCs bezeichnet, die Kontrollzellen auch als EtOH-DCs.
- 37-

5 Methoden
5.3.6 Generierung von Heparin-Serum moDCs
Für den T-Zellproliferationsassay mussten moDCs generiert werden, die nicht mit FCS in
Kontakt gekommen waren, da sie sonst die körperfremden Proteine des FCS an die
T-Lymphozyten präsentieren und diese somit zur Proliferation anregen könnten. Deshalb
wurden CD1a + moDCs in einem serumfreien Medium, dem CellGro (Cell Genix, D),
hergestellt. Zu einer effizienteren Differenzierung wurde dem Medium 120 mg / l Refobacin,
2 % humanes Serum sowie 20 ng / ml IL4, 400 ng / ml GM-CSF und 33 1/3 U / ml Heparin
zugesetzt (Xia, Kao, 2003). Jeden zweiten Tag wurde den Zellen frisches CellGro-Medium
mit Serum und Zytokinen wie am Tag 0 gegeben. Das genaue Vorgehen entsprach dem unter
5.3.5 bereits beschriebenen.
5.3.7 Isolation von myeloiden dendritischen Zellen
In dieser Studie wurden in vitro generierte DCs mit direkt aus dem Blut isolierten myeloiden
dendritischen Zellen (mDCs) verglichen. Die Isolation erfolgte mittels CD1c (BDCA-1) +
Dendritic Cells Isolation Kit (Miltenyi, D) nach optimiertem Protokoll der AG Löffler. Die
Optimierung sah vor, dass alle Reagenzien für die Isolation einzeln und zuerst das FcR-
blocking Reagent dazugegeben wurden, um die Ausbeute und Vitalität zu erhöhen. Der Fc
(= fragment crystallisable) - Rezeptor wird auf Immuneffektorzellen exprimiert. Binden die
Fc-Fragmente eines Antikörpers an dem Rezeptor, setzen natürliche Killerzellen (NK-Zellen),
Eosinophile, Basophile und Mastzellen gespeicherte Mediatoren frei, phagozytieren
Makrophagen und Neutrophile und zuletzt wird das Komplement aktiviert. Durch die
Blockierung des Rezeptors wird verhindert, dass diese akzessorischen Effektorzellen die
mDCs angreifen, nachdem sie den CD1c (BCDA-1) + Antikörper gebunden haben.
Zu je 1,0 × 10 8 der gewonnenen PBMCs (5.3.1) in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS)
wurden zunächst 100 µl des FcR-blocking Reagent gegeben, gut gemischt und 15 min bei
4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension mit HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 %
FCS) auf 20 ml aufgefüllt und bei 300 × g, 10 min und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet
wurde aufgeschabt, um die Zellen zu vereinzeln, und erneut in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA,
+ 1 % FCS) resuspendiert. Alle weiteren Wasch- und Resuspensionsschritte erfolgten auf die
gleiche Weise. Zur Depletion der B-Lymphozyten, die wie die mDCs den CD1c Marker
exprimieren, wurden 100 µl CD19 + -MicroBeads zur Zellsuspension gegeben, erneut 15 min
bei 4°C inkubiert, gewaschen und in 1 ml HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) resuspendiert.
- 38-

5 Methoden
Die magnetische Auftrennung erfolgte wie unter 5.3.4 erläutert über LS-Säulen, mit dem
Unterschied, dass hier die Negativfraktion, also der Durchfluss, in einem 50 ml Röhrchen
aufgefangen wurde, da die B-Lymphozyten in der Säule haften blieben. Die gewonnene
Suspension wurde erneut gewaschen und in 400 µl HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS)
resuspendiert. Nach einer Inkubation von 15 min bei 4°C mit 100µl anti-CD1c-Biotin und
einem erneuten Waschschritt wurde zu den Zellen 100 µl anti-Biotin MicroBeads gegeben.
Nachdem die Zellsuspension erneut gewaschen und in 1 ml resuspendiert war, folgte eine
Positivselektion über LS-Säulen (5.3.4). In einem letzten Schritt wurde die Zellzahl bestimmt
(5.3.3). Für Übernachtkultur wurden mDCs in einer Konzentration von 2,0 × 10 6 in 3 ml
RPMI (10% FCS, 120 mg / l Refobacin und 100 ng/ ml GM-CSF) in 6-Well Platten bei 37 °C
und 5 % CO2 inkubiert.
5.3.8 Isolation von CD8 + T-Lymphozyten
Mit dem System der magnetischen MicroBeads (5.3.4) wurden auch CD8 + -T-Lymphozyten
isoliert. Dazu wurde eine Kombination aus dem CD69 MicroBead Kit II und dem CD8 + T
Cell Isolation Kit (Miltenyi, D) verwendet. Das CD8 + T Cell Isolation Kit beruht darauf, alle
Nicht-CD8 + -Zellen magnetisch zu markieren und somit zu depletieren. CD69 ist auf
aktivierten T-Zellen exprimiert und durch die Depletion dieser Zellen wurde sichergestellt,
dass nur ruhende CD8 + -Zellen isoliert wurden.
Dazu wurden pro benötigte LS-Säule 1,0 × 10 8 PBMCs (5.3.1) in 300 µl kaltem HBSS
(+ 2 mM EDTA) aufgenommen und 10 min mit 100 µl CD69 + -Biotin-Cocktail und zugleich
mit 100 µl CD8 + T Cell Biotin-Antibody Cocktail bei 4 °C inkubiert. Anschließend folgte ein
Waschschritt mit 20 ml HBSS (+ 2 mM EDTA) und Zentrifugation bei 300 × g, 10 min und
4 °C. Das Zellpellet wurde aufgeschabt und in 800 µl HBSS (+ 2 mM EDTA) resuspendiert.
Nach Zugabe von 200 µl CD8 + T Cell MicroBead Cocktail folgte eine erneute Inkubation von
15 min bei 4 °C. Darauf wurden die Zellen gewaschen, um die überschüssigen MicroBeads zu
entfernen und in 500 µl resuspendiert. Der Schritt zur Beladung der Säulen wurde, wie unter
5.3.4 beschrieben, durchgeführt, außer dass sich hier die gewünschten Zellen im Durchfluss
befanden, da es sich um eine Negativselektion handelte. Der Durchfluss wurde in 15 ml
Falcon-Röhrchen aufgefangen und die Zellzahl bestimmt (5.3.3).
- 39-

5 Methoden
5.3.9 Isolation von neutrophilen Granulozyten
Mit Hilfe eines speziellen Polymorphpreps (= Biocoll) können aus frischem Blut sowohl
mononukleäre als auch polymorphonukleäre Zellen isoliert werden (Ferrante, Thong, 1980;
Braedel et al., 2004). Dabei erhält man nach Zentrifugation zwei Phasen. In der oberen finden
sich die PBMCs wieder, in der unteren die Granulozyten.
Dazu wurde Blut von freiwilligen, gesunden, humanen Spendern in 9 ml EDTA-Monovetten
abgenommen und sofort weiterverarbeitet. Eine Monovette Blut wurde mit 4 ml HBSS
verdünnt. Dann wurden je 5 ml Biocoll (Biochrom AG, D) in 15 ml Falcon-Röhrchen mit
6 ml Blut überschichtet und bei 500 × g für 30 min ohne Bremse zentrifugiert. Die danach
erhaltene obere Phase aus PBMCs wurde mittels einer Pasteurpipette abgenommen und
verworfen. Die untere Phase aus neutrophilen Granulozyten wurde ebenfalls abgenommen,
gepoolt und mit HBSS gewaschen (580 × g, 5 min). Nach dem Verwerfen des Überstands
wurde das Zellpellet für 5 min in 5 ml eiskaltem ACK-Lysisbuffer aufgenommen, um die
noch vorhandenen Erythrozyten zu lysieren. Darauf folgte erneut eine Zentrifugation
(650 × g, 2 min). Der Überstand wurde dekantiert, das Zellpellet gelöst und in 5 ml RPMI +
5 % FCS resuspendiert. Nun konnte die Zellzahl bestimmt werden (5.3.3).
5.3.10 Elektroporation mit siRNA
Die Methode des posttranskriptionalem gene-silencing wurde 1998 von Fire et al. entdeckt.
Die Gruppe fand heraus, dass die Injektion doppelsträngiger RNA (dsRNA) einen sehr viel
stärkeren Effekt auf die Suppression der Genexpression (Knockdown) hat als einzelsträngige
sense oder antisense RNA. Daraus schlossen sie, dass mRNA nicht durch einen einfachen
Antisensemechanismus blockiert wird, sondern ein katalytischer Prozess dahinter steckt.
Obwohl Fire et al. (1998) den Mechanismus von RNAi noch nicht klären konnten, bewiesen
sie, dass diese Methode spezifisch und sequenzabhängig ist. Für humane Zellen müssen
siRNAs verwendet werden, um unspezifisches silencing von mRNA zu vermeiden (Elbashir
et al., 2001). siRNAs sind 21-23-nt dsRNAs mit symmetrischen 2-3-nt 3'-Überhang, 5'-
Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppe.
Für moDCs eignet sich am besten die Methode der Elektroporation, da sie nicht die Nachteile
der Lipofektion hat, durch die eine Interferonantwort ausgelöst werden kann (Felgner et al.
1987; Karikó et al., 2004). Bei Elektroporation werden siRNAs über elektrische Impulse in
das Zytoplasma und den Zellkern transfiziert. Zu 1,0 × 10 6 frisch geernteten moDCs (5.3.5),
- 40-

5 Methoden
die in 100 µl RPMI-Medium ohne Zusätze aufgenommen worden waren, wurden 133 nM
CXCL10 (1) oder CXCL10 (2) siRNA, non-silencing siRNA als unspezifische siRNA oder
Medium (Negativkontrolle) gegeben und in einer Elektroporationsküvette gemischt.
Elektroporiert wurde bei 10 msec und 340 V. Nach einer anschließenden Inkubationszeit von
10 - 15 min wurden die Zellen in eine 24-Well-Platte mit 800 µl RPMI-Medium (+10 ng / ml
IL-4, + 100 ng / ml GM-CSF, + 120 mg / l Refobacin, + 10 % FCS) überführt und die
Küvetten jeweils mit 100 µl des gleichen Mediums gewaschen. Das Gesamtvolumen in den
Wells betrug somit 1 ml. Nach 24 h wurde mit den Zellen weitergearbeitet, da zu diesem
Zeitpunkt der Gen-knockdown am besten war.
5.3.11 Durchflusszytometer
Um die Reinheit der isolierten Zellen zu analysieren, mussten sie am Durchflusszytometer
(= Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS) vermessen werden. Dort hat man die
Möglichkeit, Zellen einzeln durch einen Laserstrahl anzuregen und so deren Autofluoreszenz
sowie deren Streulicht aufzuzeichnen. Das Vorwärtsstreulicht (= forward scatter, FSC) zeigt
die Größe einer Zelle, das Seitwärtsstreulicht (= side scatter, SSC) hingegen ist ein Maß für
die Granularität der Zelle. Für die meisten Analysen in dieser Studie wurden die Zellen
zusätzlich mit Antikörpern, an denen FITC, PE, APC oder PerCP gebunden war, markiert, die
spezifisch an einen bestimmten Oberflächenmarker der Zellen binden.
Je 2,0 × 10 5 Zellen wurden in 200 µl HBSS (+ 10 % FCS) aufgenommen. Anschließend folgte
die Färbung – meist mit 2 µl FITC-Antikörper und zugleich 2 µl PE-Antikörper – für 20 min
bei 4 °C im Dunkeln. Welche Antikörper für die einzelnen Zellen verwendet wurden, um
deren Reinheit zu testen, ist Tab. 5.1 zu entnehmen. Danach musste der restliche Antikörper
in zwei Waschschritten durch Zugabe von je 1 ml HBSS (+10 % FCS) und Zentrifugation
(5 min, 300 × g, 4 °C) entfernt werden. Das Volumen der Zellsuspension wurde auf 400 µl
mit HBSS (+ 10 % FCS) aufgefüllt und sofort am Durchflusszytometer vermessen. Es wurden
jeweils 10 000 Zellen in einer gesetzten Region im FSC / SSC von der gewünschten
Zellpopulation am FACS Calibur (Becton Dickinson, D) gemessen. Die Auswertung der
Messdaten erfolgte mit der Software CellQuest Pro (Becton Dickinson, D).
- 41-

5 Methoden
Tabelle 5.1: Liste der Oberflächenmarker, die als positiv (+) oder negativ (-) auf den
isolierten Zellen bestimmt wurden, um die Reinheit zu definieren.
5.4 Zelllinien
Für das gesamte Arbeiten mit Zelllinien wurde immer mit auf 37 °C vorgewärmten Medien
und Lösungen gearbeitet. Die Außenseiten der Plastikgefäße wurden immer desinfiziert,
bevor sie unter die Sterilwerkbank gebracht wurden.
5.4.1 HPAEC
Humaner Zelltyp Oberflächenmarker
Monozyten
Monozyten generierte
dendritische Zellen
myeloide dendritische
Zellen
CD1a - FITC
CD14 + FITC
CD1a + FITC
CD14 - FITC
CD11c + APC
CD1c + PE
CD19 - FITC
Isotyp
Mouse IgG 2a FITC
Mouse IgG 2a FITC
Mouse IgG 2a FITC
Mouse IgG 2a FITC
Mouse IgG 2b APC
Mouse IgG 1 PE
Mouse IgG 1 FITC
CD8 + T-Zellen CD3 + PerCP Mouse IgG 1 PerCP
neutrophile
Granulozyten
CD66c + PE
Mouse IgG 2a PE
Human Pulmonary Artery Endothelial Cells (HPAEC; Lonza, USA) ist eine adhärent
wachsende Primärzelllinie. Sie wurde in speziell für diese Zellen optimiertem Basal
Medium-2 mit folgenden von Lonza (USA) für 500 ml Medium mitgelieferten
Wachstumsfaktoren gehalten: 0,2 ml Hydrocortisone; 2 ml hFGF-B; 0,5 ml VEGF; 0,5 ml R 3 -
IGF-1; 0,5 ml Ascorbic Acid; 0,5 ml Heparin; 10 ml FBS; 0,5 ml hEGF (= EGM-2 Medium
mit Zusätzen). Die 0,5 ml GA-1000 wurden dem Medium nicht zugefügt, da es ein
Gentamycin-Amphotericin B Gemisch ist, also ein Antibiotikum und ein Antimykotikum.
- 42-

5 Methoden
Letzteres könnte den Versuch beeinflussen, da die Zellen mit A. fumigatus infiziert werden
sollten (Hope et al., 2007).
Die Zellen wurden in der Passage 6 in einer Dichte zwischen 3500 – 6000 Zellen / cm 2
ausgesät, je nachdem, wieviele Tage sie bis zum Versuch in Kultur genommen wurden. Dazu
wurden T75 Zellkulturflaschen mit je 15 ml oder T175 Zellkulturflaschen mit je 30 ml
EGM-2 Medium mit Zusätzen 30 min im Brutschrank equilibriert. Die HPAEC wurden,
nachdem sie aus flüssigem Stickstoff entnommen waren, direkt im 37 °C warmen Wasserbad
aufgetaut, desinfiziert, nach Herstellerangaben nicht mehr als zweimal aspiriert und in eine
Zellkulturflasche gegeben. Nach sofortigem Schwenken wurden die HPAEC mindestens 6 h
im Brutschrank ruhen gelassen, damit sie gut anwachsen konnten. Am nächsten Tag folgte der
Mediumwechsel. Dazu wurden das gesamte Medium abgenommen und durch frisches, 37 °C
warmes Medium ersetzt. Dieser Schritt war wichtig, um das DMSO aus dem Medium zu
entfernen, in dem die Zellen eingefroren waren. Nach 2 bis 4 Tagen wurden die Zellen
geerntet und sofort für den Versuch verwendet, so dass sich die Zellen immer in der 7.
Passage befanden. Um die Zellen zu ernten, wurde das Medium abgenommen, die Flasche
einmal mit 10 ml HBSS gewaschen und dann 5 ml Trypsin-EDTA dazugegeben, verteilt und
wieder entfernt. Nach 5 min Inkubation im Brutschrank lösten sich die Zellen ab und konnten
mit Hilfe von EGM-2-Medium in einem 15 ml Falcon-Röhrchen gesammelt werden. Die
Zellen wurden zentrifugiert (290 × g, 5 min) und in einer bestimmten Menge Medium
aufgenommen, um die Zellzahl zu bestimmen (5.3.3).
5.4.2 A-549
A-549 ist eine adhärente, als Monolayer wachsende Zelllinie aus einem humanen
Lungenkrebsgewebe (DSMZ). Sie wurde in EGM-2 Medium mit 10 % FCS kultiviert.
Das Auftauen und Ernten erfolgte wie unter 5.4.1 beschrieben, außer dass diese Zellen öfters
aspiriert werden durften und in einer Dichte von 1 × 10 6 Zellen / 80 cm 2 ausgesät wurden.
Auch hier folgte am nächsten Tag ein Mediumwechsel. Die Zellen wurden alle 3 bis 4 Tage
1 : 5 bis 1 : 10 gesplittet. Die Passage der A-549 Zellen war für die Durchführung des
Versuchs irrelevant.
- 43-

5 Methoden
5.4.3 Einfrieren von Zelllinien
Das Einfrieren der Zelllinien erfolgt in gekühltem Einfriermedium mit 70 % EGM-2 Medium,
20 % FCS und 10 % DMSO. Es wurden jeweils 3 × 10 6 Zellen in 1 ml aufgenommen und
sofort in gekühlte Kryotubes umgefüllt. Diese wurden in einem Kryoeinfriergerät
(Hartenstein, D) sofort zu -80 °C gestellt und über Nacht darin aufbewahrt, um ein langsames
Einfrieren zu garantieren. Am nächsten Tag konnten die eingefrorenen Zellen zur dauerhaften
Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden.
5.5 Alveolarepithelmodell
Um das Verhalten der DCs näher an ihrer natürlichen Umgebung zu analysieren, wurde ein
Modell für frühe IA in der Lunge verwendet (Hope et al., 2007). Dazu wurden
Lungenepithelzellen (A-549, siehe auch 5.4.2) und Endothelzellen der Aorta (HPAEC, siehe
auch 42) verwendet, die durch eine Membran voneinander getrennt waren. In dieses System
wurden nun moDCs oder mDCs gebracht und mit A. fumigatus konfrontiert.
Bei allen Schritten wurden die Lösungen und Medien auf 37 °C vorgewärmt. Die HPAEC
wurden auf eine Konzentration von 1,0 × 10 6 / ml EMB-2 Medium mit Zusätzen eingestellt.
Davon wurden jeweils 100 µl auf die Unterseite einer Transwellmembran (3,0 µM Polyester
Membran, 6,5 mm Insert, 24 WellPlate; Sigma-Aldrich, USA) pipettiert. Damit sich die
Zellen an der Membran anheften konnten, wurden sie bei 37 °C / 5 % CO2 inkubiert. Nach 2,5
bis 3 h wurde das Medium verworfen und die Membranen in eine 24-Well-Platte mit je 600 µl
EBM-2 Medium mit Zusätzen, das auf 37 °C equilibriert war, platziert. Damit die Zellen nicht
austrockneten, wurden 200 µl EBM-2 Medium mit Zusätzen in die Membranen gegeben und
über Nacht bei 37 °C / 5 % CO2 kultiviert. Am nächsten Tag wurden die A-549 Zellen
geerntet und auf eine Konzentration von 1,32 × 10 6 / 2 ml EMB-2 Medium (+ 10 % FCS)
eingestellt. Die Zahl ergab sich aus dem Wachstum der HPAEC über Nacht, so dass die
Zellzahl der beiden Zelllinien 1 : 1 betrug. Als erster Schritt wurden die 200 µl Medium aus
den Membranen herauspipettiert und die Membranen in eine frische 24-Well-Platte mit je
600 µl equilibriertem EMB-2 Medium mit Zusätzen gesetzt. Im zweiten Schritt wurden je
200 µl der A-549 Zellsuspension in die Membranen gegeben. Die nächsten 4 Tage wurden die
Zellen täglich gefüttert, indem jeweils für die HPAEC an der Membranunterseite frisches
EBM-2 Medium mit Zusätzen und für die A-549 an der Oberseite der Membran frisches
- 44-

5 Methoden
EBM-2 (+10 %FCS) gegeben wurde. Am 7. Tag erfolgte der eigentliche Versuch. Dazu
wurden 6-Tage alte moDCs oder 1-Tag alte mDCs geerntet und auf eine Konzentration von
2,5 × 10 6 / ml gebracht. Diese wurde entweder 1 : 1 mit EBM-2-Medium (+ 10 % FCS) für
den unstimulierten Ansatz oder mit frisch ausgekeimten, kurzen Keimschläuchen
(2,5 × 10 6 / ml in EBM-2 + 10 % FCS) für den stimulierten Ansatz vermischt. Nach einem
erneuten Umsetzen der Membranen in 600 µl frisches EBM-2-Medium wurden 200 µl der
Zell- / Pilzsuspension in die Membranen gegeben. Nach 0 h, 3 h oder 6 h Inkubation wurden
die Zellen in 1 ml HBSS hinein geerntet. Die HPAEC wurden getrennt von den A-549 +
moDCs / mDCs gesammelt. Es wurden jeweils zwei Ansätze gepoolt, um die Ausbeute zu
erhöhen. Daraufhin wurden die Zellen abzentrifugiert (5 min, 300 × g) und sofort mit
RLT-Puffer (+ 1 % Mercapthoethanol) (Qiagen, D) lysiert. Die RNA konnte direkt im
Anschluss isoliert oder das Zelllysat bei -80 °C eingefroren werden (siehe 47).
5.6 Microarray-Analyse
Die aus 5.5 gewonnene RNA wurde mit einem home-made Microarray analysiert. Es wurden
117 Gene für Zytokinantwort und Rezeptoren, die als immunrelevante Gene ausgewählt
wurden, mittels Sonden (55-70-mere in Antisense-Orientierung) der Firma Operon detektiert.
Frau Dr. Hauser vom Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB) der
Frauenhofer-Gesellschaft in Stuttgart leistete Beratung bei Auswahl und Design der Sonden.
5.6.1 Amplifikation der RNA
Die Qualität der isolierten RNA (5.7.3) wurde am Bioanalyzer mit dem Agilent RNA 6000
Nano Kit (Agilent, D) im Labor von Dr. Susanne Kneitz (Institut für Virologie und
Immunologie, Würzburg) überprüft. Damit die RNA mittels Microarray detektiert und
analysiert werden konnte, musste sie amplifiziert werden. Zuerst wurden 300 ng der isolierten
RNA in cDNA umgeschrieben. Im nächsten Schritt wurde ein zweiter Strang an die cDNA
synthetisiert. Da für die folgende in vitro Transkription durch eine T7-RNA-Polymerase eine
bestimmte Erkennungsstelle an der dsDNA gebraucht wurde, wurde dieser Strang mit T7
Oligo(dT) Primern synthetisiert, die eine Verlängerung aufwiesen, die einen Promoter für die
T7-RNA-Polymerase bildete. Nachdem die dsDNA aufgereinigt wurde, ließ man die T7-
RNA-Polymerase antisense RNA (aRNA) herstellen, welche erneut aufgereinigt wurde. Die
- 45-

