Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg

5 Methoden
5 Methoden
5.1 Arbeiten mit Aspergillus fumigatus
Der Stamm ATCC46649 wurde im Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität
Würzburg in der Dauerform Konidie aufbewahrt. Zur Vermehrung der Konidien wurden diese
auf Bierwürzplatten ausgestrichen und ca. 36 h bei 37 °C aufbewahrt. Sobald neue Sporen
gewachsen waren, wurde steriles Wasser hinzu gegeben und mittels eines Wattestäbchens die
hydrophoben Konidien von der Agarplatte gelöst. Mit Hilfe eines Zellsiebs wurden
unerwünschte Agarstücke und größere Pilzstrukturen entfernt, und im Anschluss konnte die
Konidienzahl mittel Neubauer-Zählkammer (siehe 5.3.3) bestimmt werden. Die weitere
Verwahrung erfolgte in Wasser gelöst bei 4 °C.
Zur Herstellung von Keimschläuchen wurde eine bestimmte Anzahl Konidien aus der
wässrigen Stocklösung genommen und in RPMI-Medium mit 5% FCS für 12 – 16 h
synchronisiert. Durch anschließende Inkubation bei 37 °C unter Schütteln für 5 – 8 h bildeten
die Konidien kurze bis lange Keimschläuche aus. Die Morphologie des Pilzes wurde jeweils
unter dem Mikroskop überprüft. Danach wurden die Keimschläuche entweder sofort
weiterverwendet oder für spätere Versuche bei -20 °C eingefroren.
Für Versuche mit Infektionszeiten über 12 h wurden inaktivierte Keimschläuche verwendet,
da somit ein Wachstum von Hyphen und die daraus resultierende Beeinflussung des
Experiments vermieden werden konnte. Es wurden 1 × 10 8 Keimschläuche für mindestens
20 min in 20 ml 70 % igem Ethanol aufgenommen und danach dreimal mit RPMI-Medium
mit 5 % FCS gewaschen. Anschließend wurde der Pilz bei -20 °C gelagert.
5.2 Wachstumsexperiment
RAD ist bekannt als Antimykotikum. Mit diesem Versuch sollte nachgewiesen werden,
inwieweit RAD in der eingesetzten Konzentration (10 nM) auf A. fumigatus toxisch wirkt.
Dazu wurden 2 × 10 7 kurze Keimschläuche von A. fumigatus angezogen und in 1 ml weißem
(= ohne Phenolrot) RPMI-Medium aufgenommen. Anschließend wurden die Keimschläuche
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