5 Methoden
Durchführung erfolgte strikt nach dem Protokoll des Herstellers. Zuletzt wurde die
Konzentration der aRNA am NanoDrop (PeqLab, D) vermessen.
5.6.2 Labelling und cDNA Synthese
Um die einzelnen Proben miteinander vergleichen zu können, wurde ein Pool aus allen
verwendeten aRNAs hergestellt. Das Labeln der Proben wurde mittels LabelStar TM Array Kit
(Qiagen, D) nach dem Protokoll Direct Labeling of cDNA with Biotin-dUTP, Cyanine 3-
dUTP, or Cyanine 5-dUTP vorgenommen. Cy3 TM 3dUTP wurde 2 : 5 mit RNase-freiem
Wasser verdünnt, wodurch sich eine Endkonzentration von 8 µM ergab, Cy5 TM 3dUTP wurde
1 : 5 verdünnt, wodurch sich eine Endkonzentration von 4 µM ergab. Für die Synthese
wurden 500 ng aRNA eingesetzt.
5.6.3 Hybridisierung und Analyse
Die vom Labor Dr. Susanne Kneitz bedruckten Epoxy-Slides (Peqlab, D) wurden mit Puffer I
5 min, Puffer II 2 × 2 min und Puffer III 10 min prähybridisiert und 1 min mit Aqua demin.
gewaschen. Danach folgte 15 min Blocken mit 1 × Blocking Solution bei 50 °C und zweimal
Waschen mit je 250 ml Aqua demin. Durch Zentrifugation (130 × g, 5 min) wurden die
Epoxy-Slides getrocknet.
Die aRNA wurde mit 480 µl Hybridisierungspuffer 3 min in kochendem Wasser inkubiert,
bevor sie zum 16-stündigen Hybridisieren bei 42 °C auf die Slides gegeben werden konnte.
Am nächsten Tag wurden die Slides für jeweils 15 min mit Waschpuffer I, Waschpuffer II
und zuletzt Waschpuffer III gewaschen. Danach folgte ein Trockenzentrifugationsschritt
(130 × g, 5 min). Im Anschluss konnten die Slides eingescannt werden (ScanArray 4000,
BioChip Technologies, USA) und die Fluoreszenzintensitäten mit der Software ScanAlyze
(Eisenlab, USA) bestimmt werden.
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5 Methoden
5.7 Genexpressions- und Proteinstudien
5.7.1 Infektion der moDCs zur Analyse der Zytokinproduktion
Zur Analyse der Zytokinproduktion wurden jeweils 1 × 10 6 moDCs in 1 ml RPMI + 10 %
FCS aufgenommen und in eine 24-Well-Platte ausplattiert. Die Ansätze setzten sich
zusammen aus unstimuliert, + A. fumigatus (MOI = 1) und + LPS. Dazu wurden die Zellen
6 h bzw. 12 h mit dem entsprechenden Stimulanz behandelt. Daraufhin wurde die
Zellsuspension mit Hilfe einer 1000 µl Pipette aus den Wells geerntet und 5 min bei 2700 × g
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei -80 °C für spätere Proteinanalysen
eingefroren. Das Zellpellet wurde in 350 µl RLT + 1 % Mercaptoethanol (RNeasy ® Mini Kit,
Qiagen, D) lysiert und sofort weiterverarbeitet oder ebenfalls bei -80 °C eingefroren.
5.7.2 DNA Isolierung und Reinigung
Zur Analyse der CXCL10 SNPs wurde aus 200 µl des verdünnten Leukozytenkonzentrats
(siehe, 5.3.1) DNA extrahiert, bevor eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wurde.
Die Aufreinigung wurde anhand des QIA ® DNA Blood Mini Kits nach dem Protokoll Blood
and Body Fluid Spin Protocol vorgenommen. Abweichend wurde die DNA in 100 µl RNase-
freiem Wasser eluiert.
5.7.3 RNA Isolierung und Reinigung
Die RNA wurde aus dem präparierten Gewebe nach dem Protocol for Isolation of Total RNA
from Animal Cells (RNeasy ® Mini Kit, Qiagen, D) isoliert und aufgereinigt. Dazu wurden die
bereits lysierten Zellen (5.7.1) auf QIAshredder TM (Qiagen, D) gegeben und 2 min mit
maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Zellen zu homogenisieren. Das weitere
Vorgehen erfolgte strikt nach Herstellerangaben inklusive des optionalen Schritts 8a, in dem
die Säulen trockenzentrifugiert wurden. Die Zentrifugation wurde aus praktischen Gründen
von 15 sec auf 60 sec erhöht. Nach der Zugabe von 35 µl RNase-freiem Wasser auf die Säule
wurde eine weitere Inkubation von 60 sec eingeschoben. Für die Isolation der Gesamt-RNA
aus HPAEC und A-549 Zellen wurde die Homogenisierung über QIAshredder TM weggelassen,
um die Ausbeute zu erhöhen. Außerdem wurde nach Schritt 7 des Herstellerprotokolls der
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5 Methoden
Appendix D: Optional On-Column DNase Digestion with the RNase-Free DNase Set
eingefügt und das Wasser für die Elution auf 50 °C vorgewärmt.
Zur Bestimmung der Konzentration der gereinigten RNA bzw. DNA wurde eine Messung am
NanoDrop (PeqLab, D) durchgeführt. Für die Messung wurden 1 – 2 µl der gelösten RNA
bzw. DNA unverdünnt eingesetzt. Da die Basen als Nucleosidmonophosphate ihr
Absorptionsmaximum bei 260 nm haben (mit Ausnahme von 5'-CMP bei 280 nm) wurde die
Wellenlänge von 260 nm zur Berechnung der Konzentration verwendet. Die Wellenlängen
230 nm und 280 nm wurden verwendet, um sich ein Bild über die Reinheit der isolierten RNA
zu machen. Liegt der Quotient 260 nm / 280 nm bei 1,8 für DNA oder 2,0 für RNA ist die
gewonnene DNA oder RNA frei von Proteinkontaminationen, liegt der Quotient
260 nm / 230 nm bei 2,0 ist die gewonnene DNA oder RNA frei von
Zuckerverunreinigungen.
5.7.4 Reverse Transkription
Zum Umschreiben von RNA in cDNA wurde das QuantiTect Reverse Transcription Kit
(Qiagen, D) verwendet. Pro Ansatz wurden 500 ng RNA, die in 12 µl RNase freiem Wasser
gelöst war, zu 2 µl gDNA-Wipeout Puffer gegeben. Daraufhin folgte eine 5 min Inkubation
bei 42 °C mit anschließender Abkühlung auf Eis. In diesem Schritt wurde eventuell in der
RNA vorhandene genomische DNA verdaut. Für die Umschreibung der RNA in cDNA
wurden folgende Substanzen zu der RNA gegeben:
1 µl Quantiscript Reverse Transcriptase
4 µl Quantiscript RT Buffer
1 µl RT Primer Mix
Die Reaktion wurde in 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäßen im Mastercycler ep (Eppendorf, D) mit
folgendem Programm durchgeführt:
Step 1: 55 min bei 42 °C
Step 2: 3 min bei 95 °C
Step 3: ∞ bei 4 °C
Die gewonnene cDNA wurde für kurze Lagerung bei 4 °C aufbewahrt, für längere
Lagerzeiten bei -20 °C.
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5 Methoden
5.7.5 Realtime Polymerasekettenreaktion
Zur Quantifizierung von mRNA ist eine funktionierende Analytik notwendig, die Präzision,
Empfindlichkeit und Wiederholbarkeit liefert (Bustin, 2000). Real-time Reverse Transkriptase
Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) ist eine neuartige Methode zur Quantifizierung von
mRNA aus Zellgewebe oder Blut. Der Vorteil gegenüber konventioneller RT-PCR besteht
darin, dass bei dieser Methode die Amplifizierung von Fragmenten und die Analyse in einem
Schritt vollzogen werden. Dies wird durch spezielle fluoreszierende Substanzen
bewerkstelligt, zum Beispiel SYBR Green I (Morrsison et al., 1998), Fluoreszenz-
Resonanzenergietransfer (FRET) (Förster, 1946; Didenko, 2001) oder ABI's TaqMan (Heid et
al., 1996). Die analysierten Gene wurden relativ quantifiziert. Diese Methode basiert auf dem
Vergleich der Expression des Zielgens mit der Expression eines Referenzgens, auch
Housekeeping Gen genannt, das unter den verschiedenen physiologischen Zuständen immer
gleich stark exprimiert wird. Klassische Beispiele sind β-Aktin und Glycerinaldehyd-3-
phosphat Dehydrogenase (GAPDH) (Bustin, 2000). Für die Expressionsbestimmung von
Zytokinen und Rezeptoren primärer Humanzellen eignet sich am besten das Gen humane
δ-Aminolevulinatsynthase (h-Alas), da das Expressionsniveau gleichbleibend und auf der
gleichen Höhe ist wie die analysierten Gene.
5.7.5.1 Durchführung im LightCycler
Im LightCycler (Roche, D) wurde mit Hybridisierungs-Sonden designed von der Firma TIB-
Molbiol gearbeitet. Das FRET-System basierte hier auf der Hybridisierung zweier
fluoreszenz-gebundener Sonden. Dabei waren die Sonden am aufeinander zugerichteten Ende
mit Fluorophoren markiert, die Donor-Sonde mit Fluorescein, die Akzeptor-Sonde mit
LC Red. Da die Intensität der Fluoreszenz stark abhängig vom Abstand der beiden Sonden
war, wurden sie so synthetisiert, dass sie im Abstand von ein bis zwei Basenpaaren an das
PCR Produkt banden. Wurde nun das Fluorescein mittels blauem Licht (470 nm) vom
LightCycler angeregt, gab es die Energie strahlungslos an LC Red weiter. Diese Sonde
emittierte nun rotes Licht (640 nm), welches vom LightCycler gemessen werden konnte. Die
Intensität der Fluoreszenz war abhängig von der Menge an PCR-Produkt.
Die Expressionsstudie wurde mittels QuantiFast TM Probe PCR + ROX Vial Kit durchgeführt.
Der Mastermix bestand aus folgenden Reagenzien:
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5 Methoden
10 µl 2x QuantiFast Probe PCR Mastermix
1 µl 5 µM forward Primer
1 µl 5 µM reverse Primer
1 µl 3 µM LC-Sonde
1 µl 3µM FL-Sonde
4 µl RNase-freies Wasser
In den Kapillaren wurden zu den 18 µl Mastermix jeweils 2 µl Template oder RNase-freies
Wasser pipettiert. Mit Hilfe eines Adapters konnten die Kapillaren bei 400 × g für 15 sec
zentrifugiert und daraufhin in das Probenkarussell des LightCyclers gesetzt werden. Die
Durchführung der real-time PCR erfolgte unter folgenden Zyklenbedingungen:
Denaturierung: 3:00 min bei 95 °C
Hauptamplifikationsschritt: 45 Zyklen mit je
Kühlung: 0:30 min bei 40 °C
Denaturierung 0:15 min bei 95 °C
Primerannealing 0:10 min bei 55 °C
Elongation 0:05 min bis 0:13 min bei 72 °C
Die Elongation variierte abhängig von der Fragmentlänge des Amplifikats. Sie betrug für
humanes Alas 5 sec, CXCL10 6 sec, TNF-α 7 sec, IL12 p40 und Dectin-1 8 sec, IL10 und
TLR4 13 sec, CCL20 10 sec und TLR2 11 sec.
Für die Messung der SNPs wurde der Mastermix identisch hergestellt und folgende
Zyklusbedingungen angewandt:
Denaturierung: 3:00 min bei 95 °C
Hauptamplifikationsschritt: 45 Zyklen mit je
Schmelzkurve: 1 Zyklus mit
Denaturierung 0:09 min bei 95 °C
Primerannealing 0:15 min bei 55 °C
Elongation 0:20 min bei 72 °C
0:09 min bei 95 °C
0:40 min bei 40 °C
0:00 min bei 85 °C
Kühlung: 0:30 min bei 40 °C
Im letzten Schritt der Schmelzkurve heizt das Gerät mit einem Slope (°C / sec) von 0,1 bei
kontinuierlicher Messung.
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5 Methoden
Bei jeder Messung wurde ein Kalibrator mitgeführt, der mit den jeweiligen Proben verrechnet
wurde. Der Kalibrator war cDNA, die aus stimulierten Zellen hergestellt wurde. Für jedes
analysierte Gen musste die PCR-Effizienz bestimmt werden. Dazu wurde die Kalibrator-
cDNA in vier Schritten 1 : 5 verdünnt. Von der Ausgangs-cDNA wurde eine Probe
vermessen, von der ersten Verdünnung Duplikate, von der zweiten Triplikate. Dieses Schema
wurde bis zur vierten Verdünnung weiterverfolgt. Aus der Steigung der Regressionsgeraden
zu diesen Punkten ließ sich der Slope ablesen. Daraus konnte die Effizienz der Primer mit
folgender Formel berechnet werden:
Effizienz = 10 (-1 / slope) – 1
Da die Effizienz der PCR-Läufe gleich war, konnte die relative Expression über die ΔΔCT-
Methode berechnet werden:
relative Expression = 2 – (ΔC T sample – ΔC T h-ALAS) = 2 – ΔΔC T
Das erste Δ entsteht durch die Differenz zwischen der eigentlichen Probe und dem Kalibrator,
das zweite Δ durch die Normalisierung mit dem Housekeeping Gen.
5.7.5.2 Durchführung im StepOnePlus
Im StepOnePlus wurde mit TaqMan ® Gene Expression Assays von Applied Biosystems
(Foster City, USA) gearbeitet. Die Primer- und Sondensequenzen wurden von der Firma nicht
bekannt gegeben. Es handelte sich hierbei um Hydrolyse-Sonden, die ebenso auf FRET
basieren. Am 5'-Ende der Sonde befand sich ein Quencher (TAMRA), am 3'-Ende ein
Reporter-Fluoreszenzfarbstoff. Hybridisierte die Sonde in der Annealing Phase der PCR nun
am komplementären DNA-Strang, hydrolysierte die Taq-Polymerase mittels ihrer 5'-3'-
Exonuclease Aktivität die Sonde am 5'-Ende. Dadurch entfernten sich Quencher und
Fluorophor voneinander, und es konnte eine Fluoreszenz abhängig von der synthetisierten
DNA vermessen werden. Die Durchführung der PCR erfolgte strikt nach Herstellerangaben.
Zur Validierung der Microarrays wurden 25 ng aRNA eingesetzt und folgende
Zyklusbedingungen angewandt:
Denaturierung: 10:00 min bei 95 °C
Hauptamplifikationsschritt: 40 Zyklen mit je
Denaturierung 0:15 min bei 95 °C
Annealing / Elongation 0:09 min bei 60 °C
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5 Methoden
5.7.5.3 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Analyse der Länge und Qualität der im Light Cycler produzierten DNA-Fragmente wurde
das System der Agarose-Gelelektrophorese verwendet. Zur Herstellung eines Agarosegels
wurde 0,5 x TBE-Puffer mit 1,5 % Agarose in einer Mikrowelle erhitzt, um die Agarose zu
lösen. Nach dem Abkühlen auf ca. 60 °C wurde so viel Ethidiumbromid zu dem noch
flüssigen Agarosegel gegeben, dass eine Endkonzentration von 0,5 µg Ethidiumbromid auf
1 ml Agarosegel erreicht wurde. Danach füllte man dieses Gemisch in ein Gelgießgestell um
und ließ es dort durch Erkalten fest werden. Nach dem Überführen des Gels in eine
Elektrophoresekammer – gefüllt mit 0,5 × TBE-Puffer – wurde das Gel mit den DNA-Proben,
die im Vorfeld zu 1 / 10 mit Probenpuffer versetzt waren, beladen. Zusätzlich wurde auf jedes
Gel 10 µl Längenstandard (100 bp DNA Längenstandard, Invitrogen, D) zur Überprüfung der
Fragmentgröße aufgetragen. Die Agarose-Gelelektrophorese lief mit einer Spannung von
8 V / cm. Die so aufgetrennten DNA-Fragmente wurden mit Hilfe der
Ethidiumbromidfärbung und anschließender UV-Strahlung (322 nm) sichtbar gemacht.
5.7.6 ELISA
Zur Analyse der sezernierten Proteine wurde die Technik des Sandwich-ELISA's (enzyme-
linked immunosorbent assay) angewendet. Dazu wurde ein Antikörper (coating antibody) an
eine feste Oberfläche, hier eine 96-well-Microtiterplatte, gebunden, an den sich das zu
detektierende Antigen heften konnte. An diesen Komplex wurde ein weiterer Antikörper
gebunden, an den Biotin gekoppelt war. Um den hier entstandenen Antikörper-Antigen-
Antikörper-Komplex nachzuweisen, führte man eine enzymgesteuerte Farbreaktion durch.
Dazu wurde zuerst die Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HPR) an das Biotin
gebunden. Durch Zugabe des Chromogens Tetramethylbenzidin (TMB) kam es zu einem
Farbumschlag. Die Farbintensität konnte mittels eines ELISA-Readers bestimmt werden.
5.7.6.1 Durchführung nach Biosource
Zur Bestimmung von TNF-α und IL12+p40 wurden fertige ELISA-Kits (Biosource, D)
verwendet. Zuerst wurden je 100 µl des Erstantikörpers (1 µg / ml für IL12+p40, 2 µg / ml für
TNF-α) in eine 96-well-Mikrotiterplatte gegeben und abgedeckt über Nacht bei 4 °C
inkubiert. Diesen Schritt nennt man coaten. Darauf folgte der erste Waschschritt mit je 400 µl
Waschpuffer in einem ELISA-Washer. Mit Hilfe von 300 µl Assay Puffer pro Well wurde die
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5 Methoden
Platte 1 h bei Raumtemperatur geblockt. Es wurde erneut in gleicher Weise gewaschen. Die
Platte konnte für eine Woche bei 4 °C aufbewahrt oder sofort weiterverwendet werden. In
jedes Well wurden 100 µl Überstand (eventuell verdünnt abhängig von der Konzentration der
Proteine), Standard oder Assay Puffer (Negativkontrolle) pipettiert. Der Standard wurde in
einer Verdünnungsreihe mit 1000 pg / ml, 500 pg / ml, 250 pg / ml, 125 pg / ml, 62,5 pg / ml,
31,25 pg / ml und 15,625 pg / ml in Duplikaten aufgetragen. Zu den Proben wurden sofort
50 µl Detection Antibody (0,16 µg/ ml für IL-12+p40, 0,32 µg / µl für TNF-α) gegeben und
2 h bei 600 rpm und Raumtemperatur geschüttelt. Nach fünfmal Waschen wurden die Wells
für 30 min mit 100 µl Streptavidin-HPR (1 / 2500 verdünnt für IL12+p40, 1 / 1250 verdünnt
für TNF-α) inkubiert. Erneut wurde fünfmal gewaschen und je 100 µl TMB Substrat
zugesetzt. Die Farbreaktion wurde nach 5 - 30 min durch Zugabe von 100 µl 1,8 N H2SO4
abgebrochen. Innerhalb von 30 min nach Zugabe der Stopplösung wurde die Absorption bei
450 nm, mit der Substraktionskorrektur 650 nm, bestimmt. Die Berechnung der
Konzentrationen erfolgte automatisch mittels Microplate Manager (Biorad, D).
5.7.6.2 Home-made ELISA-Assays
Zur Detektion der Chemokine CCL20 und CXCL10 sowie des Zytokins IL10 wurden
In-House-Assays verwendet. Die 96-well-Microtiterplatte wurde mit 2 µg / ml CCL20,
CXCL10 oder IL10 Erstantikörper über Nacht bei Raumtemperatur gecoated. Die
Waschschritte erfolgten immer viermal mit je 300 µl Waschpuffer mittels ELISA-Washer.
Nach einem Waschschritt wurde 2 h mit 300 µl Blockinglösung geblockt. Auch diese Platte
konnte eine Woche bei 4 °C aufbewahrt oder sofort weiterverwendet werden. Das Auftragen
der Proben wurde wie unter 5.7.6.1 beschrieben durchgeführt, nur dass die Standards ab
40 000 pg / ml bis 19,5 pg / ml in 1 : 2 Verdünnung aufgetragen wurden. Nach 2 h Schütteln
(600 rpm) und einem Waschschritt wurden je 100 µl Zweitantikörper mit der Konzentration
4 µg / ml für CCL20, 0,4 µg / ml für CXCL10 oder 0,1 µl / ml für IL10 dazugegeben und
erneut 2 h geschüttelt (600 rpm). Nach erneutem Waschen wurde 20 min mit 100 µl
Streptavidin-HPR (1×) auf dem Schüttler (600 rpm) inkubiert. Die Farbreaktion erfolgte wie
unter 5.7.6.1 aufgeführt. Die Messung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm, mit
Substraktionskorrektur bei 570 nm, vorgenommen. Die Berechnung der Konzentrationen
erfolgte automatisch mittels des Microplate Manager (Biorad, D).
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5 Methoden
5.8 Konfrontationsuntersuchungen
5.8.1 Analyse der Oberflächenmarker
Zur Analyse der Rezeptoren auf 7-tägigen RAD-DCs im Vergleich zu EtOH-DCs wurden je
1 × 10 6 Zellen für 6 h, 12 h und 24 h mit A. fumigatus Keimschläuchen inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen geerntet und wie unter 5.3.11 beschrieben angefärbt. Es
wurden die Einzelfärbung Dectin-1 PE mit Isotypkontrolle IgG2b und die Doppelfärbungen
CD1a FITC / TLR2 PE, CD14 FITC / TLR4 PE und CD14 FITC / HLA-DR-PE mit der
Isotypkontrolle IgG2a FITC / IgG2a PE am Durchflusszytometer vermessen. Zur Analyse der
Reifemarker wurden je 1 × 10 6 Zellen moDCs 36 h mit EtOH-inaktivierten A. fumigatus
Keimschläuchen inkubiert und die Doppelfärbungen CD1a FITC / CD40 PE, CD1a FITC /
CD80 PE, CD14 FITC / CD83 PE, CD14 FITC / CD86 PE und die Isotypkontrolle IgG2a
FITC / IgG1 PE am Durchflusszytometer vermessen.
5.8.2 T-Zell-Proliferations Assay
Serum-Heparin EtOH-DCs bzw. RAD-DCs (5.3.6) wurden generiert und am fünften Tag mit
A. fumigatus (MOI = 1), humanem Cytomegalovirus Antigen pp65 (100 µg / ml, Miltenyi
Biotec, D) oder zur Kontrolle ohne Zusatz für 48 h mit den Zusätzen 10 nM RAD oder EtOH
stimuliert. Anschließend wurden die moDCs geerntet und gewaschen, um bereits
ausgeschüttete lösliche Faktoren und Zytokine zu entfernen, die diesen Assay beeinflussen
könnten, und die Zellzahl wurde bestimmt. Allogenen, frisch isolierten CD8 + -T-Lymphozyten
wurden in AIM-V-Medium mit 0,5 µM CSFE auf 1 × 10 6 Zellen aber mindestens in 3 ml mit
15 µM CSFE 15 min lang bei 37 °C und 5 % CO2 gefärbt. Nach zweimal waschen in AIM-V-
Medium wurden die CD8 + -T-Lymphozyten mit moDCs vermischt. Es wurden jeweils 50 000
moDCs sowie 500 000 CD8 + -T-Lymphozyten (Verhältnis 1 : 10) in einem Gesamtvolumen
von 1 ml AIM-V-Medium (10 % humanes Serum, 10 IU / ml IL2, 75 ng / ml GM-CSF,
15 ng / ml IL-4) aufgenommen und in einer 24-Well Platte ausplattiert. Dazu wurden zwei
Kontrollen ohne moDCs mitgeführt, die erste enthielt nur CD8 + -T-Lymphozyten (negativ),
die zweite CD8 + -T-Lymphozyten, die mit M-Typ Phytohemagglutinin (2,25 % vol / vol,
Invitrogen, D) stimuliert waren (positiv). Nach 2 Tagen wurde zu den Zellen 1 ml AIM-V-
Medium (10 % humanes Serum, 10 IU / ml IL2, 75 ng / ml GM-CSF, 15 ng / ml IL-4)
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5 Methoden
gegeben, wodurch sich die Zytokinendkonzentrationen von 5 IU / ml IL2, 37,5 ng / ml GM-
CSF, 7,5 ng / ml IL4 ergaben. An Tag 4 wurde noch ein Mediumwechsel vollzogen, indem
1 ml pro Well abgenommen, zentrifugiert (10 min, 300 × g) und das Pellet mit 1 ml AIM-V-
Medium (10 % humanes Serum, 10 IU / ml IL2, 75 ng / ml GM-CSF, 15 ng / ml IL-4) dem
Well zurückgegeben wurde. Am 7. und 9. Tag der Kokultur wurde die Proliferation der CD8 + -
T-Lymphozyten am Durchflusszytometer (FACS Calibur, Becton Dickinson, D) vermessen
(Ok et al., 2009).
5.8.3 Oxidativer Burst
Die Messung des oxidativen Bursts neutrophiler Granulozyten basiert auf dem
Dichlorofluorescein-Diacetat (DCFH-DA), welches durch Sauerstoffradikale in das grün
fluoreszierende Dichlorofluorescein (DCF) konvertiert wird (Lessing et al., 2007). Das
nichtionische und unpolare DCF-DA dringt über intrazelluläre Esterasen in die Zellen ein und
wird dabei zum DCFH deacetyliert. Produziert die Zelle nun Sauerstoffradikale, wird DCFH
zu dem Fluoreszenzfarbstoff DCF oxidiert. Die gemessene Fluoreszenz ist direkt proportional
zur Konzentration der produzierten Sauerstoffradikale (Wang, Joseph, 1999).
Frisch isolierte Granulozyten (5.3.9) wurden auf eine Konzentration von 4,0 × 10 6 / ml RPMI
(+ 5 % FCS) eingestellt und mit 2,5 µM DCF-DA gefärbt. Danach wurden die PMNs auf vier
verschiedene Ansätze aufgeteilt und mit 1 µM RAD, 10 nM RAD oder der entsprechenden
Menge EtOH 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde dieselbe Menge an
RAD oder EtOH erneut dazugegeben, um die Konzentration der Detergenzien
aufrechtzuerhalten, da die Zellsuspension anschließend für die eigentliche Reaktion 1 : 2
verdünnt wurde. Daraufhin wurden jeweils 50 µl Zellsuspension (2 × 10 5 PMNs) zu 50 µl
Pilzsuspension (1 × 10 6 Konidien oder Keimschläuche), zu 50 µl PMA (50 ng / ml) als
Positivkontrolle oder zu 50 µl RPMI-Medium (+ 5 % FCS) als Negativkontrolle in eine 96-
Well Microplatte gegeben. Von jedem Ansatz wurden vier Replikate vermessen. Nach dem
Starten der Reaktion wurde die Messung (Extinktion = 485 nm, Emission = 520 nm) in einem
Fluoreszenzmessgerät bei 37°C gestartet und in 5 min Intervallen eine Zeitkinetik für 145 min
aufgenommen.
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5 Methoden
5.8.4 Phagozytose-Assay
5.8.4.1 Durchführung mit Dextran-Beads
In einem Vorversuch wurden 1 × 10 5 , 7-tägige EtOH-DCs und RAD-DCs für 1 h bei 37 °C
mit 1 mg / ml FITC-Dextran-Konjugaten (Invitrogen, D), die auf 37 °C vorgewärmt waren,
inkubiert. Danach wurden die Zellen mit HBSS (+ 10 % FCS) gewaschen, in einem
Gesamtvolumen von 400 µl aufgenommen und am Durchflusszytometer vermessen. Es wurde
die mittlere Fluoreszenzintensität der moDCs bestimmt.
5.8.4.2 Durchführung mit Aspergillus fumigatus Konidien
Um die Phagozytose der moDCs zu überprüfen, wurden 2 × 10 7 Konidien in 1 ml farblosem
RPMI-Medium aufgenommen und bei 4 °C über Nacht mit 0,1 mg FITC gefärbt. Am
nächsten Tag wurden die Konidien mindesten vier Mal mit farblosem RPMI gewaschen, bis
keine gelbliche Färbung mehr zu erkennen war, und auf 2 × 10 7 Konidien / ml eingestellt. Die
gefärbten Konidien oder Medium als Negativkontrolle wurden mit 2 × 10 5 moDCs 2 h
inkubiert (Bozza et al., 2002; Gafa et al., 2006). Die moDCs, die Konidien phagozytiert
hatten, konnten als FITC-positiv im Durchflusszytometer gemessen werden.
5.8.5 Plattenbasierter Abtötungsversuch
Mit einem plattenbasierten Abtötungsversuch war es möglich, die Fähigkeit der EtOH-DCs
im Vergleich zu RAD-DCs zu testen, A. fumigatus direkt abzutöten. Dazu wurden 1 × 10 5
moDCs, bzw. Medium als Negativkontrolle in eine 24-Well Platte für Suspensionszellen
ausplattiert und mit 2 × 10 5 frisch ausgewachsenen Keimschläuchen konfrontiert (MOI = 2),
so dass das Gesamtvolumen 500 µl betrug. Nach den Zeitpunkten 0 h, 2 h, 4 h und 6 h wurde
die Reaktion mittels 1,5 ml kaltem Wasser demin. abgestoppt und alles gut mit der Pipette
aspiriert. Es wurde mit Duplikaten gearbeitet. Um Einzelkolonien zu erhalten, musste die
Zell-Pilzsuspension erneut 1 : 10 verdünnt werden. Davon wurden jeweils zwei 75 µl
Aliquots auf Sabouraud-Agar ausplattiert. Die ausplattierten Pilze ließ man 18 h bei 37 °C
wachsen, woraufhin mit dem Zählgerät ProtoCol (Synbiosis, UK) die Anzahl der Kolonien
bestimmt wurde. Um die einzelnen Spender miteinander vergleichen zu können, wurde die
Kontrolle ohne moDCs auf 100 % gesetzt und die Ansätze mit Zellen darauf bezogen.
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5 Methoden
5.9 Statistik
Alle statistischen Auswertungen wurden mit STATISTICA 8.0 (StatSoft) und einem
zweiseitigen Student's t Test berechnet. Alle Experimente wurden mit mindestens drei
unabhängigen Blutspendern durchgeführt. Statistische Signifikanz ist gegeben, wenn p < 0,05.
Als niedrig signifikant wurde p < 0,1 definiert, und als ns werden nicht signifikante Daten
bezeichnet.
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6 Ergebnisse
6 Ergebnisse
6.1 Kontrolle der Reinheit der isolierten, primären Zellen
Während dieser Studie kamen verschiedene frisch isolierte, primäre Zellenpopulationen, die
entweder aus frisch abgenommenem Blut oder Leukozyten-Reduktions-System Kammern
(LRSCs) isoliert wurden, zum Einsatz (Tab. 5.1). Da die Isolation der einzelnen Zellen neu
optimiert wurde und es für diese Studie notwendig war, mit hochreinen Zellen zu arbeiten, ist
im Folgenden die Reinheit der Populationen charakterisiert über ihre Oberflächenmarker
aufgelistet.
Granulozyten wurden aus frisch abgenommenem Blut von freiwilligen Spendern mit
Dichtegradientenzentrifugation auf Polymorphprep aufgereinigt und mittels des spezifischen
Oberflächenmarkers CD66b auf ihre Reinheit getestet. Die Funktion von CD66b ist noch
unbekannt. Die Ausbeute betrug ca. 20 × 10 6 PMNs pro 9 ml Blut. Die Reinheit betrug
> 90 % (Abb. 6.1).
Abbildung 6.1: Analyse der aufgereinigten Granulozyten im Durchflusszytometer. Links:
Darstellung der Forward- und Sidescatter als Dot Plot eines exemplarischen Spenders. R1
markiert die Region der zur Analyse verwendeten Zellen. Rechts: Histogramm des CD66
Markers (blau) auf Granulozyten im Vergleich zur Isotypkontrolle (grün).
Im Großteil dieser Arbeit wurde mit moDCs gearbeitet. Dazu wurden Monozyten aus einer
LRSC isoliert, und über 5 bis 7 Tage durch Zugabe von IL4 und GM-CSF moDCs aus den
Monozyten generiert. Die Reinheit der Monozyten betrug mehr als 90 % und sie konnten als
stark CD14 positiv (Abb. 6.2 A) sowie leicht CD1a positiv definiert werden. Die Ausbeute
der Monozyten aus den PBMCs betrug 20 %. Nach 7 Tagen Generierung der moDCs betrug
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6 Ergebnisse
deren Ausbeute 1 / 3 der eingesetzten Monozyten. Ein Test der doppelten Menge an IL4
zeigte keinen Einfluss auf die Morphologie und die Expression der Oberflächenmarker der
differenzierten Zellen, wie bereits von Colic et al. (2003-1) publiziert. Die Population der
moDCs wies eine Reinheit von mehr als 85 % auf und war stark CD1a positiv sowie komplett
CD14 negativ (Abb. 6.2 B). CD1a ist ein MHC-Klasse I ähnliches Molekül, das eine
Bedeutung in der Antigenpräsentation hat. Der monozytäre Marker CD14 hingegen fungiert
als Rezeptor für den Komplex aus LPS und dem lipopolysaccharidbindenden Protein.
Abbildung 6.2: Analyse der aufgereinigten Monozyten (A) und der daraus generierten
moDCs (B) im Durchflusszytometer. Links: Darstellung der Forward- und Sidescatter als
Dot Plot eines exemplarischen Spenders. R1 markiert die Region der zur Analyse
verwendeten Zellen. Unter (A) ist noch eine zweite Zellpopulation, bestehend vor allem aus
Makrophagen, zu erkennen, die mit R2 markiert wurde. Rechts: Histogramm des CD1a
(blau) bzw. CD14 Markers (magenta) auf Monozyten (A) und moDCs (B) im Vergleich zur
Isotypkontrolle (grün).
- 59-

6 Ergebnisse
In dieser Studie wurden außerdem mDCs direkt aus einer LRSCs isoliert. Die Reinheit dieser
Zellen betrug über 80 % (Abb. 6.3) und wurde über den Oberflächenmarker CD11c definiert
(siehe auch 3.2.2). CD11c ist die αX Untereinheit des Integrins Komplementrezeptor 4 und
bindet Fibrinogen.
Abbildung 6.3: Analyse der aufgereinigten myeloiden dendritischen Zellen im
Durchflusszytometer. Links: Darstellung der Forward- und Sidescatter als Dot Plots eines
exemplarischen Spenders. R1 markiert die zur Analyse verwendeten Zellen. Rechts:
Histogramm des CD11c Markers (blau) auf moDCs im Vergleich zur Isotypkontrolle (grün)
und des Markers CD1c (rot) im Vergleich zu seiner entsprechenden Isotypkontrolle
(magenta).
Abbildung 6.4: Analyse der aufgereinigten CD8 + -T-Lymphozyten im Durchflusszytometer .
Links: Darstellung der Forward- und Sidescatter als Dot Plot eines exemplarischen Spenders.
R1 markiert die Region der zur Analyse verwendeten Zellen. Rechts: Histogramm des CD 3
Markers (blau) auf CD8 + -T-Lymphozyten im Vergleich zur Isotypkontrolle (grün).
- 60-

6 Ergebnisse
Des Weiteren wurden CD8 + -T-Lymphozyten aus einer LRSCs isoliert. Die CD8 + -T-
Lymphozyten wurden über den Oberflächenmarker CD3 identifiziert, der mit dem Antigen-
Rezeptor von T-Lymphozyten (TCR) assoziiert und notwendig für die Signalübertragung von
TCR ist.
6.2 Einfluss von RAD als Beispiel eines Immunsuppressivums auf
das Pilzwachstum
Rapamycin, aus dem das RAD abgeleitet wurde, ist ein Bakterienderivat mit antimykotischer
Wirkung. Da die Interaktion von humanen Immuneffektorzellen mit A. fumigatus untersucht
werden soll, war es zunächst essentiell, einen möglichen Einfluss von RAD auf den Pilz
auszuschließen.
Abbildung 6.5: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme kurzer A. fumigatus Keimschläuche
zur Überprüfung des Wachstums (40x). Das Wachstum der Pilze war unter EtOH-
Behandlung (A) vergleichbar mit dem Wachstum unter Zugabe von 10 nM RAD (B). Weiß
ist die anfängliche Länge der Keimschläuche vermessen, die mit FITC-Färbung markiert
war, schwarz der in den 2 h gewachsene Teil des Keimschlauchs. (C) zeigt das
durchschnittliche Wachstum von A. fumigatus ohne und mit 10 nM RAD. Mittelwerte ±
Standardabweichung, n = 3 unabhängige Versuchsdurchführungen, p = 0,91; Student's t
Test.
- 61-

6 Ergebnisse
Deshalb wurde ein Wachstumsexperiment durchgeführt, worin überprüft werden sollte, ob
RAD in der eingesetzten Konzentration (= 10 nM) inhibitorische oder toxische Eigenschaften
besitzt. Dazu wurden kurze Keimschläuche von A. fumigatus 2 h mit RAD oder EtOH zur
Kontrolle inkubiert. Anschließend erfolgte eine Vermessung des Wachstums der
Keimschläuche am Fluoreszenzmikroskop. Gleichzeitig wurde die Anzahl der verbliebenen
Konidien überprüft.
Nach 2 h Inkubation waren die Keimschläuche mit Zusatz EtOH im Durchschnitt um 128 %
gewachsen, die Keimschläuche mit Zusatz RAD im Durchschnitt um 130 %. Es zeigte sich
somit kein signifikanter Unterschied im Wachstum der A. fumigatus Keimschläuche
(Abb. 6.5). Außerdem war die Anzahl der Keimschläuche in allen mikroskopischen
Aufnahmen vergleichbar. Dennoch war eine höhere Konzentration von RAD (= 10 µM)
durchaus in der Lage, das Wachstum der Keimschläuche zu inhibieren und auch die Zahl der
Keimschläuche zu reduzieren (Daten nicht gezeigt).
6.3 Einfluss von RAD auf neutrophile Granulozyten
Als Readout, um den Einfluss von RAD auf neutrophile Granulozyten zu bestimmen, wurden
Sauerstoffradikale gemessen. In einer früheren Studie (Mezger, 2007) wurde gezeigt, dass
1 µM RAD bei direkter Zugabe auf Neutrophile keinen Einfluss auf die Zellen hat, sowohl in
Bezug auf den oxidativen Burst als auch auf deren Fähigkeit, das Pathogen A. fumigatus
abzutöten. Deshalb wurde überprüft, ob nach einer Vorinkubation mit 1 µM RAD, zum
Vergleich mit der Studie von Mezger (2007), und mit 10 nM RAD, die in dieser Studie primär
verwendete Konzentration, ein inhibitorischer Effekt auf den oxidativen Burst auftritt. Die
Vermessung des oxidativen Burst erfolgte nach Zugabe von DCF, das bei Bildung von
Sauerstoffradikalen grün fluoresziert, mittels ELISA Readers. Durch 30 Messungen im 5 min
Takt wurde eine Zeitkurve aufgezeichnet.
Die Produktion der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) der Neutrophilen nahm nach
Stimulation mit PMA als Positivkontrolle oder A. fumigatus in einer Wachstumskurve stetig
zu (Abb. 6.6A). Nach 100 min gelangten die Neutrophilen, die mit PMA stimuliert waren, in
die Plateauphase. Dieses Plateau war nach Zugabe von RAD zu diesem Zeitpunkt noch nicht
erreicht, was bedeutet, dass diese Zellen weniger ROS herstellten. In der jeweiligen
Negativkontrolle mit Medium war kein Unterschied zwischen Kontrolle und RAD-
- 62-

6 Ergebnisse
Behandlung zu beobachten. Nach Stimulation mit Keimschläuchen sah man eine signifikante,
dosisabhängige Reduktion der ROS Produktion (Abb. 6.6B). Dabei war die Reduktion nach
Zugabe von 1 µM RAD bereits nach 90 min der Reaktion signifikant (p = 0,045), nach
Zugabe von 10 nM erst nach 120 min (p = 0,048). Die Reduktion betrug im Durchschnitt
23 % ± 14 % bei der Behandlung mit 1 µM RAD, dagegen aber nur 14 % ± 11 % bei der
Behandlung mit 10 nM RAD.
Abbildung 6.6: Oxidativer Burst neutrophiler Granulozyten. Relative Fluoreszenzintensität
(RFU) während des Verlaufs des oxidativen Bursts eines repräsentativen Spenders über
145 min (A). Die Zellen wurden mit 2,5 µM DCF gefärbt, 1 h mit 1 µM RAD oder EtOH als
Negativkontrolle vorbehandelt und daraufhin mit A. fumigatus Keimschläuchen konfrontiert.
(B) zeigt den Mittelwert ± Standardabweichung zu den Zeitpunkten 60 min, 90 min und
120 min, n = 6; Student's t Test zwischen der EtOH-Kontrolle und den RAD behandelten
Neutrophilen, ns = nicht signifikant.
- 63-

6 Ergebnisse
6.4 Einfluss von RAD auf moDCs
Für die Analyse von DCs unter RAD wurden die im Folgenden aufgelisteten Readouts
verwendet.
6.4.1 Ausdifferenzierung der moDCs
In dieser Studie wurden während der Ausdifferenzierung der Monozyten zu dendritischen
Zellen am Tag der Isolation und am Tag +2, +4, +6 je 10 nM RAD und zur Kontrolle EtOH,
das Lösungsmittel von RAD, dazugegeben. Die mit RAD behandelten Zellen werden im
Folgenden auch als RAD-DCs bezeichnet, die Kontrollzellen auch als EtOH-DCs.
Abbildung 6.7: Histogramm der Oberflächenmarker auf moDCs. Darstellung des Forward-
und Sidescatters als Dot Plot eines exemplarischen Spenders nach 7-tägiger Behandlung mit
EtOH (A) oder 10 nM RAD (B). R1 markiert die Region der zur Analyse verwendeten
Zellen. In den Histogrammen (C,D) der FITC-Färbungen sind die Isotypkontrolle (blau
Mouse IgG2a FITC), die RAD-DCs (rot) und die EtOH-DCs (grün) dargestellt. moDCs
wiesen den Oberflächenmarker CD1a auf (C). Der Oberflächenmarker CD14 (D) der
Monozyten, aus denen sie generiert wurden, wurde nicht mehr exprimiert. Die Abbildungen
sind repräsentativ für 6 unabhängige Spender.
- 64-

6 Ergebnisse
Durch die Analyse am Durchflusszytometer nach Färbung der Zellen mit den Antikörpern
CD1a, CD14 und HLA-DR (= MHCII) wurde überprüft, ob Monozyten unter dem 7-tägigen
Einfluss des RADs zu dendritischen Zellen ausreifen. Die Analyse weiterer Marker auf diesen
Zellen kann in Kapitel 6.4.3 nachgelesen werden.
Die moDCs bildeten eine einheitliche Population (Abb. 6.7A, B), die sich in der Region R1
befand. Die Zellen, die mit RAD behandelt worden waren, waren einheitlich kleiner und
weniger granulär als die Kontrollzellen, wie im SSC/FSC dargestellt ist. Dazu wiesen die
RAD-behandelten moDCs einen 5-fach höheren Anteil an toten Zellen auf, da RAD
signifikant (p < 0,001) mehr Apoptose in den Zellen ausgelöst hatte. Durch die Behandlung
mit EtOH waren 77 % ± 9 % der DCs lebend, durch die Behandlung mit RAD 59 % ± 22 %.
Das Histogramm der Fluoreszenzen (Abb. 6.7C, D) zeigt, dass die Expressionen der
Oberflächenmarker CD1a + und CD14 - der Kontrollzellen genau den RAD-DCs gleicht.
Abbildung 6.8: Fluoreszenzintensitäten des HLA-DR auf unreifen moDCs (0 h), nach 6 h,
12 h und 24 h Stimulation mit A. fumigatus oder LPS. Die Analyse erfolgte anhand
200 000 Zellen nach Färbung mit PE-markierten Antikörpern gegen die entsprechenden
Oberflächenmarker im Durchflusszytometer. Vermessen wurde die mittlere
Fluoreszenzintensität der Histogramme. Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 3; p-Werte
aus Student's t Test zwischen der EtOH-Kontrolle und den RAD behandelten moDCs, ns =
nicht signifikant.
Außerdem wurde die Ausbildung und Hochregulation des Haupthistokompatibilitäts-
komplexes II (MHCII) bestimmt, da er für die Funktion der dendritischen Zellen in vivo, das
Immunsystem anzuregen, essentiell ist. Es zeigte sich, dass unreife RAD-DCs signifikant
weniger MHCII, der mittels HLA-DR-PE gemessen wurde, exprimierten (p = 0,002)
(Abb. 6.8). Aber nach Konfrontation mit A. fumigatus oder LPS fand sich ein erhöhter
Anstieg des HLA-DR in RAD-DCs, wodurch sich die Expression von MHCII den EtOH-DCs
- 65-

6 Ergebnisse
anglich. Aus diesem Ergebnis wurde für die folgenden Experimente geschlossen, dass RAD
nicht die Ausdifferenzierung der Vorläuferzellen zu moDCs beeinflusst.
6.4.2 Expression von den Rezeptoren TLR2, TLR4 und Dectin-1 auf
moDCs
A. fumigatus wird von DCs über bestimmte Rezeptoren erkannt. Bereits bekannte Rezeptoren
sind unter anderem TLR2, TLR4 und Dectin-1. Deshalb wurde überprüft, ob die
zellspezifische Erkennung des Pilzes nach Zugabe von 10 nM RAD über 7 Tage beeinflusst
wird, indem die Ausbildung dieser Rezeptoren gehemmt wird. Die Expression der Rezeptoren
wurde in unstimulierten, für 6 h mit A. fumigatus konfrontierten und mit LPS behandelten
moDCs mittels real-time PCR bestimmt.
Abbildung 6.9: Relative Expression von drei Rezeptoren für A. fumigatus auf moDCs.
Expression von (A) TLR2, (B) TLR4 und (C) Dectin-1 auf unreifen moDCs (unst), nach 6 h
Stimulation mit A. fumigatus und nach 6 h Stimulation mit LPS normalisiert zu h-Alas. Die
weißen Balken stellen die EtOH-DCs dar, die schwarzen Balken die RAD-DCs. Mittelwerte
± Standardabweichung, n = 6; p-Werte aus Student's t Test zwischen der EtOH-Kontrolle
und den RAD behandelten moDCs, ns = nicht signifikant.
- 66-

6 Ergebnisse
TLR2 war in unstimulierten moDCs nicht hoch exprimiert (Abb. 6.9A). Die Expression stieg
erst nach Stimulation mit A. fumigatus 15-fach an, nach Stimulation mit LPS hingegen nur
4-fach. Unter Behandlung mit RAD wurde die Expression signifikant reduziert, nach
Stimulation mit A. fumigatus um 68 % ± 17 %, nach Stimulation mit LPS um 53 % ± 29 %.
TLR4 verhielt sich gegensätzlich, da er hoch in unstimulierten moDCs exprimiert war und
nach Konfrontation mit A. fumigatus um das 5-fache, nach Konfrontation mit LPS um das
2-fache sank (Abb. 6.9B). Hier war wiederum die Stimulation mit A. fumigatus effektiver als
die mit LPS. Da die Expression von TLR4 stark reduziert war, konnten keine signifikanten
Unterschiede zwischen EtOH-DCs und RAD-DCs beobachtet werden. Allerdings zeigte sich
in der unstimulierten Kontrolle eine Reduktion der Expression um 86 % ± 9 % nach 7 tägiger
Zugabe von RAD im Vergleich zur EtOH-Kontrolle. Auch die Expression von Dectin-1 ging
nach Stimulation mit A. fumigatus oder LPS um jeweils das 2-fache bzw. 5-fache hinunter
(Abb. 6.9C). Im Gegensatz zu den Toll-like Rezeptoren war die Expression des Dectin-1 bei
RAD-DCs hochsignifikant erhöht. In den unstimulierten EtOH-DCs betrug die Expression im
Vergleich zu RAD-DCs 32 % ± 5 % weniger, in A. fumigatus behandelten moDCs 40 % ±
7 % weniger und in LPS behandelten moDCs 13 % ± 5 % weniger.
Abbildung 6.10: Fluoreszenzintensitäten von den Rezeptoren TLR2 und Dectin-1 auf moDCs.
Expression von (A) TLR2 und (B) Dectin-1 unreifen moDCs (0 h), nach 6 h, 12 h und 24 h
Stimulation mit A. fumigatus oder LPS. Die Analyse erfolgte anhand 200 000 Zellen nach
Färbung mit PE-markierten Antikörpern gegen die entsprechenden Oberflächenmarker im
Durchflusszytometer. Vermessen wurde die mittlere Fluoreszenzintensität der Histogramme.
Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 3; p-Werte aus Student's t Test zwischen der EtOH-
Kontrolle und den RAD behandelten der mit A. fumigatus stimulierten moDCs.
Zur Validierung dieses unerwarteten Ergebnisses wurde die Expression der Rezeptoren auf
der Zelloberfläche im Durchflusszytometer überprüft. Um einen besseren Überblick zu
- 67-

6 Ergebnisse
erhalten, wurde ein Zeitverlauf von 0 h, 6 h, 12 h und 24 h erstellt. Der TLR4 Rezeptor wurde
von moDCs in so geringem Maße auf der Zelloberfläche exprimiert, dass er mittels
Durchflusszytometrie nicht nachweisbar war (Daten nicht gezeigt). In Hinblick auf TLR2
bestätigte sich größtenteils das Bild der RT-PCR Daten. Die Expression des Rezeptors TLR2
war relativ konstant, zeigte jedoch im Gegensatz zur RT-PCR-Analyse keine signifikanten
Unterschiede zwischen EtOH-DCs und RAD-DCs (Abb. 6.10A). Dectin-1 hingegen zeigte
auf Proteinebene ein anderes Verhalten als auf mRNA-Ebene, da die Expression zu allen
Zeitpunkten signifikant reduziert war (Abb. 6.10B). Dabei exprimierten die RAD-DCs zum
Zeitpunkt 0 h 63 % ± 6 % weniger Dectin-1. Nach 6 h betrug der Unterschied -54 % ± 0,2 %,
nach 12 h -54 % ± 8 % und nach 24 h -61 % ± 10 %.
6.4.3 Ausreifen der moDCs nach Konfrontation mit Aspergillus fumigatus
oder LPS
DCs regulieren nach Konfrontation mit A. fumigatus die Expression bestimmter
kostimulatorische Faktoren hoch, die in unreifen moDCs auf einem gewissen Grundlevel
vorhanden sind. Über diese kostimulatorische Faktoren können Pilzantigene dem
Immunsystem präsentiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die Behandlung mit RAD
einen Einfluss auf die Expression der Oberflächenmarker sowohl in unreifen als auch in
stimulierten moDCs hatte.
Der Oberflächenmarker CD40 war in allen drei untersuchten Zustandsformen der moDCs
signifikant reduziert (unstimuliert: -47 % ± 8 %, + A. fumigatus: -30 % ± 6 %, + LPS: -44 %
± 11 %) (Abb. 6.11A). Jedoch fand sich kein Unterschied bei CD80 in allen Zuständen und
bei CD86 nach Inkubation mit A. fumigatus oder LPS, obwohl die Expression dieser
Oberflächenmarker durch CD40 angeregt wird. CD86 war nur in unreifen moDCs um 54 % ±
16 % reduziert und nach Stimulation glichen sich die RAD-DCs den EtOH-DCs an. Der
Oberflächenmarker CD83 war in RAD-DCs immer herunterreguliert (unstimuliert: -41 % ±
17 %, + A. fumigatus: -24 % ± 17 %, + LPS: -36 % ± 12 %), jedoch durch die Varianz der
einzelnen Spender war diese Regulation nach Konfrontation mit A. fumigatus nicht
signifikant.
- 68-

6 Ergebnisse
Abbildung 6.11: Fluoreszenzintensitäten der Oberflächenmarker (A) CD40, (B) CD80, (C)
CD83 und (D) CD86 auf unreifen moDCs (unst), nach 36 h Stimulation mit
A. fumigatus und nach 36 h Stimulation mit LPS in Bezug auf die Isotypkontrolle. Die
weißen Balken stellen die EtOH-DCs dar, die schwarzen Balken die RAD-DCs. Die Analyse
erfolgte anhand 200 000 Zellen nach Färbung mit PE-markierten Antikörpern gegen die
entsprechenden Oberflächenmarker im Durchflusszytometer. Vermessen wurde die mittlere
Fluoreszenzintensität der Histogramme. Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 8; p-Werte
aus Student's t Test zwischen der EtOH-Kontrolle und den RAD behandelten moDCs, ns =
nicht signifikant.
6.4.4 Ausschüttung von Zytokinen
DCs aktivieren aber nicht nur über kostimulatorische Moleküle T-Lymphozyten, sondern
schütten zusätzlich Zytokine aus. Zu den wichtigsten pro-inflammatorischen Zytokinen
zählen IL12-p40 und TNF-α, IL10 ist im Vergleich dazu ein bedeutendes anti-
inflammatorisches Zytokin. Wie auch im Kapitel 6.5 gezeigt, ist CCL20 das Chemokin, das
nach Konfrontation mit A. fumigatus am meisten hochreguliert wird. Es wurde sowohl die
Expression der mRNA der oben genannten Zytokine als auch deren Sezernierung in das
Medium auf Proteinebene nachgewiesen.
Die inflammatorischen Zytokine IL12-p40 und TNF-α und das Chemokin CCL20 zeigten
eine signifikant reduzierte Expression in RAD-DCs im Vergleich zu EtOH-DCs nach
Konfrontation mit A. fumigatus in Abhängigkeit von der unbehandelten Negativkontrolle
(Abb. 6.12A, B, C). RAD-DCs exprimierten 81 % ± 25 % weniger IL12-p40 mRNA,
- 69-

6 Ergebnisse
89 % ± 7 % weniger TNF-α mRNA und 61 % ± 29 % weniger CCL20 mRNA als EtOH-DCs.
Die Expression des anti-inflammatorischen Zytokins IL10 zeigte jedoch keine Unterschiede
(Abb. 6.12D).
Abbildung 6.12: Relative Expression der Zytokine in moDCs. Grafische Darstellung der
relativen Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL12-p40 (A), TNF-α (B), des
Chemokins CCL20 (C) und des anti-inflammatorischen Zytokins IL10 (D) nach 6 h
Stimulation mit A. fumigatus in Abhängigkeit zur unstimulierten Kontrolle, normalisiert zu
h-Alas. Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 6; p-Werte aus Student's t Test zwischen der
EtOH-Kontrolle und den RAD behandelten moDCs, ns = nicht signifikant.
Um nicht nur die Expression sondern auch die eigentliche Ausschüttung der Zytokine zu
überprüfen, wurde die Proteinproduktion im Kulturüberstand nachgewiesen. Für diesen
Versuchsansatz wurden die Medienüberstände der Zellen derselben Spender verwendet wie
für die Expressionsanalyse. Da die Produktion der Proteine länger dauert als die alleinige
Expression der Gene, wurde auch ein 12 h Wert betrachtet. Die Proteinmengen des IL12-p40
(6 h: -61 % ± 34%; p = 0,15; 12 h: – 38 % ± 31 %; p = 0,10) und TNF-α (6 h: -61 % ± 34%; p
= 0,19; 12 h: – 38 % ± 31 %; p = 0,1) bestätigten größtenteils die Expressionsdaten, da die
- 70-

6 Ergebnisse
absolute Menge der produzierten Zytokine der RAD-DCs gegenüber den EtOH-DCs reduziert
war (Abb. 6.13A, B). Es war durch die großen Schwankungen der einzelnen Spender aber nur
ein Trend erkennbar und allenfalls eine niedrige Signifikanz bei TNF-α nach 12 h. Das
Chemokin CCL20 hingegen war nach 6 h um 60 % ± 15 %, nach 12 h um 64 % ± 35 %
signifikant verringert (Abb. 6.13C). Das anti-inflammatorische Zytokin IL10 war in RAD-
DCs im Gegensatz zu dem Expressionslevel, der keine Unterschiede aufwies, signifikant
reduziert. Nach 6 h Stimulation mit A. fumigatus betrug der Unterschied zwischen EtOH-DCs
und RAD-DCs -89 % ± 15 %, nach 12 h -94 % ± 12 % (Abb. 6.13D).
Abbildung 6.13: In den Kulturüberstand freigesetzte Proteine der moDCs. Grafische
Darstellung der absoluten Proteinmengen in ng / ml im Überstand der pro-inflammatorischen
Zytokine IL12-p40 (A), TNF-α (B), des Chemokins CCL20 (C) und des antiinflammatorischen
Zytokins IL10 (D) nach 6 h und 12 h Stimulation mit A. fumigatus. Die
weißen Balken stellen die EtOH-DCs dar, die schwarzen Balken die RAD-DCs. Mittelwerte
± Standardabweichung, n = 6; p-Werte aus Student's t Test zwischen der EtOH-Kontrolle
und den RAD behandelten moDCs, ns = nicht signifikant.
- 71-

6 Ergebnisse
6.4.5 Phagozytose von Dextran-Beads und Aspergillus fumigatus Konidien
Die Phagozytose wurde anhand FITC-gefärbter Dextran-Beads bzw. Konidien am
Durchflusszytometer gemessen. In einem Vorversuch wurde der Einfluss von 10 nM RAD auf
die Fähigkeit der Zellen, FITC-Dextran-Beads zu phagozytieren, untersucht. Unter Einfluss
von RAD war die Phagozytose um 63 % ± 8,5 % (p = 0,006) reduziert (Abb. 6.14). Es hatten
immer alle moDCs Dextran-Beads phagozytiert, aber unter Behandlung mit RAD war die
Gesamtmenge an phagozytierten Dextran-Beads reduziert.
Abbildung 6.14: Phagozytose der Dextran-Beads durch moDCs. In dem Histogramm (A) ist die
Phagozytose eines repräsentativen Spenders dargestellt; grün sind die EtOH-DCs mit Beads und
blau die unbehandelten EtOH-DCs, rot die RAD-DCs mit Beads und magenta die
unbehandelten RAD-DCs. (B) zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität der Histogramme.
Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 3; p-Werte aus Student's t Test zwischen der EtOH-
Kontrolle und den RAD behandelten moDCs. Durchgeführt in Zusammenarbeit mit Dr. rer. nat.
Markus Mezger und Dr. med. Christian Blockhaus.
Anders verhielt es sich mit der Phagozytose der Konidien. Hier wurde nach 2 h nie von allen
moDCs Konidien phagozytiert. Es wurde von Gafa et al. (2005) nachgewiesen, dass sich der
Anteil an phagozytieren A. fumigatus Konidien nach 2 h nicht mehr merklich erhöht, weshalb
diese Inkubationzeit gewählt wurde. Abb. 6.15 (A, B) zeigt, dass nach 2 h Inkubation
durchschnittlich 42 % der EtOH-DCs A. fumigatus Konidien phagozytiert hatten. Allerdings
waren unter RAD-Behandlung nur noch 27 % der Zellen in der Lage, Konidien zu
phagozytieren. Im Durchschnitt war die Phagozytoserate der RAD-DCs um 23 % ± 17 %
(p = 0,035) reduziert (Abb. 6.15C).
- 72-

6 Ergebnisse
Abbildung 6.15: Phagozytose von A. fumigatus durch moDCs. Die Phagozytose eines
repräsentativen Spenders ist als Dot-Plot mit (A) EtOH-DCs und (B) RAD-DCs dargestellt;
im unteren Quadranten befinden sich die Zellen, die keine Pilze phagozytiert haben, im
oberen Quadranten befinden sich die Zellen, die phagozytiert haben und somit FITC-positiv
sind; die Zahlen in den Quadranten geben den jeweiligen Prozentsatz an Zellen an. (C) zeigt
den durchschnittlichen Prozentsatz an Zellen, die phagozytiert haben. Mittelwerte ±
Standardabweichung, n = 10; p-Werte aus Student's t Test zwischen der EtOH-Kontrolle und
den RAD behandelten moDCs.
6.4.6 Killing von Aspergillus fumigatus
Da in den vorangegangenen Ergebnissen bereits dargestellt wurde, dass die Rezeptoren zur
Erkennung von A. fumigatus und auch die Phagozytose des Pilzes durch moDCs nach
Behandlung mit RAD negativ beeinflusst wurde, wurde als weiteres überprüft, ob auch das
direkte Killing herabgesetzt war. Dazu wurden EtOH-DCs und RAD-DCs für 0 h, 2 h, 4 h
und 6 h mit A. fumigatus Konidien und Keimschläuchen konfrontiert (MOI = 2). Diese
- 73-

6 Ergebnisse
Zeitpunkte wurden in Abhängigkeit einer Wachstumskontrolle, d.h. einem Ansatz, in dem nur
Konidien oder Keimschläuche ohne Zellen inkubiert wurden, ausgewertet.
Abbildung 6.16: Killing von A. fumigatus Konidien (A) und Keimschläuchen (B) durch RAD-
DCs im Vergleich zu EtOH-DCs. Aufgetragen sind die Colony Forming Units (CFU) der
Koinkubation von EtOH-DCs bzw. RAD-DCs in Abhängigkeit zur Wachstumskontrolle. Die
weißen Balken stellen die EtOH-DCs dar, die schwarzen Balken die RAD-DCs. Mittelwerte
± Standardabweichung, n = 9 für Konidien, n = 6 für Keimschläuche; p-Werte aus
Student's t Test zwischen der EtOH-Kontrolle und den RAD behandelten moDCs, ns = nicht
signifikant.
Die moDCs waren nicht in der Lage, Konidien signifikant abzutöten (Abb. 6.16A). Erst nach
6 h – zu einem Zeitpunkt, zu dem aus den Konidien schon kleine Keimschläuche geworden
sind – wurde ein signifikantes Killing beobachtet (p = 0,033). Es ließ sich aber erkennen, dass
moDCs in der Lage waren, Keimschläuche reproduzierbar und signifikant abzutöten (2 h: p =
0,0037; 4 h: p = 0,00055; 6 h: p = 0,00092) (Abb. 6.16B).
Betrachtet man RAD-DCs, so wies das Killing der Konidien erst nach 6 h einen signifikanten
Unterschied zwischen RAD-DCs und EtOH-DCs auf. Die Kontrollzellen konnten die Pilze
um 19 % ± 14 % schlechter abtöten. Andererseits war das Killing von Keimschläuchen zu
allen Zeitpunkten signifikant reduziert (Abb. 6.16B). Nach 2 h verursachten RAD-DCs 27 %
± 20 % (p = 0,04) weniger Killing als EtOH-DCs, nach 4 h 32 % ± 17 % (p = 0,014) weniger
und nach 6 h 21 % ± 11 % (p = 0,048) weniger.
- 74-

6 Ergebnisse
6.4.7 CD8 + T-Zell Proliferation
Da DCs T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen können, wodurch sie eine Verbindung
zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem herstellen, wurde betrachtet, ob
diese Funktion der moDCs durch die Behandlung mit RAD beeinflusst war. Für dieses
Experiment wurden moDCs unter Anwendung von CellGro Medium und humanem Serum
hergestellt. Diese Zellen wiesen den Oberflächenmarker CD14 der Monozyten nicht mehr auf,
waren aber auch nicht CD1a positiv, wie moDCs, die unter Standardbedingungen generiert
waren (Daten nicht gezeigt). Deshalb wurden 100 U Heparin zugesetzt, um die Ausbildung
des CD1a Markers zu fördern. Da Heparin aber zusätzlich IL4 bindet, wurde die
Zytokinkonzentration erhöht. Obwohl die prozentuale Ausbildung von CD1a
spenderabhängig schwankte (Daten nicht gezeigt), waren alle moDCs, die generiert wurden,
in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen.
Abbildung 6.17: Proliferation der CD8 + -T-Lymphozyten nach (A) 7 Tagen und (B) 9 Tagen
Stimulation mit dendritischen Zellen. Die Positiv- und Negativkontrolle sind in weiß
dargestellt, die mit EtOH-DCs stimulierten T-Lymphozyten in hellgrau und die mit RAD-
DCs stimulierten T-Lymphozyten in dunkelgrau. Die Werte über den Balken geben die
Steigerung der Proliferation im Vergleich zur Negativkontrolle wider. Mittelwerte ±
Standardabweichung, n = 5.
- 75-

6 Ergebnisse
Zytotoxische T-Lymphozyten, die nur in Medium mit Serum gehalten worden waren, zeigten
eine minimale Proliferation nach 7 Tagen und nach 9 Tagen (Abb. 6.17). Die Positivkontrolle
PHA war in der Lage, die T-Lymphozyten bereits nach 7 Tagen um 93 % ± 5 % zur
Proliferation anzuregen. Nach 9 Tagen kam es zu keiner merklichen Erhöhung der
Proliferation der CD8 + -T-Lymphozyten. Wurden die CD8 + -T-Lymphozyten mit unreifen
EtOH-DCs angeregt, gab es keinen signifikanten Unterschied zur Proliferation ohne Zusätze.
Anders verhielt es sich mit den RAD-behandelten moDCs. Diese waren ohne zusätzlichen
Stimulus in der Lage, CD8 + -T-Lymphozyten signifikant zur Proliferation anzuregen (p <
0,001 nach 7 Tagen, p = 0,02 nach 9 Tagen).
Sowohl durch Ausreifung der moDCs mit pp65 als Positivkontrolle als auch mit A. fumigatus
waren die moDCs in der Lage, den T-Lymphozyten Proteine zu präsentieren und in
signifikanter Weise zur Proliferation anzuregen. Es ließ sich durchschnittlich eine
geringfügige Reduktion der Proliferation feststellen, wenn die moDCs mit RAD behandelt
waren. Es fand sich keine Signifikanz zwischen den EtOH-DCs und RAD-DCs, da die
Unterschiede nur bei der Hälfte der Spender zu beobachten waren.
6.5 Interaktion zwischen dendritischen Zellen und Aspergillus
fumigatus im Alveolarepithelmodell
Zur genaueren Charakterisierung der Immunantwort auf A. fumigatus wurde als weiteres
Readout eine Microarray Studie an einem Modell für frühe IA in der Lunge durchgeführt, um
die Pathogenese der IA in vitro nachzustellen. Das Modell bestand aus A-549- und HPAEC-
Zellen, die mittels einer Membran voneinander getrennt waren (siehe auch 3.3.2). Nach 3 h
und 6 h Inkubation der A-549 Zellen zusammen mit moDCs bzw. mDCs auf der Membran
konfrontiert mit A. fumigatus oder ohne Stimulus, wurde die RNA aus dem Zell (A-549 +
moDCs / mDCs)-Pilz-Gemisch isoliert.
6.5.1 Microarray-Analyse der dendritischen Zellen zusammen mit A-549-
Zellen
Zunächst wurde eine Qualitätsanalyse der RNA mittels Bioanalyzer durchgeführt, um zu
überprüfen, ob die RNA der einzelnen Ansätze in vergleichbarer Menge amplifizierbar war.
Zur Bestimmung der Güte wurde die RNA integrity number (RIN) verwendet. Die RIN der
- 76-

6 Ergebnisse
A-549 mit moDCs lag bei 9, die RIN der A-549 mit mDCs bei 9,5 (Abb. 6.18). Das lässt auf
eine hohe und auch zwischen den Proben vergleichbare Qualität der RNA schließen.
Abbildung 6.18: Repräsentative Qualitätsanalyse der RNA mittels Bioanalyzer. Links ist das
Histogramm einer exemplarischen RNA dargestellt mit der Anzahl der Nukleotide (nt) auf
der x-Achse und der gemessenen Absorption während der elektrophoretischen Auftrennung.
Der Peak bei ca. 2000 nt stellt die 18S RNA dar, der Peak bei ca. 4000 Nt die 28S RNA.
Rechst ist das dazugehörige Gel dargestellt, auf dem die 18S und 28S RNA als Banden zu
sehen sind.
Nach der Amplifizierung lag die Gesamtmenge der gewonnenen aRNA zwischen 30 bis
40 µg. Für jedes Epoxy-Slide wurden 500 ng Probe und 500 ng Pool (= Gemisch aus allen
aRNAs) in cDNA umgeschrieben und währenddessen mit Cy3 (Probe) oder Cy5 (Pool)
gelabelt. Im Anschluss konnten sie hybridisiert, eingescannt und ausgewertet werden. Es
wurde die Expression von insgesamt 117 Zytokinen, Rezeptoren und weiteren mit einer
Entzündungsreaktion in Verbindung stehenden Genen analysiert Eine genaue Liste der
Sonden (Operon) findet sich im Anhang unter Kapitel 9.2.
Die moDCs zusammen mit A-549-Zellen zeigten nach 3 h 21 mehr als 2-fach regulierte Gene
(Tab. 6.1), was einem Anteil von rund 18 % der 117 ausgewählten Gene entsprach. Auffällig
war, dass die meisten Gene hochreguliert waren. Die zwei Chemokine CCL17 und CCL18,
die beide naive T-Lymphozyten und dendritische Zellen als Zielzellen haben, sowie
DC-SIGN, das ein Adhäsionsmolekül für naive T-Lymphozyten ist, waren die einzigen Gene,
die herunterreguliert waren. Das am stärksten regulierte Gen war CCL20, gefolgt von CCL4,
die unter anderem T-Lymphozyten aktivieren. Des Weiteren wurden noch C-X-C-motif
Zytokine (CXCL1, CXCL2, CXCL3 und CXCL5) mehr als 2-fach nach Konfrontation mit
- 77-

6 Ergebnisse
A. fumigatus hochreguliert, wobei das Chemokin CXCL2 zwar 2-fach reguliert war, aber
keine Signifikanz aufwies. Die Interleukine IL1-β, IL8, TNF und CSF2, sowie die
Transkriptionsfaktoren NFκBIA und NFκB1 und die Rezeptoren ICAM1 und PTX3 fanden
sich ebenso unter den regulierten Genen.
Tabelle 6.1: Differentiell exprimierte Gene, die nach 3 h Kokultivierung von moDCs + A549
mit A. fumigatus (MOI = 1) im Alveolarepithelmodell mehr als 2-fach hoch- bzw.
runterreguliert waren.
Klassifikation Gen-Name Gen-Symbol fold change P-Wert
C-C-motif
Chemokine
C-X-C-motif
Chemokine
Zytokine
Transkriptions
faktor
Nach 6 h erhöhte sich die Anzahl auf 25 Gene, rund 21 % (Tab. 6.2), wobei das HSP90 und
NFKB1 nur nach 3 h eine Heraufregulation zeigten, nach 6 h jedoch nicht mehr. Zudem
zeigte der Interleukin-10 Rezeptor A eine verringerte Expression. Daneben fanden sich nach
6 h dieselben Gene reguliert wie nach 3 h. Auch hier waren CCL20 und CCL4 am stärksten
reguliert. Allerdings zeigte das Chemokin CXCL2 im Gegensatz zu 3 h eine signifikante
Regulation.
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 2 CCL2 3,628 0,000184 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 4 CCL4 18,203 0,000191 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 5 CCL5 2,769 0,003434 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 7 CCL7 3,174 0,000384 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 17 CCL17 2,550 0,056050 ↓
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 18 CCL18 2,104 0,011388 ↓
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 20 CCL20 27,162 0,000059 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 1 CXCL1 3,516 0,002002 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 2 CXCL2 9,921 0,044135 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 3 CXCL3 4,610 0,000076 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 5 CXCL5 5,500 0,001930 ↑
Interleukin-1 beta IL1B 3,089 0,056599 ↑
Interleukin-8 IL8 14,302 0,000041 ↑
Tumornekrosefaktor
TNF 8,213 0,000029 ↑
Colony stimulating factor 2 (granulocytemacrophage)
CSF2 5,606 0,006122 ↑
nuclear factor of kappa light polypeptide
gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha
Nuclear factor of kappa light polypeptide
gene enhancer in B-cells 1
NFKBIA 5,551 0,000692 ↑
NFKB1 2,463 0,008451 ↑
C-Typ Lektin
Dendritic Cell-Specific Intercellular
adhesion molecule-3-Grabbing
Nonintegrin
DCSIGN 4,892 0,006907 ↓
Chaperon
Heat shock protein 90kDa alpha
(cytosolic), class B member 1
HSP90AB1 4,630 0,102856 ↑
Zelladhäsion Intercellular adhesion molecule 1 ICAM1 6,196 0,000246 ↑
Immunrezeptor Pentraxin 3
PTX3 6,599 0,000014 ↑
- 78-

6 Ergebnisse
Tabelle 6.2: Differentiell exprimierte Gene, die nach 6 h Kokultivierung von moDCs + A549
mit A. fumigatus (MOI = 1) im Alveolarepithelmodell mehr als 2-fach hoch- bzw.
runterreguliert waren.
Klassifikation Gen-Name Gen-Symbol fold change P-Wert
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 2 CCL2 2,086 0,011307 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 4 CCL4 35,906 0,000026 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 5 CCL5 9,578 0,000003 ↑
C-C-motif
Chemokine
C-X-C-motif
Chemokine
Zytokine
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 7 CCL7 2,955 0,000653 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 8 CCL8 2,039 0,000222 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 13 CCL13 2,089 0,014560 ↓
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 17 CCL17 3,722 0,011401 ↓
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 18 CCL18 2,461 0,003467 ↓
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 20 CCL20 39,955 0,000020 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 1 CXCL1 3,592 0,001769 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 2 CXCL2 7,302 0,075579 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 3 CXCL3 6,211 0,000013 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 5 CXCL5 5,450 0,002007 ↑
Interleukin-1 alpha IL1A 3,124 0,000722 ↑
Interleukin-1 beta IL1B 10,885 0,000690 ↑
Interleukin-8 IL8 17,201 0,000021 ↑
Tumornekrosefaktor TNF 3,266 0,003666 ↑
Lymphotoxin beta LTB 3,830 0,000154 ↑
Colony stimulating factor 2 (granulocytemacrophage)
CSF2 8,261 0,001513 ↑
Zytokin rezeptor Interleukin-10 Rezeptor A IL10RA 2,006 0,010674 ↓
Transkriptions
faktor
nuclear factor of kappa light polypeptide
gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha
Dendritic Cell-Specific Intercellular
NFKBIA 4,831 0,001345 ↑
C-Typ Lektin adhesion molecule-3-Grabbing
Nonintegrin
DCSIGN 2,709 0,065258 ↓
Zelladhäsion Intercellular adhesion molecule 1 ICAM1 9,358 0,000037 ↑
Immunrezeptor Pentraxin 3 PTX3 2,726 0,003253 ↑
Housekeeping-
Gen
ATPase, H+ transporting, lysosomal
70kDa, V1 subunit A
ATP6V1A 2,083 0,024619 ↓
mDCs wiesen weniger mehr als 2-fach regulierte Gene auf als moDCs. Nach 3 h waren 14
Gene mehr als 2-fach hochreguliert, was einem Anteil von lediglich 12 % entsprach (Tab.
6.3). Nach 6 h hatte sich der Anteil auf 19 Gene (= 16 %) erhöht (Tab. 6.4). Drei der
regulierten Gene, CCL17, CCL24 und TNFRSF1A, verzeichneten eine Herunterregulation.
Wiederum waren die Chemokine CCL20 und CCL4 zu beiden Zeitpunkten die am stärksten
hochregulierten Gene. Es fanden sich bei den mDCs die gleichen C-X-C-motif Zytokine, die
bereits bei den moDCs genannt wurden. Sie wiesen alle eine hochsignifikante Regulation auf.
- 79-

6 Ergebnisse
Tabelle 6.3: Differentiell exprimierte Gene, die nach 3 h Kokultivierung von mDCs + A549
mit A. fumigatus (MOI = 1) im Alveolarepithelmodell mehr als 2-fach hoch- bzw.
runterreguliert waren.
Klassifikation Gen-Name Gen-Symbol fold change P-Wert
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 2 CCL2 2,949 0,000235 ↑
C-C-motif Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 4 CCL4 15,475 0,000002 ↑
Chemokine Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 20 CCL20 15,968 0,000001 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 23 CCL23 3,016 0,000054 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 1 CXCL1 8,847 0,000002 ↑
C-X-C-motif Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 2 CXCL2 11,001 0,000000 ↑
Chemokine Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 3 CXCL3 7,614 0,000066 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 5 CXCL5 3,891 0,000036 ↑
Interleukin-1 beta IL1B 9,192 0,000340 ↑
Zytokine
Interleukin-8 IL8 5,674 0,000136 ↑
Lymphotoxin beta
LTB 2,197 0,008384 ↑
Transkriptions
faktor
nuclear factor of kappa light polypeptide
gene enhancer in B-cells inhibitor,
alpha
NFKBIA 4,375 0,000022 ↑
Zelladhäsion Intercellular adhesion molecule 1 ICAM1 3,801 0,001146 ↑
Immunrezeptor Pentraxin 3
PTX3 2,760 0,000254 ↑
Tabelle 6.4: Differentiell exprimierte Gene, die nach 6 h Kokultivierung von mDCs + A549
mit A. fumigatus (MOI = 1) im Alveolarepithelmodell mehr als 2-fach hoch- bzw.
runterreguliert waren.
Klassifikation Gen-Name Gen-Symbol fold change P-Wert
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 4 CCL4 13,705 0,000004 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 5 CCL5 6,295 0,000015 ↑
C-C-motif Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 17 CCL17 6,321 0,021900 ↓
Chemokine Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 20 CCL20 28,931 0,000000 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 23 CCL23 5,144 0,000002 ↑
Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 24 CCL24 2,445 0,023138 ↓
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 1 CXCL1 10,034 0,000001 ↑
C-X-C-motif Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 2 CXCL2 10,693 0,000000 ↑
Chemokine Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 3 CXCL3 7,665 0,000064 ↑
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 5 CXCL5 4,772 0,000011 ↑
Interleukin-1 alpha IL1A 2,381 0,012114 ↑
Interleukin-1 beta IL1B 12,389 0,000125 ↑
Zytokine
Interleukin-8
Lymphotoxin beta
IL8
LTB
5,688
2,893
0,000134
0,001274
↑
↑
Colony stimulating factor 2
(granulocyte-macrophage)
CSF2 2,064 0,000449 ↑
Rezeptor
Tumornekrosefaktor-Rezeptor
Superfamilie 1A
TNFRSF1A 2,106 0,002677 ↓
Transkriptions
faktor
nuclear factor of kappa light polypeptide
gene enhancer in B-cells inhibitor,
alpha
NFKBIA 3,253 0,000144 ↑
Zelladhäsion Intercellular adhesion molecule 1 ICAM1 4,224 0,000663 ↑
Immunrezeptor Pentraxin 3 PTX3 2,518 0,000524 ↑
- 80-

6 Ergebnisse
Eine früher durchgeführte Studie, die A-549 Zellen ohne den Zusatz von moDCs / mDCs
analysierte, zeigte, dass in diesen Zellen nach Konfrontation mit A. fumigatus im Vergleich zu
DCs wenig Gene reguliert waren. Deshalb wurde davon ausgegangen, dass sich die insgesamt
30 regulierten Gene (Abb. 6.18) hauptsächlich durch die RNA aus den moDCs / mDCs und
nicht durch die RNA der A-549 Zellen ergaben. Vergleicht man diese Studie im Modell mit
der Arbeit von Mezger (2007), der differentiell regulierte Genen nach 6 h Kokultur von DCs
mit A. fumigatus im Well-plate System ohne A-549 Zellen betrachtete, finden sich dort auch
alle Gene reguliert, die hier in allen vier Zuständen reguliert waren. Auffällig ist, dass sich im
Modell einige Gene nicht fanden, die im Well-plate System identifiziert wurden, wie z.B.
TLR2, TLR4 und CXCL10.
Abbildung 6.19: Mengendiagramm mit den regulierten Genen der vier verschiedenen Ansätzen
(moDCs 3 h, moDCs 6 h, mDCs 3 h, mDCs 6 h). Rot gefärbt sind alle Gene, die mehr als
zweifach hochreguliert wurden; grün gefärbt sind alle Gene, die mehr als zweifach
runterreguliert wurden.
- 81-

6 Ergebnisse
6.5.2 Expressionsanalyse zur Bestätigung der Microarray-Analyse
Zur Verifizierung der Daten aus dem Microarray wurde die Expression von drei
ausgewählten, regulierten Genen unter Verwendung der aRNA mittels qPCR analysiert. Die
Normalisierung der Daten erfolgte mittels des Housekeeping Gens h-Alas. Alle drei Gene
spiegelten das Bild des Microarrays wider. CCL20, IL1β und IL8 wurden in der Kokultur der
Zellen mit A. fumigatus im Vergleich zu den unbehandelten Zellen sowohl nach 3 h als auch
nach 6 h hochreguliert, wobei die Regulation spenderabhängig war (Abb. 6.20). Deshalb zeigt
das schwach regulierte Gen IL1β keine Signifikanz.
Abbildung 6.20: Relative Expression der Kontrollzellen und der Aspergillus-A-549-(mo/m)DC
Kokultur im Alveolarepithelmodell. Grafische Darstellung der relativen Expression der
Zytokine CCL20 (A), IL1-β (B) und IL8 (C) nach 3 h und 6 h Stimulation mit A. fumigatus oder
mit Medium, normalisiert zu h-Alas. Die linke Grafik stellt die jeweilige Expression der moDCs
dar, die rechte Grafik die Expression der mDCs. Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 3;
p-Werte aus Student's t Test zwischen der jeweils unstimulierten Kontrolle und den mit
A. fumigatus kokultivierten DCs, ns = nicht signifikant.
- 82-

6 Ergebnisse
6.6 Analysen des CXCL10-Gens
Der letzte Teil dieser Studie beschäftigte sich mit dem Chemokin CXCL10, da sich eine
Diskrepanz zwischen der home-made Microarray-Analyse (6.5.1) und einer früheren Analyse
mittels Affymetix-Microarray-Analyse ergab. Ergänzend wurde die Expression des CXCL10-
Gens in RAD-DCs, die ohne Behandlung, 6 h mit A. fumigatus Keimschläuchen oder 6 h mit
LPS stimuliert waren, im Vergleich zu EtOH-DCs bei gleicher Behandlung betrachtet, aber es
fanden sich keine signifikanten Unterschiede (Daten nicht gezeigt). Es wurde bereits
publiziert (Mezger et al., 2008-2), dass SNPs im CXCL10-Gen die Expression desselben
Gens beeinflussen. Deshalb wurden die SNPs in den sechs untersuchten Spendern mittels
einer Schmelzkurvenanalyse überprüft.
6.6.1 Analyse dreier SNPs im CXCL10-Gen
Zur Analyse der SNPs im CXCL10-Gen wurden Sonden eingesetzt, die an der Stelle binden,
an der sich der SNP befand. Somit ist die Schmelztemperatur abhängig davon, ob der Spender
ein Wildtyp, eine Mutante oder heterozygot ist. Es stellte sich heraus, dass zwei Spender in
allen detektierten SNPs heterozygot waren (Spender 5 & 6), zwei Spender in dem SNP
rs1554013 den Wildtyp aufwiesen (Spender 1 & 2) und folglich im SNP rs3921 und im SNP
rs4257674 die Mutation. Die letzten zwei Spender hatten in den SNPs rs3921 und rs4257674
den Wildtyp (Spender 3 & 4) und im SNP rs1554013 die Mutation (Tab. 6.5). Somit
exprimierten die Spender 3 und 4 aufgrund ihres unterschiedlichen Haplotyps eine viel höhere
Menge an CXCL10-mRNA als die Spender 1 und 2. Durch diese Schwankungen der
Expression des Gens abhängig vom Haplotyp lässt sich erklären, dass RAD keinen
signifikanten Einfluss zeigte. Die Haplotypen einzeln zu betrachten, war aufgrund der
geringen Anzahl an Spendern nicht möglich. Deshalb wurde darauf verzichtet, einen Schluss
auf den Einfluss von RAD auf die Expression des CXCL10-Gens zu ziehen.
- 83-

6 Ergebnisse
Abbildung 6.21: Schmelzkurvenanalyse des CXCL10 SNP rs3921 mittels LightCycler. Tritt der
Peak der Schmelzkurve bei 55 °C auf, handelt es sich um eine homozygote Mutation, bei 64 °C
handelt es sich um einen homozygoten Wildtyp. Bei einem heterozytogen Spender taucht bei
beiden Temperaturen ein Peak auf, der allerdings eine geringere Höhe aufweist. Die rote Linie
zeigt die Negativkontrolle, in der kein Fragment amplifiziert wurde.
Tabelle 6.5: SNP-Analyse der 6 getesteten Spender. Die gewählte Reihenfolge der Spender war
chronologisch, abhängig von dem, der als erstes getestet wurde.
Spender
rs1554013
(C/T)
rs3921
(C/G)
rs4257674
(A/G)
1 C/C G/G G/G
2 C/C G/G G/G
3 T/T C/C A/A
4 T/T C/C A/A
5 C/T C/G A/G
6 C/T C/G A/G
- 84-

6 Ergebnisse
6.6.2 Unterdrückung des CXCL10-Gens mittels siRNA
Da bei Patienten bereits nachgewiesen wurde, dass der Haplotyp, der einen Mangel an
CXCL10 zur Folge hat, das Risiko erhöht, an IA zu erkranken, wurde ebenfalls getestet, ob
der Knockdown des CXCL10-Gens einen Einfluss auf die pro-inflammatorische
Immunantwort auf A. fumigatus und die Reifung der DCs hat. Der Knockdown des CXCL10-
Gens wurde mittels Elektroporation von spezifischer siRNA in den Zellkern erreicht. Es
wurden zwei verschiedene siRNAs (Qiagen, D), CXCL10 (1) und CXCL10 (2), im Vorfeld
getestet, da sie nicht von der Firma Qiagen validiert waren. Der Abbau der mRNA des Gens
durch die siRNAs wurde mittels RT-PCR angeschaut und zudem wurde überprüft, ob auch
die tatsächliche Produktion des Proteins reduziert war.
Abbildung 6.22: Knockdown von CXCL10. (A) Expression von CXCL10 in unbehandelten moDCs,
nach Transfektion von siRNA CXCL10 (1) oder CXCL10 (2) bzw. der non silencing Kontrolle
normalisiert mit h-Alas. (B) Produktion von CXCL10 im Überstand gemessen mittels ELISA.
Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 4; p-Werte aus Student's t zwischen Negativkontrolle
und behandelter Probe. Durchgeführt in Zusammenarbeit mit Dipl. Biol. Tanja Breitschopf.
Abb. 6.22 zeigt, dass CXCL10 (1) die mRNA von CXCL10 stark inhibierte (-80 % ± 12 %;
ns) und einen signifikanten Einfluss auf den Proteinlevel von CXCL10 im Mediumüberstand
hatte (-90 % ± 13 %; p = 0,006). Jedoch war kein solcher Effekt durch die siRNA
CXCL10 (2) oder der non silencing Kontrolle zu beobachten.
6.6.3 Effekte des CXCL10-Knockdowns auf die inflammatorische
Immunantwort und Reifung der moDCs
Um herauszufinden, ob die Reduktion von CXCL10 einen Effekt auf die inflammatorische
Immunantwort hat, wurden verschiedene Zytokine auf Expressionsebene getestet. Dazu
wurden moDCs nach 24 h Inkubation mit siRNA (CXCL10 (1), CXCL10 (2) oder non
- 85-

6 Ergebnisse
silencing) bzw. Medium als Negativkontrolle für 6 h mit A. fumigatus stimuliert und die RNA
mittels RT-PCR vermessen. Nach Normalisierung der gewonnenen Cp-Werte stellte sich
heraus, dass die siRNA keinen Einfluss auf die Expression von IL12-p40, TNF-α oder IL10
hatte, da die Expressionsniveaus in allen Zuständen vergleichbar waren (Abb. 6.23).
Abbildung 6.23: Relative Expression der Zytokine. Grafische Darstellung der relativen
Expression der Zytokine IL12-p40 (A), TNF-α (B) und IL10 (C) nach 6 h Stimulation mit
A. fumigatus in Abhängigkeit zur unstimulierten Kontrolle, normalisiert zu h-Alas.
Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 4; p-Werte aus Student's t Test zwischen der EtOH-
Kontrolle und den RAD behandelten moDCs.
Des Weiteren wurde untersucht, ob die Reifung der Zellen beeinflusst wurde. Deshalb wurde
die Expression der Oberflächenmarker CD40, CD80, CD83 und CD86 auf den moDCs nach
Stimulation mit A. fumigatus oder LPS im Durchflusszytometer betrachtet. Es wurden Zellen,
die als Negativkontrollen mit Medium oder non silencing Kontrolle transfiziert waren, mit
Zellen verglichen, die mit der siRNA CXCL10 (1) transfiziert waren. Auch hier fanden sich
keine Unterschiede in der Ausbildung von CD40, CD80, CD83 und CD86 (Abb. 6.24).
- 86-

6 Ergebnisse
Abbildung 6.24: Fluoreszenzintensitäten der Oberflächenmarker (A) CD40, (B) CD80, (C) CD83
und (D) CD86 auf unreifen moDCs, nach 36 h Stimulation mit A. fumigatus und nach 36 h
Stimulation mit LPS in Bezug auf die Isotypkontrolle. Die weißen Balken stellen die
Medium-Negativkontrolle dar, die grauen Balken die DCs, bei denen das CXCL10 Gen mit der
siRNA CXCL10 (1) ausgeschaltet wurde, und die schwarzen Balken die DCs, die mit der non
silencing control behandelt wurden. Die Analyse erfolgte anhand 200 000 Zellen nach Färbung
mit PE-markierten Antikörpern gegen die entsprechenden Oberflächenmarker im
Durchflusszytometer. Vermessen wurde die mittlere Fluoreszenzintensität der Histogramme.
Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 2; p-Werte aus Student's t Test zwischen der EtOH-
Kontrolle und den RAD behandelten moDCs. Durchgeführt in Zusammenarbeit mit Dipl. Biol.
Tanja Breitschopf.
- 87-

7 Diskussion
7 Diskussion
In dieser Studie wurden die Eigenschaften und Funktionen dendritischer Zellen und
neutrophiler Granulozyten nach Konfrontation mit dem opportunistischen Schimmelpilz
Aspergillus fumigatus untersucht.
Da Patienten nach allogener Stammzell- oder Organtransplantation mit RAD bzw. Rapamycin
behandelt werden, wurden in den letzten Jahren ein Verständnis der Effekte von mTOR
Inhibitoren auf das Immunsystem immer wichtiger. Der Einfluss von RAD bzw. Rapamycin
auf die T-Zell Proliferation ist bereits eingehend untersucht (Bierer et al., 1990; Dumont et
al., 1990; Metcalfe, Milner, 1991). Es wurde aber ein zusätzlicher inhibitorischen Einfluss
von RAPA und seinem Derivat RAD auf Neutrophile, Makrophagen und DCs gezeigt
(Hackstein et al., 2003; Woltman et al., 2003; Feodoric, Krishnan, 2008). Außerdem führte
eine Inhibition des mTOR-Wegs in einem Mausmodell für IA mittels siRNA zu verringerter
Autophagie, Zellproliferation und mRNA Transkriptionsleveln (Bonifazi et al., 2010). Bis
jetzt gab es jedoch keine Studie über einen möglichen Einfluss dieser Medikamente auf die
Immunantwort von DCs auf den pathogenen Pilz A. fumigatus. Deshalb wurde der Einfluss
des mTOR Inhibitors RAD auf die in vitro Generierung von DCs aus Monozyten, sowie deren
Fähigkeit Pathogene abzuwehren, gelegt. Zudem wurde der oxidative Burst neutrophiler
Granulozyten unter RAD untersucht. Um die Zytokine und Rezeptoren zu definieren, die für
die Abwehr des Pilzes zum Einsatz kommen, wurde ein Expressionsprofil der DCs in einem
artifiziellen Modell für frühe IA in der Lunge erstellt.
7.1 RAD
In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass eine Medikation mit Mykophenolsäure
(Mycophenolic acid, MPA), die oft zusammen mit mTOR Inhibitoren gegeben wird, zu einem
erhöhten Risiko für IA führt (Schelenz, Goldsmith, 2003). Des Weiteren wurde eine
Empfänglichkeit für IA bei Patienten beobachtet, die unter anderem mit Rapamycin oder
RAD behandelt wurden (Panackal et al., 2003; Singh et al., 2006). Wird ein Patient bereits
mit RAD behandelt, ist es in diesem Zusammenhang von größter Bedeutung, die Behandlung
bzw. Prophylaxe einer IA mit Azolen auf die verabreichte Menge an RAD abzustimmen, da
es sonst zu einer Übermedikation kommen kann (Pea et al., 2008). Wegen dieser Hinweise zu
- 88-

7 Diskussion
einen Zusammenhang zwischen der Verabreichung von mTOR Inhibitoren und einem
erhöhten Risiko für IA, wurde für ein besseres Verständnis der Effekte von RAD auf DCs und
deren Interaktion mit dem Pathogen A. fumigatus wurde die Immunabwehr spezifisch in vitro
untersucht.
7.1.1 Einfluss des Antimykotikums RAD in geringer Konzentration auf
das Pilzwachstum
Der mTOR Inhibitor RAD wurde ursprünglich als Antimykotikum klassifiziert, das vor allem
gegen Candida albicans wirkt (Vénzia et al., 1975; High, 1994). Da in dieser Studie die
Effekte von RAD auf humane Zellen und nicht auf den Pilz untersucht werden sollten, musste
im Vorfeld bewiesen werden, dass RAD in der angewandten Konzentration (10 nM) keine
Auswirkungen auf A. fumigatus hatte. Durch eine Messung des Wachstums, das unter Zugabe
von RAD keinen Unterschied zur Kontrolle ohne RAD zeigte, konnte ausgeschlossen werden,
dass RAD A. fumigatus schädigt. In einer Studie über Antimykotika und A. fumigatus konnte
bereits nachgewiesen werden, dass RAD im Gegensatz zu Cyclosporin oder Tacrolimus, die
immunsupprimierende Eigenschaften durch die Inhibition der T-Zell Antwort haben, aber
Calcineurin blockieren und nicht den mTOR Signalweg, wie RAD (Rhode et al., 2001), keine
nachhaltigen Effekte auf A. fumigatus zeigte (2 µM Endkonzentration). D.h. nach 24 h war
eine Schädigung zu beobachten, aber bereits nach 48 h zeigte sich keine weitere Schädigung
(Steinbach et al., 2004). Es kann vermutet werden, dass das auch an der Instabilität von RAD
liegen kann.
7.1.2 Inhibition des oxidativen Bursts neutrophiler Granulozyten durch
RAD
Vor allem Makrophagen sind als Hauptbewohner der Alveolaren dafür zuständig, Konidien
abzutöten. Ein zusätzlicher Mechanismus zur Phagozytose ist z.B. die Produktion von
reaktiven Sauerstoffspezies (Philippe et al., 2003). Dagegen werden Hyphen extrazellulär
durch neutrophile Granulozyten mit Hilfe von Sauerstoffradikalen und lysosomalen Enzymen
abgetötet (Brakhage, 2005; Tekaia, Latgé, 2005; Balloy, Chingnard, 2009). Die NETs-
Bildung spielt dabei eher eine nebensächliche Rolle und verhindert weiteres Ausbreiten des
Pathogens (Bruns et al., 2010).
- 89-

7 Diskussion
Es wurde bei neutrophilen Granulozyten eine Bildung von Sauerstoffspezies nach
Konfrontation mit A. fumigatus Keimschläuchen festgestellt, die dosisabhängig durch Zugabe
von RAD reduziert wurde. Allerdings konnte eine Inhibition durch RAD lediglich nach einer
Vorinkubation von 1 h gemessen werden, da nach direkter Zugabe keine Veränderungen zu
beobachten waren (Mezger, 2007). Ob sich deshalb das Risiko eines Patienten erhöht, an
invasiver Aspergillose zu erkranken, kann nicht gesagt werden, da der oxidative Burst nicht
der primäre Abwehrmechanismus gegen A. fumigatus ist (Wozniok, 2007), obwohl
Sauerstoffradikale den Pilz in vitro schädigen können (Diamond et al., 1978; Diamond, Clark
1982). Zusätzlich wurde der Einfluss eines weiteren Immunsuppressivums, die
Mykophenolsäure (Mycophenolic acid, MPA), auf den oxidativen Burst neutrophiler
Granulozyten beobachtet (Mezger et al., 2008-3). Obwohl dieses Medikament einen Anstieg
der Produktion von Radikalen bewirkte, ließ sich dennoch kein Unterschied in der Effizienz
der Schädigung an A. fumigatus verzeichnen, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass der
oxidative Burst nicht primär der Abtötung des Pilzes dient.
7.1.3 Die Expression von drei Rezeptoren für Aspergillus fumigatus auf
moDCs unter RAD-Behandlung
Aufgrund der Fähigkeit von DCs, die Immunantwort nach Konfrontation mit einem Pathogen
wie A. fumigatus zu initiieren und zu regulieren, was essentiell für eine erfolgreiche Abwehr
ist, werden sie als Wächter des Immunsystems bezeichnet (Austyn, 1998; Banchereau,
Steinman, 1998; Reis E Sousa et al., 1999). Nach Kontakt mit dem Pilz wandern sie als reife
DCs in die Lymphknoten, um Antigene über kostimulatorische Moleküle naiven
T-Lymphozyten zu präsentieren und Zytokine auszuschütten, wodurch verschiedene
TH-Antworten ausgelöst werden (Vermaelen et al., 2001; Montagnoli et al., 2002). Da DCs
verschiedene T-Lymphozyten zu aktivieren können, sollen zukünftig in vitro gereifte DCs mit
Aspergillusantigenen beladen und diese als reife APCs in Form eines Impfstoffs Patienten
injiziert werden (Bozza et al., 2004; Shao et al., 2005). Aus diesem Grund wurde der Einfluss
von RAD auf die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen im Menschen untersucht. In
einem ähnlichen Versuchsansatz wurde das Medikament MPA auf moDCs getestet, das oft in
Kombination mit RAD Patienten zur Therapie verabreicht wird (Mezger et al., 2008-3).
Aspergillus ist ein Ligand für TLR2, TLR4 und Dectin-1 auf DCs. Mittels eines Knockdowns
von Dectin-1, aber weder von TLR2 noch TLR4, wurde beobachtet, dass die Ausschüttung
von Zytokinen, wie TNF-α und IL12, deutlich reduziert war. In dieser Studie stellte sich
- 90-

7 Diskussion
heraus, dass die Expression von TLR4 und Dectin-1 nach Stimulation mit A. fumigatus
reduziert war, die von TLR2 hingegen anstieg. Dieses Phänomen wurde bereits publiziert und
ist spezifisch für die Interaktion zwischen DCs und Aspergillus-Keimschläuchen und zugleich
abhängig vom Gesundheitszustand des Spenders und von der Morphologie des Pilzes
(Chignard et al., 2007; Mezger et al., 2008-1).
Medikamente können Rezeptoren beeinflussen, wie z.B. Mykophenolsäure, die unter anderem
die Expression des Rezeptors CCR7, welcher CCL19 als spezifischen Liganden hat, senkt.
CCR7 spielt z.B. bei der Aktivierung von T- und B-Lymphozyten eine Rolle und induziert die
Migration der DCs in die Lymphknoten (Cicinnati et al., 2009). Im Vergleich dazu erhöht
Rapamycin die Expression desselben Rezeptors (Sordi et al., 2006). Es konnte hier gezeigt
werden, dass RAD einen inhibitorischen Einfluss auf die Expression weiterer Rezeptoren hat,
sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene. So war die Expression der TLR2- und TLR4-
mRNA signifikant reduziert und Dectin-1 unter RAD-Behandlung signifikant geringer auf der
Oberfläche zu finden. Lorne et al. (2009) untersuchten den inhibitorischen Einfluss von
Rapamycin auf die Reaktionswege von diesen Rezeptoren und fanden heraus, dass die IκB-α
Degradation, die durch TLR2 und TLR4 induziert wird, in Neutrophilen nicht durch
Rapamycin beeinflussbar ist. Andererseits zeigten Sun et al. (2008), dass die Expression von
TLR4 und auch die Aktivierung von NF-κB durch Rapamycin inhibiert wird.
Bei allen untersuchten Spendern war Dectin-1 auf Genexpressionsebene in RAD-DCs
hochsignifikant höher exprimiert als in den Kontrollzellen. Aber die tatsächliche Bildung des
Rezeptors auf der Zelloberfläche war reduziert, was im Einklang mit der Studie von Schmitz
et al. (2008) ist, die eine verringerte IL-2 Ausschüttung nach Stimulation der DCs über
Dectin-1 beobachteten, wenn mTOR inaktiviert war. Warum die Expression erhöht war, kann
nur vermutet werden. RAD könnte einen Wirkstoff enthalten, der spezifisch auf Dectin-1
wirkt. Da aber der komplette Metabolismus der DCs durch die Zugabe von RAD
eingeschränkt ist, kommt es sogar zu einer Abnahme der Dectin-1 Proteinbildung im
Vergleich zu den Kontrollzellen. Auch durch die Substanz Dexamethason, ein Glucocorticoid,
dass entzündungshemmend wirkt, wurde eine signifikante Herabregulation der Dectin-1
Expression in Makrophagen detektiert (Willment et al., 2003).
- 91-

7 Diskussion
7.1.4 Der Einfluss von RAD auf Reifung und Funktion dendritischer
Zellen
Von unserer Arbeitsgruppe wurde bereits gezeigt, dass MPA keinen Einfluss auf die Reifung
und Genexpression der moDCs nach Konfrontation mit A. fumigatus hat , wenn es am Tag 2
oder 4 nach der Isolation dazugegeben wurde (Mezger et al., 2008-3). Allerdings hatte MPA
einen starken inhibierenden Einfluss bei Zugabe direkt nach der Isolation der Monozyten. Es
bewirkte eine Reduktion von CD40, CD80 und CD86 sowie eine verringerte Zytokin-
expression (IL12, IL10 und TNF-α) nach Stimulation mit LPS und eine geschwächte
Anregung naiver T-Lymphozyten durch moDCs (Mehling et al., 2000; Colic et al., 2003-2).
Diese Effekte wurden auf RAD getestet.
Wurden die Monozyten am Tag 2 oder 4 nach Isolation mit RAD (1 µM) behandelt, zeigte
sich kein Einfluss auf die Differenzierung, Reifung und das Expressionsprofil der DCs
(Blockhaus, 2010). Bei Zugabe von RAD direkt nach der Isolation der Monozyten jedoch
zeigten sich, ebenso wie bei MPA, starke Effekte auf DCs (Feodoric, Krishnan, 2008). Die
apoptotische Wirkung von RAPA nach 7 Tagen Generation der moDCs ist dosisabhängig,
jedoch nicht der Einfluss von RAPA auf die Reifung von CD40, CD80 und CD86 nach
Stimulation (Monti et al., 2003), weshalb mit der geringen Konzentration von 10 nM
(= 9,6 ng / ml) gearbeitet wurde. Diese Konzentration entspricht auch den in vivo
Bedingungen in Patienten, bei denen nach erfolgreicher Therapie Sirolimus in einer
Konzentration von 5 - 15 ng / ml im Blut nachgewiesen wurde (Hackstein, 2006; MacDonald
et al., 2000). Da RAD vor kurzem von der FDA zur klinisch eingesetzt werden darf, gibt es
auch erste Studien über die Pharmakokinetik von Everolimus, das im Serum der Patienten je
nach Dosis mit einer Konzentration von 5,4 - 13,2 ng / ml nachweisbar war (O'Donnell et al.,
2010; Saliba et al. 2011).
Nach 7 Tagen Behandlung mit RAD zeigten die moDCs die gleiche Expression an CD1a und
CD14. Im Gegensatz dazu war die Ausbildung von MHCII reduziert. Nach Konfrontation mit
dem Pathogen A. fumigatus oder LPS war die Expression von MHCII sowohl in RAD-DCs
als auch in den Kontrollzellen identisch. Daraus lässt sich folgern, dass RAD nicht die
Bildung von DCs aus Monozyten inhibiert.
Die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD83 und CD86 zeigte eine
signifikante Reduktion. Nach Konfrontation mit A. fumigatus war CD40 verringert auf der
Zelloberfläche nachzuweisen. Da CD40 schlechter nach Konfrontation mit dem Pathogen
erhöht wird, kann vermutet werden, dass DCs CD8 + - und CD4 + -T-Lymphozyten
- 92-

7 Diskussion
wahrscheinlich schlechter zur Proliferation angeregt werden können (Burns, Thracher, 2004),
und die Immunantwort gegen A. fumigatus ist geschwächt. Die DCs können durch eine
verringerte Expression von CD40 ihre tolerogenen Eigenschaften nicht verlieren, wodurch sie
vor allem die Fähigkeit zur Induktion von Treg-Zellen besitzen (Turnquist et al. 2007).
Weiterhin waren CD40 und CD83 nach Stimulation mit LPS signifikant verringert, und
zusätzlich zeigten die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 eine Tendenz zu einer
reduzierten Expression in RAD-DCs. Durch die Schwankungen der einzelnen Spender waren
diese Daten aber nicht signifikant. Turnquist et al. (2007) beobachteten ebenso eine
Reduktion der Hochregulation von CD80 und CD86 durch TLR-Liganden wie LPS. Da sich
RAD-DCs schlechter durch CD40 Liganden maturieren lassen, kann man von der
Wahrscheinlichkeit sprechen, dass sie resistent gegen die Ausreifung durch einen Stimulus
sind und ein höheres immuntolerantes Potential besitzen, was hilfreich für Krebstherapie und
für den Schutz vor Autoimmunerkrankungen ist (Grohmann et al., 2001).
Im Rahmen einer Infektion regulieren DCs die Immunantwort mittels körpereigener
Botenstoffe, den Zytokinen. Aus diversen Zytokinen, die erfahrungsgemäß von dendritischen
Zellen als Reaktion auf das Pathogen A. fumigatus ausgeschüttet werden, wurden IL10, IL12,
TNF-α und CCL20 in Anlehnung an die Publikation von Mezger et al. (2008-3) zur
genaueren Betrachtung ausgewählt. Hackstein et al. (2003) fanden eine schwächere
Ausschüttung von IL12 und TNF-α im Mausmodell unter RAD-Einfluss. Dieses Ergebnis
konnte für A. fumigatus in humanen DCs in vitro bestätigt werden, da sowohl der mRNA-
Level als auch die tatsächliche Proteinmenge in RAD-DCs verringert war. Auch für das
Chemokin CCL20, den Liganden des Rezeptors CCR6, der auf Lymphozyten exprimiert wird,
ließ sich eine verringerte Expression nachweisen. Bestätigt wurde das durch einen signifikant
geringeren Proteinlevel an CCL20 im Mediumüberstand in RAD-DCs im Vergleich zu
EtOH-DCs. Das anti-inflammatorische Zytokin IL10 zeigte ein interessantes Bild, da es nur
auf Proteinebene durch Zugabe von RAD zu den moDCs herabreguliert wurde, nicht aber auf
Genexpressionsebene. Man kann daraus schließen, dass der Einfluss des Medikaments für
IL10 im Gegensatz zu allen anderen getesteten Zytokinen posttranskriptionell ist und auf die
Translation wirkt. Im Allgemeinen geht man davon aus, dass Zytokine die Immunantwort
gegen Pilze wie A. fumigatus delegieren, und durch eine verringerte Proteinmenge die
Antwort geschwächt wird. Die Balance zwischen TH1/TH17 und TH2 Phänotypen bewirkt eine
gerichtete pro-inflammatorische / anti-inflammatorische Immunantwort. Die TH1-Antwort
wird durch TNF-α und IL12 gefördert, indessen hat IL10 eine Wirkung auf die TH2-Antwort,
- 93-

7 Diskussion
die pathologisch ist, da sie zu allergischen Reaktionen gegen A. fumigatus führen kann
(Chaudhary et al., 2010). Dies wird hauptsächlich durch Allergene von A. fumigatus
ausgelöst, die IgE-Antikörper binden und zum Beispiel bei Personen mit Asthma gefunden
worden sind (Banerjee, Kurup, 2003). In den letzten Jahren wurde herausgefunden, dass nur
eine TH1-Antwort Schutz vor und Erholung von IA bewirkt (Cenci et al., 1997; Cenci et al.,
1998; Cenci et al., 1999; Potenza et al., 2007; Lehrnbecher et al., 2009; Tramsen et al., 2009).
Die Zytokinproduktion ist generell in RAD-DCs inhibiert, sowohl in Richtung TH1-Antwort,
die vor A fumigatus schützt, als auch in TH2-Antwort, die Allergien verursachen kann, und
daher ist das Gleichgewicht gestört. Somit kann der Körper unter RAD-Behandlung nicht wie
in einem gesunden Menschen auf das Pathogen reagieren und ist in seiner Immunantwort
geschwächt.
7.1.5 Phagozytose und Schädigung des Pilzes nach Behandlung mit RAD
Um ein Pathogen zu erkennen, haben unreife dendritische Zellen die Fähigkeit, Fremdstoffe
durch Phagozytose und Makropinozytose aufzunehmen und danach zu prozessieren. DCs sind
beständig in der Lage, durch den Prozess der Phagozytose, der sowohl die Polymerisation des
Aktins als auch eine Aktivität der PI3-Kinase benötigt (Parod, Brain, 1986; Ibrahim-Granet et
al., 2003; Luther et al., 2008), Konidien schnell aufzunehmen (Behnsen et al., 2007; Serbina
et al., 2009). Die Aufnahme von Konidien wird unter anderem über die C-Typ Lektin
Rezeptoren Dectin-1 und MR reguliert. Das konnten Bozza et al. (2002) auf murinen DCs, die
direkt aus der Lunge isoliert waren, zeigen. Auch die Aufnahme der FITC-Dextran-Beads
wird über den MR reguliert (Sallusto et al., 1995). Hackstein et al. (2002) und Monti et al.
(2003) befassten sich mit dem Einfluss der immunsupprimierenden Substanz RAPA auf die
Fähigkeit von moDCs, Antigene aufzunehmen. Diese Autoren konnten sowohl für murine als
auch für humane DCs zeigen, dass der mannoseabhängige Phagozytoseweg unter RAPA-
Einfluss inhibiert war. Diese Ergebnisse konnten hier für das Derivat RAD bestätigt werden,
da eine hochsignifikant reduzierte Phagozytoseaktivität von FITC-Dextran-Beads in humanen
DCs beobachtet wurde, die mit RAD behandelt worden waren. Dazu wurde die spezifische
Aufnahme von Konidien betrachtet, da sich die Arbeit hauptsächlich auf das Pathogen
A. fumigatus konzentrierte. Die Phagozytose von RAD-DCs war im Vergleich zu den
Kontrollzellen signifikant reduziert (-23 % ± 17 %).
Interessanterweise zeigte der Test der tatsächlichen Abtötung der Konidien, dass DCs nicht in
der Lage sind, Pilzsporen zu schädigen, da nach 2 h oder 4 h kein Killing zu sehen war. Eine
- 94-

7 Diskussion
Theorie besagt, dass DCs zwar Konidien phagozytieren können, aber nicht in der Lage sind,
diese abzutöten. Bozza et al. (2002) beobachteten, dass nach dreistündiger Phagozytose von
Konidien und Hyphen durch murine DCs nur die letztere Form teilweise abgebaut war. Von
der Zelle werden während dieses Vorgangs unterschiedliche Phagozytosemechanismen und
wie bereits erwähnt verschiedene PRRs angewandt. Aspergillus-Sporen können in der Zelle
weiterleben, und da eine gezielte Abtötung der moDCs für den Versuchsansatz zur
Bestimmung des Killings essentiell war, um die Reaktion abzustoppen, wurden die Konidien
wieder freigesetzt. Dieses Phänomen lässt sich auch durch die hohe Resistenz der Konidien
gegenüber Phagozyten erklären (Levitz, Diamond, 1985; Michaliszyn et al., 1995). Erst wenn
die Konidien auskeimen, bilden sich die verschiedenen Schutzmechanismen der Zellwand
zurück, z.B. der bei Aspergillus über Glycosylphosphatidyl-Inositol an die Zellwand kovalent
gebundene sogenannte „rodlet layer“, der aus hydrophobem RodA zusammengesetzt ist
(Aimanianda et al., 2009). Somit können die kurzen Keimschläuche abgetötet werden, was
sich durch ein signifikantes Killing nach 6 h darstellte. Obwohl der Mechanismus des Killings
mit einer Überlebensrate der Keimschläuche von 70 % zu den Zeitpunkten 2 h, 4 h und 6 h
nicht sehr effektiv war, lässt sich prinzipiell sagen, dass DCs in der Lage waren, A. fumigatus
Keimschläuche und Hyphen reproduzierbar abzutöten. Zusätzlich wurde untersucht, ob RAD
ebenso einen Effekt auf die Killing-Eigenschaften von DCs hat. Es zeigte sich, dass zu jedem
Zeitpunkt, an dem es zu einer messbaren Abtötung kam, RAD-DCs signifikant weniger Pilze
schädigen konnten. Diese Ergebnisse sind ein Indiz dafür, dass weniger Pilze phagozytiert
und abgetötet werden, wenn ein RAD auf die Immunzellen gegeben wird.
7.1.6 Einfluss von RAD auf die Proliferation von CD8 + -T-Lymphozyten
Dendritische Zellen sind in vieler Hinsicht in die Funktionen von T-Lymphozyten involviert.
Sie besitzen kostimulatorische Moleküle, die für eine mitogene T-Zellantwort vonnöten sind
(Austyn et al., 1983), und sind wichtige Mithelfer in einer T-zellabhängigen
Antikörperproduktion der B-Lymphozyten (Inaba et al., 1983). Somit sind DCs potentielle
Stimulatoren eines T-Zellproliferationsassays. Autologe DCs wurden ex vivo unter GMP-
Bedingungen aus Monozyten generiert. Sie wiesen keinen CD14-Marker mehr auf und waren
zu 50 % CD1a positiv. Obwohl sie sich deshalb von den in vitro mit RPMI + 10 % FCS
generierten DCs unterschieden, waren sie dennoch funktionell, was sich in ihrer Fähigkeit
zeigte, T-Lymphozyten nach 7 Tagen zu 51 % ± 23 % und nach 9 Tagen zu 85 % ± 11 % zur
Proliferation anzuregen, nachdem sie mit A. fumigatus beladen worden waren.
- 95-

7 Diskussion
Obwohl RAD die Funktionen von moDCs einschränkt, sowohl in ihren Fähigkeiten
kostimulatorische Moleküle und Zytokine zu produzieren als auch darin, A. fumigatus direkt
zu schädigen, fand sich kein signifikanter Einfluss auf die T-Zellproliferation. Es wurden 5
Spender betrachtet, die ein unterschiedliches Bild zeigten. Bei 3 der 5 Spendern zeigte sich
eine deutliche Erhöhung der T-Zellproliferation durch unstimulierte RAD-DCs. Es kann
vermutet werden, dass RAD selbst als ein bakterielles Derivat den T-Lymphozyten präsentiert
werden kann. Zugleich regt RAD die Zytokinproduktion an und erhöht die Zahl an
akzessorischen Molekülen, wohingegen EtOH-DCs nicht ausgereift sind und daher keine
mitogenen Eigenschaften bei T-Lymphozyten hervorrufen können. Ferner war in diesen 3
Spendern die Proliferation der T-Lymphozyten durch mit A. fumigatus beladenen EtOH-DCs
höher als durch stimulierte RAD-DCs. In den anderen 2 Spendern zeigte sich kein
Unterschied zwischen RAD-DCs und EtOH-DCs. Durch die geringe Anzahl an Spendern
sowie deren Anonymität konnten Effekte durch Geschlecht und Gesundheitszustand der
Spender, die den Versuch negativ beeinflussen, nicht ausgeschlossen werden. Diese
Ergebnisse sind ein Indiz dafür, dass es einen negativen Effekt des RAD auf moDCs gab, so
dass sie schlechter eine spezifische T-Zellantwort auslösen konnten, der allerdings
spenderabhängig auftrat. Da RAD einen stark inhibierenden Effekt auf die T-Zellantwort hat,
wurde es während des Proliferationsassays nicht mehr zu den Zellen gegeben (Bierer et al.,
1990; Dumont et al., 1990; Metcalfe, Milner, 1991). Dies könnte auch die schwankenden
Ergebnisse erklären, da das extrem instabile RAD innerhalb von 7 bzw. 9 Tagen seine
Wirkung verliert und die Effekte auf die DCs rückläufig sein könnten. Es ist zu beachten, dass
hierbei nur zytotoxische CD8 + -T-Lymphozyten betrachtet wurden. In einem Ausblick für
diesen Versuchsansatz wäre eine genauere Betrachtung der TH1-Antwort interessant, die eine
protektive Eigenschaft auf IA hat (Cenci et al., 1997; Cenci et al., 1998; Cenci et al., 1999).
7.2 Regulation der Expression von Zytokinen dendritischer
Zellen im Alveolarepithelmodell nach Konfrontation mit
Aspergillus fumigatus
Man geht davon aus, dass sowohl Epithel- als auch Endothelzellen in der Lage sind, Pilze zu
phagozytieren, allerdings erfolgt die hauptsächliche Abwehr von A. fumigatus durch Zellen
des angeborenen Immunsystems (Latgé, 1999). Alle diese Zellen finden sich in der Lunge,
dem Ort, an dem A. fumigatus den Körper infiltriert. Es ist bereits seit langem bekannt, dass
- 96-

7 Diskussion
neben alveolaren Makrophagen und Neutrophilen, die einen Großteil der Immunzellen der in
Lunge ausmachen, auch dendritische Zellen dauerhaft im Lungenepithel vorkommen (Holt et
al., 1987). Mithilfe von pro- und anti-inflammatorischer Zytokine verbinden und kontrollieren
sie das angeborene und adaptive Immunsystem. Deshalb wurde ein Profil der Zytokine
erstellt, die nach Konfrontation mit dem Pathogen A. fumigatus von DCs sezerniert werden.
Mittels genomweiter Affymetrix-Microarrays-Analysen wurden im Vorfeld interessante Gene
klassifiziert, die bei einer Immunantwort reguliert sein könnten, und daraus ein spezieller
Zytokin-Microarray erstellt (Mezger et al., 2008-1). Um die Pathogenese von früher IA in der
Lunge darzustellen, wurde bei dieser Studie in einem Modellsystem gearbeitet, dem moDCs
oder mDCs zugefügt wurden.
Die moDCs sowie die mDCs wurden 3 h und 6 h mit A. fumigatus Keimschläuchen
konfrontiert und die Ergebnisse der Genexpression abhängig von der Kontrolle ohne
Keimschläuche ausgewertet. Von den 117 getesteten Genen, die eine anti- und pro-inflamma-
torische Immunantwort regulieren, fanden sich maximal 21 % mehr als 2-fach reguliert. Von
diesen waren die meisten Gene, unter denen die Chemokine dominierten, heraufreguliert. Es
wurde eine erhöhte Expression des Transkriptionsfaktors NF-κB nach Konfrontation mit
A. fumigatus gefunden. Durch NF-κB werden Mediatoren einer inflammatorischen
Immunantwort freigesetzt, die untere anderem die ebenfalls hochregulierten Zytokine IL1β,
IL8 und TNF-α, mit einschließen (Bonizzi, Karin, 2004). Das ist ein Indiz dafür, dass
zwischen 3 h und 6 h nach Konfrontation mit A. fumigatus eine pro-inflammatorische
Immunantwort ausgelöst wird und der Zeitpunkt noch nicht erreicht ist, an dem anti-
inflammatorische Zytokine die Immunantwort wieder einschränken.
Dazu wurde ein Zytokexpressionsinprofil gefunden, das weitgehend mit früheren Studien
übereinstimmt, die die Interaktion von Immunzellen mit Pilzen, darunter auch Candida
albicans, oder mit dem Bakterium Mycobacterium tuberculosis, das den Körper auch von der
Lunge aus infiziert, untersuchten (Kim et al., 2005; Cortez et al., 2006, Mezger et al., 2008-1;
Yuan et al., 2008; Stern et al., 2009). Im Modell der frühen IA zeigte sich neben den
erwähnten Genen IL1β, IL8, TNF-α und NF-κB eine Hochregulation der Gene CCL4,
CCL20, CXCL1, CXCL2 CXCL3 und CXCL4.
Von den Chemokinen CXCL1, CXCL2 und CXCL3 ist bekannt, dass sie von plasmacytoiden
DCs bei einer Virusinfektion als erstes ausgeschüttet werden, um naive T-Lymphozyten
anzulocken (Piqueras et al., 2006). CXCL5 lockt vor allem Neutrophile zum Infektionsort
(Chang et al., 1994). Die Hochregulation dieser Gene weist darauf hin, dass ihre Funktionen
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7 Diskussion
für die erfolgreiche Abwehr von A. fumigatus benötigt werden. Auch bei anderen
Pilzinfektionen werden CXC- und CC-Chemokine ausgeschüttet, wie bei einer Infektion von
Mäusen mit Candida albicans beobachtet wurde (Yuan et al., 2008; Yuan et al., 2010).
Es fand sich eine 40-fach erhöhte Expression von CCL20 sowie eine 35-fach erhöhte
Expression von CCL4 nach 6 h Stimulation in moDCs und eine halb so stark erhöhte
Expression in mDCs. Vor allem auf Lymphozyten wird der Rezeptor CCR6 exprimiert, der
hochspezifisch CCL20 bindet (Baba et al., 1997; Williams et al., 2006). Aber auch NK-
Zellen, die direkt gegen A. fumigatus wirksam sind (Schmidt et al., 2011), werden durch diese
Chemokine beeinflusst. Nach allogener Stammzelltransplantation besteht ein erhöhtes Risiko,
an IA zu erkranken, wenn sich zwar die Zahl der Neutrophilen erholt hat, aber immer noch
eine niedrige Anzahl an T-Lymphozyten vorhanden ist (Wald et al., 1997). Bestätigend wurde
bei gesunden Menschen eine signifikante TH1-Antwort nach Kontakt mit A. fumigatus
beobachtet und auch bei Patienten, die klinisch bewiesen eine IA hatten, ein erhöhter IFN-γ
Level, der die Proliferation von TH1-Lymphozyten ermöglicht (Herbart et al., 2002).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Funktion der DCs, dass Immunsystem durch ein
kompliziertes Netzwerk aus Zytokinen zu steuern, essentiell für eine erfolgreiche Abwehr von
A. fumigatus ist.
In Übereinstimmung mit früheren Daten, bei denen DCs im Well-plate System analysiert
wurden, wurde auch eine Hochregulation der Expression des Rezeptors Pentraxin 3 (PTX-3)
beobachtet. PTX-3 wurde bereits in Mäusen als ein Protein definiert, das zur Erkennung von
A. fumigatus Konidien beiträgt und zugleich zu einer geringeren Anfälligkeit gegenüber IA
führt (Garlanda et al., 2002). In einer in vivo Studie führte die Injektion von PTX3 zu einer
Immunität der Mäuse gegenüber A. fumigatus Konidien, die durch die gleichzeitige Zugabe
von Amphotericin B noch verstärkt wurde (Gaziano et al., 2004). Die hier gefundene erhöhte
Expression im Modell der frühen IA in der Lunge bestätigt die Bedeutung von PTX-3 in der
Phagozytose von Pilzen und in der Aktivierung einer Immunantwort. Als weiterer Rezeptor,
der nach Konfrontation mit A. fumigatus höher exprimiert war, wurde ICAM-1
(intrazelluläres Adhäsionsmolekül 1), ein intrazelluläres Adhäsionsmolekül, das vor allem auf
Lymphozyten exprimiert wird, identifiziert. Ein erhöhter Level an ICAM-1 ist verantwortlich
für eine gesteigerte Infiltration von Neutrophilen und Mastzellen. Zusammen mit anderen
Faktoren kann die erhöhte Expression von ICAM-1 und PTX-3 lokale Gewebeschädigung bei
IA erklären (Yanaba et al., 2003; Loeffler et al., 2009).
- 98-

7 Diskussion
7.3 In vitro Untersuchung eines Risikogens für invasive
Aspergillose
Um herauszufinden, ob es eine genetische Prädisposition bei Patienten gibt, an invasiver
Aspergillose zu erkranken, wurden SNPs bei Patienten nach Stammzelltransplantation mit IA
im Vergleich zu Patienten mit gleicher Behandlung aber ausbleibender Infektion untersucht.
Dadurch konnten gewisse Haplotypen identifiziert werden, die ein erhöhtes Risiko aufweisen.
Es wurden drei gekoppelt vererbte SNPs – rs3921 (C/G), rs1554013 (C/T) und rs4257674 (A/
G) – im Genom von CXCL10 entdeckt, bei denen ein Haplotyp (CC CC GG) verstärkt bei IA
auftrat (Mezger et al., 2008-2). Mezger et al. (2008-2) beobachteten zusätzlich deutlich
höhere Expressionsniveaus des CXCL10-Gens im Haplotyp GG TT AA von freiwilligen,
gesunden Spendern im Vergleich zu Spendern mit der Allelkombination CC CC GG.
CXCL10 ist ein Chemokin, das TH1-Zellen zur Migration anregt. Die Wichtigkeit einer TH-1-
Antwort zum Schutz gegen IA wurde sowohl im Mausmodell (Cenci et al., 1997; Cenci et al.,
1998; Cenci et al., 1999) als auch im Menschen hinreichend untersucht (Hebart et al., 2002;
Chaudhary et al., 2010).
7.3.1 Suppression der Expression des CXCL10-Gens mittels siRNA
Um zu überprüfen, ob die Expression des CXCL10-Gens einen Einfluss auf die Reifung und
Zytokinproduktion dendritischer Zellen nach Konfrontation mit A. fumigatus hat, wurde das
Gen mittels small interfering RNA (siRNA) ausgeschaltet. Im Fall der moDCs wurde als
Methode die Elektroporation zur Transfektion der siRNA angewandt, wie von Prechtel et al.
(2006) vorgeschlagen und von Mezger (2007) optimiert. Vor allem für siRNA-Anwendungen
bei Patienten eignet sich die Elektroporation, da man durch chemische Substanzen oft
unerwünschte Nebeneffekte, wie zum Beispiel Allergien, verursacht.
Obwohl die siRNA spezifisch ist, kann es dennoch zu unspezifischen Effekten kommen.
Durch die Transfektion mit siRNA können unerwünschte Immunreaktionswege ausgelöst
werden (Hannon, Rossi, 2004). Deshalb wurden moDCs zur Kontrolle mit einer non silencing
siRNA transfiziert, welche, wie gewünscht, keine Effekte auf die getesteten Gene zeigte. Die
siRNA CXCL10 (2) zeigte keine signifikante Reduktion der Genexpression, weshalb mit
CXCL10 (1), die weitaus wirksamer war, da sie auf mRNA-Ebene nur noch eine geringe
Restexpression von CXCL10 hervorrief, weitergearbeitet wurde. Im Mediumüberstand zeigte
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7 Diskussion
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sich mit siRNA CXCL10 (1) signifikant geringere Proteinlevel im Vergleich zur Kontrolle,
aber kein Unterschied der Kontrolle zur non silencing siRNA oder der siRNA CXCL10 (2).
7.3.2 Einfluss des Knockdowns auf Zytokinfreisetzung und Reifung der
moDCs nach Konfrontation mit Aspergillus fumigatus
Nach erfolgreichem Gene-silencing wurde analysiert, inwiefern moDCs in vitro divergent auf
A. fumigatus reagieren. Es wurden die Zytokinfreisetzung und die Reifung der moDCs
betrachtet, in denen das CXCL10-Gen wirksam reduziert war, im Vergleich zu moDCs, die
mit einer Kontrolle behandelt wurden. Die Zellen, die mit siRNA CXCL10 (1) behandelt
wurden, waren in der Lage, im gleichen Maße IL12-p40, TNF-α und IL10 auszuschütten wie
die Kontrollzellen. Darüber hinaus zeigte sich auch kein Unterschied in der Ausbildung der
kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80, CD83 und CD86. Die alleinige Ausschaltung
eines Chemokins hatte daher keine Effekte auf die allgemeine Zytokinfreisetzung und
Reifung der moDCs. Es kann möglich sein, dass die Restexpression des Gens ausreicht, eine
ebenso gute Freisetzung anti- und pro-inflammatorischer Zytokine und Reifung nach
Konfrontation zu bewirken wie die volle Expression. Oft können die Zellen einen fehlenden
Reaktionsweg auch mittels alternativer Mechanismen überbrücken, was dieses Ergebnis auch
erklären würde. Freches et al. (2011) konnten im Mausmodell zeigen, dass das Fehlen von
IL12 mit dem daraus resultierenden niedrigen INF-γ-Level durch das Ausschütten anderer
Zytokine erfolgreich überbrückt wurde. Auch NK-Zellen haben die Möglichkeit, das Fehlen
von Typ I Interferonen auszugleichen (Geurs et al., 2009). Eine weitere Hypothese ist, dass
nur ein kleiner Teil des Immunsystems in vitro betrachtet und keine in vivo Studie
durchgeführt wurde. Zuletzt ist nicht bewiesen, dass das Fehlen von CXCL10 die Expression
anderer Zytokine beeinflusst. Das erhöhte Risiko, an IA zu erkranken, wenn CXCL10 fehlt,
kann nicht nur durch die Beeinflussung des Chemokins von DCs selbst, sondern auch durch
die chemotaktischen Eigenschaften auf Makrophagen, T-Lymphozyten oder NK-Zellen
einhergehen. Einen Einfluss des CXCL10-Knockdowns auf die Interaktion zwischen Zellen
zum Beispiel die Anregung der Proliferation der T-Lymphozyten, muss in Zukunft noch
untersucht werden.

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9 Anhang
9 Anhang
9.1 Abkürzungen
- minus
+ plus
± plus minus
% Prozent
< kleiner als
> größer als
= gleich
× g hier: standard gravitation
Abb. Abbildung
ABPA Allergisch bronchopulmonare Aspergillose
A. fumigatus Aspergillus fumigatus
APC Allophycocyanin
APC antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell)
Aqua demin Demineralisiertes Wasser
aRNA antisense Ribonukleinsäure
ATCC Amercian Type Culture Collection
β-ME beta-Mercaptoethanol
BM-DCs bone-marrow derived dendritic cells
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
bzw. beziehungsweise
°C Einheit: Grad Celsius
CCL20 Chemokine (C-C motif) ligand 20
CCR Chemokinrezeptor
CD Differenzierungsmarker (cluster of differentiation)
cDNA komplementäre oder copie-DNA, von mRNA abgeleitet
cfu Koloniebildene Einheit (colony forming unit)
cm Einheit: Zentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
Cp
Crossing Point
CR Komplement Rezeptor
CT
Cycle threshold
CXCL10 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10
CytoD Cytochalasin D
Cy3 Cyanin 3
Cy5 Cyanin 5
dATP 2'-Desoxyadanosin 5'-Triphosphat
DC dendritische Zelle
DCF 2',7'-Dichlorofluorescein Diacetat
DC-SIGN dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing
non-integrin
- 116-

9 Anhang
- 117-
dCTP 2'-Desoxycytosin 5'-Triphosphat
dGTP 2'-Desoxyguanosin 5'-Triphosphat
d.h. dass heißt
DNA 2' – Desoxirubonukleinsäure
DNase Desoxiribonuklease
dsRNA doppelsträngige RNA
dTTP 2'-Desoxythymidin 5'-Triphosphat
dUTP 2'-Desoxyuridin 5'-Triphosphat
EDTA N, N, N’, N’ – Ethylendiamintetraacetat-Dinatriumsalz
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
EtOH Ethanol
EtOH-DCs mit Ethanol behandelte dendritische Zellen
FACS fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (fluorescence activated cell
sorting)
FCS fetales Kälberserum (fetal calf serum)
FITC Fluorescein 4(6)-isothiocyanat
FRET Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (Fluorescence resonance
energy transfer)
FSC Forwärtsstreulicht (forward scatter)
g Einheit: Gramm
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor
(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor)
GMP Gute Herstellungspraxis (Good Manufacturing Practice)
GvHD Graft-versus-Host-Reaktion oder Transplant-Wirt-Reaktion (Graftversus-Host-Disease)
h Einheit: Stunde
h-Alas humanes δ-Aminolevulinatsynthase
HBSS Hank's balanced salt solution
HEK-293 humanen embryonalen Nierenzellen (human embyonic kidney cells)
H2O2
Wasserstoffperoxid
HPR Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)
Hsp Hitzeschockprotein
IA invasive Aspergillose
ICAM intrazelluläres Adhäsionsmolekül (intercellular adhesion molecule)
IFN-γ Interferon Gamma
IκB-α nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhance in B-cells
inhibitor, alpha
IL Interleukin
IP-10 IFN-inducible protein 10
l Einheit: Liter
LPS Lipopolisaccharid
LRSC Leukozyten-Reduktions-System Kammer (leukoreduction system
chamber)
M Molar
m³ Einheit: Kubikmeter
MAT mating-type-Locus
mDC myeloide dendritische Zelle
mg Einheit: Milligramm
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility

9 Anhang
complex)
min Einheit: Minute
MIP-3α human macrophage inflammatory protein 3α
ml Einheit: Milliliter
mm Einheit: Millimeter
mM Einheit: Millimolar
moDC monocyte derived dendritic cell
MOI Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection)
MPA Mykophenolsäure (mycophenolic acid)
MR Mannoserezeptor
mRNA messenger RNA
mTOR mammalian target of rapamycin
MyD88 Myeloid differentiation primary response gene (88)
NaCl Natriumchlorid
NET neutrophile extrazelluläre Fallen (neutrophil extracellular trap)
NF-κB nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells
ng Einheit: Nanogramm
NK-Zelle natürliche Killerzelle (natural killer cell)
nM Einheit: Nanomolar
ns nicht signifikant
nt Nukleotid
OD optische Dichte
PAMPs pathogen-assoziierte, molekulare Muster (pathogen associated
molecular patterns)
PBMCs periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononulcear
cells)
PBS phosphate bufferd saline
PCR Polymerasekettenreaktion
PE Phycoerythrin
PerCP peridinin chlorophyll protein
pg Einheit: Pikogramm
pH Einheit: pondus Hydrogenii (pondus = Gewicht; hydrogenium =
Wasserstoff)
PMA Phorbol 12-myrisate 13-acetate
PMN Polymorphonuclear cell
PTX Pentraxin
p.a. Pro analysis
RAD 40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (Everolimus)
RAD-DCs mit RAD behandelte dendritische Zellen
RAPA Rapamycin (Sirolimus)
RIN RNA integrity number
RISC RNA-inducing silencing complex
RNA Ribonukleinsäuren
RNAi RNA Interferenz
RNase Ribonuklease
ROS reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species)
rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
RPMI Roswell Park Memorial Institute
RT Reverse Transkriptase
RT-PCR reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion
- 118-

9 Anhang
sec Einheit: Sekunde
siRNA small interfering RNA
SNP single nucleotide polymophism
SSC Seitwärtsstreulicht (side scatter)
ssRNA single strand RNA
SYBR Green I auch: 2-{2-[3-Dimethylamino-propyl)-propylamino]-1-phenyl- 1Hchinolin-4-ylidenmethyl}-
3-mehtyl-benzothiazol-3-ium-
Kation
T Einheit: Temperatur
Taq Thermus aquaticus
TLR Toll-like Rezeptor
TMB Trimethylbenzidin
TNF-α Tumornekrosefaktor alpha
TBE TRIS-Borat-EDTA Puffer
U Einheit: Unit
UV Ultraviolett
V Einheit: Volt
µg Einheit: Mikrogramm
µl Einheit: Mikroliter
µm Einheit: Mikrometer
µM Einheit: Mikromolar
ρ Einheit: Rho
9.2 Liste der Mircroarray-Oligonukleotide
Tabelle 9.1: Oligonukleotide für Aspergillus-dendritische Zellen-Mircroarray
Gen ID Name / Funktion Oligonukleotidsequenz
TLR1 NM_003263 Toll-like Rezeptor 1
TLR2 NM_003264 Toll-like Rezeptor 2
TLR3 NM_003265 Toll-like Rezeptor 3
TLR4 NM_138554 Toll-like Rezeptor 4
TLR5 NM_003268 Toll-like Rezeptor 5
TLR6 NM_006068 Toll-like Rezeptor 6
TLR7 NM_016562 Toll-like Rezeptor 7
TLR8 NM_016610 Toll-like Rezeptor 8
- 119-
tctggcagctctggaagaaatcagccgatgggtgggaaa
ctgaattgtgatcaat
gacatcctgaacctgctggccacgcacatgggatggaga
gtcacacaggtaattt
tgtggaggtgagacagaccctttaggaaataaatgggacc
accagggtttgcgtg
atgttgcttcctgccaattgcatcctgtacccactgttccttct
ggattccatga
tcaggagaaaggactttttgttttcctgtctccaggttcgga
cagcgccaacatt
atgctcttgccagggacaaagttcctctcatgaagacaaat
ctgtatatcttctttttctaggt
tggcattgccacacgtgaggaaaatacgacatcgccaatc
taaggcttgaacacatgcacgc
aaaagtttgcgtagggagcttggcagtttgggtggcacgt
gtgaaagagaattga

9 Anhang
TLR9 NM_017442 Toll-like Rezeptor 9
TLR10 NM_030956 Toll-like Rezeptor 10
CX3CL1 NM_002996
CX3CR1 NM_001337
Chemokin (C-X3-C Motiv) Ligand 1
(Fraktalkin)
Chemokin (C-X3-C Motiv)
Rezeptor 1
CCL1 NM_002981 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 1
- 120-
gagggacagggatatgagggatttgggcagcgcaggca
cagtcatgatgttgttg
taaacaatcctgggatgaacacctttttccataagcccttat
aaacttgtgaaggtgtttctatagga
aaatggcacagacgttggtgatgagggttggaaaagtcttt
ccaaagtcttcctactctttccaaagtct
ccccagcaaatgcatagatgagaggattcaggcaacaat
ggctaaatgcaaccgt
gtgatgatctgcatgtcttctggtctggcttgggccttcctg
gagcagctttgat
CCR 1 NM_001295 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 1 ggcttctctctggttccaagggactttgtccgtgaagtctttg
tttctggggctttctgggtt
CCL 2 NM_002982 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 2
ggtgattcttctatagctcgcgagcctctgcactgagatctt
cctattggtgaag
CCR 2 NM_000648 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 2 aatccactttctctgttcagcttgtggcttgtctcaggcagtc
ctggtatgtcaggcttctca
CCR 3 NM_001837 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 3 caactgtatctagtgaggttgtcatttcacttctccaatacaa
ctcagcagtgaaatgtgcaatgattct
CCL 4 NM_002984 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 4
cttcctcgcagtgtaagaaaagcagcaggcggtgggagg
gtctgagcccattggt
CCR 4 NM_005508 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 4 tggacctgagccgcttgtatttgaacaggaccagaaccac
cacagaatttccaag
CCL 5 NM_002985 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 5
ggttgcattgagaactttaatggtaagccgatttttcatgtttg
ccagtaagctcctgtgaggggttgag
CCR 5 NM_000579 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 5 tctagccttgtccttcctccccatgtcttcccaaccagctctg
tctccttctaca
CCR 6 NM_004367 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 6 ccctttaaaataattatcagaagccagcataattccagctgt
cccctagctaatctgcagctcctca
CCL 7 NM_006273 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 7
ttgtttctcaagtcatggcttgtttttagttcagtcatgaatgtt
caaagctttggagtttgggt
CCR 7 NM_001838 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 7 agcggacgcaggccaggctgtaggtgacgtcgtaggcg
atgttgagttgcttact
CCL 8 NM_005623 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 8
caacaacagcagtacaaagcacacatttgacttacaggag
cactgattgccaaagaatacca
CCR 8 NM_005201 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 8 gcatgcacaactatgtctccagtcattgtgttttaagtgttgg
caacaacatatatggcatcc
CCR 9 NM_006641 Chemokin (C-C-Motiv) Rezeptor 9 catcagccatgttaggaatagggcttgtggagggcgatgc
aactctccctgggacagc
CCL 11 NM_002986 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 11
CCL 13 NM_005408 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 13
tctctagtcgctgaaggggtatcttcctattggccaggttaa
agcagcaggtggt
gagctctccttcctacattgcagcatcccttcatgtccatga
ctcccacaggcat

9 Anhang
CCL 15 NM_032965 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 15
CCL 16 NM_004590 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 16
CCL 17 NM_002987 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 17
CCL 18 NM_002988 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 18
CCL 19 NM_006274 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 19
CCL 20 NM_004591 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 20
CCL 21 NM_002989 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 21
CCL 23 NM_005064 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 23
CCL 24 NM_002991 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 24
CCL 25 NM_005624 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 25
CCL 26 NM_006072 Chemokin (C-C-Motiv) Ligand 26
- 121-
ttaagtatttcagaccaagaaactcacaggaggtgttggag
gtgggtggctggcc
ataagggagttttatttattgcatgcttgggttttggactaag
agtttacccctagccgtgtctcatacc
tttaactgcattcttcactctcttgttgttggggtccgaacag
atggccctgccc
aaggtggtgctgagcaaaaccattcaataaagatttgtcatt
tgatacatatggcacaatgtctgctgag
ctgcacggtcataggttaactgctgcggcgcttcatcttgg
ctgaggtcctctgc
ttcgccgcagaggtggagtagcagcactgacatcaaagc
agccaggagcaaactc
atggagcagcctaagcttggttcctgcttccggtagctgcg
gacaaccttggcgg
tccaagggcagtaacaagcatgaggcaggagagggca
gccacggagaccttcatc
aacaaagaacatgcagcagggagaggggatgaccaca
gagcccgtagggatgatg
cagagggaggaccaactcaggtgcagggattaagacttg
acccaaaagacagagg
cccaaactcctcctgcctgatccccttttatgagactgagac
ggccctggggtct
CXCL 1 NM_001511 Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 1 atgcaggattgaggcaagctttccgcccattcttgagtgtg
gctatgacttcggt
CXCL 2 NM_002089 Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 2 tcctgttctttgtgaaaacatcaataaatatcgaaacctctct
gctctaacacagagggaaacactgcat
CXCL 3 NM_002090 Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 3 gatacgctgataagcttcttacttctctcctgtcagttggtgc
tccccttgttca
CXCR 4 NM_003467
Chemokin (C-X-C-Motiv) Rezeptor
4
caacttaatacaagactgtacactgtaggtgctgaaatcaa
cccactcctgaaaactgaaaaacc
CXCL 5 NM_002994 Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 5 aaactttacagcattatcaaggatattaagacaacactgact
aaccggtttcattaccgcatcttcccc
CXCL 6 NM_002993 Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 6 tgcacagataacggtatgacacacccagtgttctaatacag
tacaacttaaatagcatcctagggta
CXCL 9 NM_002416 Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand 9 gtttccacatcctgcagaggctaactgggcaccaatcatg
cttccactaaccgac
CXCL 10 NM_001565
CXCL 11 NM_005409
CXCL 12 NM_000609
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand
10
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand
11
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand
12
atggtgctgagactggaggttcctctgctgtaggctcagaa
tatgtctaagcaat
tggtgctgttgctgctacttcagctttgctgctcttcttggaa
ggagtagaaatg
gtggacacacatgatgatggatgagacagagaatgatga
gcagaacgtggaggat

9 Anhang
CXCL 13 NM_006419
CXCL 14 NM_004887
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand
13
Chemokin (C-X-C-Motiv) Ligand
14
IL1A NM_000575 Interleukin-1 alpha
IL1B NM_000576 Interleukin-1 beta
IL1R1 NM_000877 Interleukin-1 Rezeptor 1
IL1R2 NM_004633 Interleukin-1 Rezeptor 2
IL2 NM_000586 Interleukin-2
IL6 NM_000600 Interleukin-6
IL6R NM_000565 Interleukin-6 Rezeptor
IL8 NM_000584 Interleukin-8
IL8RA NM_000634 Interleukin-8 Rezeptor A
IL8RB NM_001557 Interleukin-8 Rezeptor B
IL10 NM_000572 Interleukin-10
IL10RA NM_001558 Interleukin-10 Rezeptor A
IL10 NM_000628 Interleukin-10 Rezeptor B
IL11 NM_000641 Interleukin-11
IL11RA NM_004512 Interleukin-11 Rezeptor A
IL12A NM_000882 Interleukin-12 alpha
IL12B NM_002187 Interleukin-12 beta
IL12RB1 NM_005535 Interleukin-12 Rezeptor B1
IL23 NM_016584 Interleukin-23
- 122-
gaggtagagttcagacttgagctctgagtccaggctcatta
gcagagtcagttttt
atgcaatgctaatggtttctgacatgtacatagcatataaca
cagcagtacaatgcggcatatactgggg
ctcaggcatctccttcagcagcactggttggtcttcatcttg
ggcagtcacatac
taccctaaggcaggcagttgggcattggtgtagacaacag
gaaagtccaggctat
ttagtggggacaataagtcaaaggaagttcacggggaact
aggaatgtgtcttct
tccatttatttcacttgggataggattgaaagtcttgatgatg
aggccatagcacagtcagaccatctgc
atggttgctgtctcatcagcatattcacacatgaatgttgtttc
agatccctttagttccagaactatta
agttcatagctgggctcctggaggcgagatagagcttctct
ttcgttcccggtgg
cctgcctttttgccaacctaagatgagttgcctcaagcagc
aatagggtctaaaatct
gagatggttccttccggtggtttcttcctggctcttgtcctag
aagcttgtgtgc
tttgatctaactgaagcaccggccaggtgtgtccaacagta
ggagctgcagtcagagatcagagt
tttcaacatcctaaacataaaccctgtgcccattaaaccgtc
acttcccatgctccc
accgcgcccggcctagaaccaaatttaggttgttataaata
acaagctggccacagc
cggacagtatctgcattctcccaggaccagcttggctaata
cccagcaaacatgg
ctgtgtagcattgagctgaccacccttgagttgaggtcgatt
ttcagatcagtccatccat
cattaaaagtcacccacaatcccacctctctcctttgacctg
gagacagtcattgtcaacattttggcgt
aaggacccacacacactccccaggcacctacatacatgc
atgcagagaatacatgttccctgcctcacag
agtcccatccttctttccccctccctagttcttaatccacatcc
tatcaaagttt
caggaaacaaatgtaatcactttacagagcgcacatacatt
acttaaaagtagcaccttcatggagcca
tcctggaagtccactgggttgatccactgccaagtctccttc
cctccagggaact
tctgttcagcgcgtctctggtttggttccctcagttgttcacc
gagtttgtaagc

9 Anhang
TNF NM_000594 Tumornekrosefaktor
TNFRSF1A NM_001065
TNFRSF1B NM_001066
Tumornekrosefaktor-Rezeptor
Superfamilie 1A
Tumornekrosefaktor-Rezeptor
Superfamilie 1B
IFNA2 NM_000605 Interferon-alpha 2
IFNG NM_000619 Interferon-gamma
LTA NM_000595 Lymphotoxin alpha
LTB NM_002341 Lymphotoxin beta
NFKB1 NM_003998
NFKB2 NM_002502
NFKBIA NM_020529
NFKBIL1 NM_005007
NFRKB NM_006165
ICEBERG NM_021571
Nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in B-cells
1
Nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in B-cells
2
nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in B-cells
inhibitor, alpha
nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in B-cells
inhibitor-like 1
Nuclear factor related to kappaB
binding protein
Caspase recruitment domain family,
member 18
Dectin-1 NM_197947 Dectin-1
DC-SIGN NM_021155
HSP90AB1 NM_007355
Dendritic Cell-Specific Intercellular
adhesion molecule-3-Grabbing
Nonintegrin
Heat shock protein 90kDa alpha
(cytosolic), class B member 1
HSPA8 NM_006597 Heat shock 70kDa protein 8
ICAM1 NM_000201 Intercellular adhesion molecule 1
HMOX NM_002134 Hämoxygenase
- 123-
aggcttgtcactcggggttcgagaagatgatctgactgcct
gggccagagggctgattagaga
cagaattttagtgtatgtacaaaagtccacagctccagctg
aaggccccattgttccgtgctcgcccctg
caaacaggtttattgataagcaggaatgccgtccagcata
cagtgcaaactttcattgtc
tctcatgatttctgctctgacaacctcccaggcacaagggc
tgtatttcttctct
atttgggtacagtcacagttgtcaacaatatttggaagcacc
aggcatgaaatctcctgagatgctatgt
gccttcataaatagtcccctccctgcctctagtcatccccca
agctcctccatgt
caatattcacgcactcgcaccacgcactcatattccctcac
cccaccatcacggc
tggccatatctagaggcgtggttccaggcacaactccttca
tcctctcctgcatt
agccatcactggctctaaggaaggcagagaagcgcagc
cgcactatactcagatc
agggctgatcctaccacaataagacgttttgggctaggca
gtgtgcagtgtggat
cacttgttacaactttcgctcccacccatatcctctgctgag
cagcacctggctcttccttgtggtccc
ctccctggtcccttctcagccagagcagaccaggcatggt
ctttcacggaagccat
agtgctccagagttccatcttctctcttagtgcaaacccatct
ttgaggcaagtt
ataactgatatactgctagaagttgagggtcaaatcgtggc
aacacaccgtgcacttcaatggcattgtt
ctgtctctccaagttggaggctggggcagattttatatacag
agggtagtgaggcatgatatgattggat
agaaaataaaataaaccacaatacacaacatccaatcctg
ctgtcaagagtagagagggaatgggg
ttagcacgttcacaagcagtacggaggcgtcttacagctct
cttgttctcactga
tgcttgcaggaccctgatcactgcaggaaactggagctgc
aatagtgcaagctcccagtgaaatgcaaac
ccttgttgcgctccatttcctcctcgagggctgagtatgtga
agtaaagtgccgt

9 Anhang
TXN NM_003329 Thioredoxin
TOLLIP NM_019009 Toll interacting protein
SOD1 NM_000454 Superoxiddismutase 1
MPO NM_000250 Myeloperoxidase
MIF NM_002415
MYD88 NM_002468
Macrophage migration inhibitory
factor
Myeloid differentiation primary
response gene (88)
NCF-1 NM_000265 Neutrophil cytosolic factor 1
PTX3 NM_002852 Pentraxin 3
uPA NM_002658
CSF2 NM_000758
Homo sapiens plasminogen
activator, urokinase
Colony stimulating factor 2
(granulocyte-macrophage)
GSK3A NM_019884 Glycogen synthase kinase 3 alpha
- 124-
tctgcttcaccatcttggctgctggagtctgacgagcggct
gtaaggaccgatgg
tggagaagaaatctacacaggcgtaagaccaggccatct
gagacagggaatccca
gtgtttaatgtttatcaggatacatttctacagctagcaggat
aacagatgagttaaggggcctcaga
gtcacatagctagcaagccacagagccaggattggaacc
caggcagtctagttcc
ttgttccagcccacattggccgcgttcatgtcgtaatagttg
atgtagaccctgt
acacaggtgccaggcaggacatcgcggtcagacacaca
caacttcagtcgatagt
ttgctttcatctgacagaaccaccaaccgctctcgctcttct
ctacgacctccac
tctctctttcattagtctcaagtgttcctattatgcactgagtttt
cagaccttcccaactggcatgtgt
cttgcgtgttggagttaagccttgagcgacccaggtagac
gatgtagtcctcctt
gcacaggaagtttccggggttggagggcagtgctgcttgt
agtggctggccatca
tattgaacggaggtctgtacacaggcaaaccttactgtgga
aactaagacatcaggagctctctccactc

9 Anhang
Tabelle 9.2: Kontrollen (Housekeeping Gene)
Gen ID Name/Funktion Oligonukleotidsequenz
ACTB NM_001101 Aktin B
ALAS NM_000688 Aminolevulinat Delta- synthase 1
ATP6V1A NM_001690
ATPase, H+ transporting, lysosomal
70kDa, V1 subunit A
CD81 NM_004356 CD81-Molekül
EEA1 NM_003566 early endosome antigen 1
GAPDH NM_002046
GOLGA4 NM_002078
Glyceraldehyd-3phosphatdehydrogenase
golgi autoantigen, golgin subfamily
a, 4
MYO1C NM_033375 Myosin 1C
NIPB NM_031466
PECR NM_018441
PSMA7 NM_002792
Trafficking protein particle complex
9
peroxisomal trans-2-enoyl-CoA
reductase
proteasome (prosome, macropain)
subunit, alpha type, 7
USP49 NM_018561 ubiquitin specific peptidase 49
ZNF710 NM_198526 Zinkfingerprotein 710
Tabelle 9.3: Kontrollen (Aspergillus Gene)
- 125-
gctcattgccaatggtgatgacctggccgtcaggcagctc
gtagctcttctccag
gaatctaggtggagaagaagccactcatccatccaggca
gggaagactcttaggg
tatgaaacttgtttaattggctccacttaggaccagacacag
cacaataaatacagaactgcatcatc
gtagggcctggtcatagaactgcttcacatccttggcgatct
ggtccttgttgac
caactgacagcgagggtaagaagctttctaagattctaaat
ggacaatgcgtggg
ggtctctctcttcctcttgtgctcttgctggggctggtggtcc
aggggtcttact
tgcagcactttctgactcaagcctatcttccaatgcctttaac
tcctcctctttg
aaaggccctacatccttgagtggggcccgagtgtgcggg
caagctgtctgtcatc
ttgaacttgtccacttgaatagccattcgctggcactcgccg
gcgtgcaggatga
agccactgcgtctggcctctacctttacaattaaataataaa
atcttctgggagttcatgatccctagaa
tgcttcagactggcgatgtagcgggtgatgtactccacagt
gaccgggtcctcca
cttgaggttacacaggttctactgtttctgcataaccaagaa
ggaaactggggtgtgca
tggggtcttggctgtccaggccgatgtctatgacgccatgc
ttgaccttcatgtg
Gen ID Name/Funktion Oligonukleotidsequenz
FKS1 NC_007199 P-(1,3)-Glucansynthase
SidA AY586511 L-ornithine N5-oxygenase SidA
Rho1 AY007297 Rho GTPase Rho1
gcgacgtcctggcctctgagaacaaacgatctcaatgtcgt
gtggattgccaaatgtacaataccat
atggcggatatcgtgttcacaggttccctcatgtctgctccg
tcttccggagttccaatcgtgttgtcag
accagttattggagacgcttatccgttgataaaatctccgaa
ttgaaacagaccttttgcgaaggagacg

9 Anhang
9.3 Publikationsliste
9.3.1 Veröffentlichungen
In press bei Journal of Basic Microbiology:
- 126-
40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin modulates human dendritic cell function during
exposure to Aspergillus fumigatus.
Ruth Bauer, Markus Mezger, Christian Blockhaus, Anna-Lena Schmitt, Oliver Kurzai,
Hermann Einsele and Juergen Loeffler.
40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD), a novel derivate of the immunosuppressive drug
rapamycin, was analyzed for its immune-modulatory influence during the interaction of
human monocyte-derived dendritic cells (moDCs) with Aspergillus fumigatus. RAD is
clinically used to prevent graft-versus-host disease, as well as solid organ and bone marrow
transplant rejection. However, it may constitute risk factors for the development of
opportunistic infections, such as invasive aspergillosis, which is mainly caused by the most
common airborne fungal pathogen A. fumigatus. moDCs were generated in the presence or
absence of RAD. In this settings RAD had various modulating effects on the immune function
of DCs. A decrease of pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-12, TNFα, CCL20 and IL10)
was observed. Furthermore, RAD reduced the expression of innate immunity receptors
(TLR2, TLR4 and dectin-1), impaired the maturation capacity of moDCs, observed through
the reduction of co-stimulatory factors (CD40, CD80, CD83 and CD86), and impaired
capacity of phagocytosis and damage of A. fumigatus. These data demonstrate that RAD
influences the differentiation of moDCs. RAD modulates the cytokine response of moDCs to
A. fumigatus and reduces their ability to kill germ tubes. Thus, RAD treatment might affect
the risk for invasive aspergillosis independently of its blocking capacity for T-cell activation.

9 Anhang
9.3.2 Kongressbeiträge
- 127-
R. Bauer, M. Mezger, O. Kurzai, H. Einsele, J. Loeffler, 2010. Einfluss von 40-0-[2-Hydroxy-
Ehtyl] Rapamycin auf humane dendritische Zellen nach Konfrontation mit Aspergillus
fumigatus.
Vortrag bei der Jahrestagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft (DMykG)
vom 09.09. - 11.09.2010 (Wien).
R. Bauer, M. Mezger, O. Kurzai, H. Einsele, J. Loeffler, 2009. Interaktion humaner
Immunzellen mit Aspergillus fumigatus unter dem Einfluss von 0-0-[2-Hydroxy-Ehtyl]
Rapamycin.
Posterpräsentation bei der Jahrestagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft
(DMykG) vom 03.09. - 05.09.2009 (Köln).
R. Bauer, M. Mezger, C. Blockhaus, O. Kurzai, H. Einsele, J. Loeffler, 2009. Interaction of
human primary immune cells with Aspergilus fumigatus under the influence of
immunomodulatory agents.
Posterpräsentation bei der Third FEBS advanced lecture course: Human fungal pathogens
vom 02.05.-08.05.2009 (Nizza).

9 Anhang
9.4 Lebenslauf
Persönliche Daten
Geb. am 13.06.1983 in Regensburg; ledig
Berufstätigkeit
12/2007-01/2011 Universitätsklinikum Würzburg (Medizinische Poliklinik II und
Studium
Koorperation mit dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene),
naturwissenschaftliche Doktorarbeit mit dem Thema:
„Interaktionen von humanen Immuneffektorzellpopulationen mit dem
humanpathogenen Pilz Aspergillus fumigatus, sowie der Einfluss von
40-0-[2-Hydroxyethyl]rapamycin (RAD) auf deren Funktionen“
10/2002 – 12/2007 Universität Bayreuth, Studium: Biologie Diplom
03/2007 - 10/2007 Diplomarbeit am Lehrstuhl der Tierökologie I mit dem Thema:
- 128-
„Quantifizierung der Sulfakinin Expression in Gryllus bimaculatus und
Effekte der RNA Interferenz“
02/2005 Zertifikat zur Durchführung tierexperimenteller Arbeiten
10/2004 - 12/2007 Hauptstudium mit Ausrichtung auf Molekular- und Zellbiologie
10/2002 - 10/2004 Grundstudium mit Vordiplom
Schule
08/2002 – 09/2002 Aufenthalt in Amerika
07/2002 Abitur am Gymnasium Ottobrunn
09/1999 – 07/2001 Französisch an der Volkshochschule Ottobrunn
10/1999 – 09/2001 Teilnahme am multinationalen Ariane-Projekt „Weltraum-Visionen“
mit Auftritt an der EXPO 2000 in Hannover

Danksagung
Ich möchte mich bei den vielen Menschen bedanken, die zu dem Gelingen dieser Arbeit in
der Medizinischen Klinik und Poliklinik II der Universität Würzburg in Kooperation mit dem
Institut für Hygiene und Mikrobiologie beigetragen haben.
Zuerst möchte ich mich bei Prof Dr. med Hermann Einsele bedanken, der mir die Möglichkeit
gegeben hat, an seiner Klinik eine wissenschaftliche Doktorarbeit anzufertigen.
Mein besonderer Dank gilt Pd Dr. rer. nat. Jürgen Löffler und Prof. Dr. med Oliver Kurzai,
die mir dieses zeitgemäße, interessante Thema anvertraut haben, für die kompetente
Betreuung und Unterstützung während meiner Arbeitszeit, sowie für die Möglichkeit auch an
internationalen Kongressen teilzunehmen.
Prof. Dr. rer. nat. Joachim Morschhäuser möchte ich für die Bereitschaft danken, das
Zweitgutachten dieser Arbeit zu übernehmen.
Dr. Susanne Kneitz von der IZKF Microarray Facility der Universität Würzburg möchte ich
für die Unterstützung bei der Durchführung und Auswertung der Microarray danken.
Des Weiteren möchte ich mich bei Anke Hornbach und Nina Tzreciak, Mitarbeitern des
Instituts für Hygiene und Mikrobiologie, bedanken, die mich für alle S2 Arbeiten in ihrem
Labor aufgenommen haben, mich dabei immer fachlich und technisch unterstützt haben und
mir die Inkubationszeiten verkürzt haben.
Ganz besonders möchte ich mich bei den Mitarbeitern meiner Arbeitsgruppe bedanken.
Doreen Killian danke ich für die hervorragende Einarbeitung in die immunologischen
Methoden. Tanja Breitschopf und Maria Bouzani danke ich für die wissenschaftlichen
Diskussionen zur praktischen Vorgehensweise und Auswertung der Ergebnisse sowie für das
Lesen diverser Abstracts, Manuskripte und nicht zuletzt dieser Arbeit. Bei Anna-Lena
Schmitt, Hannes Schlossnagel und Nadine Wilhelm möchte ich mich für die hervorragende
technische Assistenz bedanken. Bei diesen Leuten möchte ich mich auch für die Freundschaft
und für die wunderbare Zeit außerhalb der Labors und während der Mittagspausen bedanken.
Des Weiteren danke ich Michael Ok für die Einführung in den T-Zell-Assay sowie Dr. rer. nat

Markus Mezger und Dr. med. Christian Blockhaus für die Hilfe bei den Phagozyoseassays.
Mein Dank gilt auch allen anderen Mitarbeitern im Labor der AG Löffler (Dr. Jan Springer,
Claudia Hoffmann, Erika Liebscher, Bettina Göppner, Daniela Wilhelm, Anna-Katharina
Hofmann, Eva Hoffmann, Katharina Klessen, Melanie Brüstle und Dhyana Beyerle, Eva
Giese), die mir immer mit Rat zur Seite standen und Wartezeiten im Labor verkürzt haben.
Abschließend möchte ich mich bei meinen Eltern Sigrid und Georg bedanken für ihren
Beistand und das Vertrauen in mich während meiner gesamten Arbeit. Besonderer Dank gilt
meinem Freund Timo Damm, der mich immer unterstützt und motiviert hat.