Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg

5 Methoden
Bei jeder Messung wurde ein Kalibrator mitgeführt, der mit den jeweiligen Proben verrechnet
wurde. Der Kalibrator war cDNA, die aus stimulierten Zellen hergestellt wurde. Für jedes
analysierte Gen musste die PCR-Effizienz bestimmt werden. Dazu wurde die Kalibrator-
cDNA in vier Schritten 1 : 5 verdünnt. Von der Ausgangs-cDNA wurde eine Probe
vermessen, von der ersten Verdünnung Duplikate, von der zweiten Triplikate. Dieses Schema
wurde bis zur vierten Verdünnung weiterverfolgt. Aus der Steigung der Regressionsgeraden
zu diesen Punkten ließ sich der Slope ablesen. Daraus konnte die Effizienz der Primer mit
folgender Formel berechnet werden:
Effizienz = 10 (-1 / slope) – 1
Da die Effizienz der PCR-Läufe gleich war, konnte die relative Expression über die ΔΔCT-
Methode berechnet werden:
relative Expression = 2 – (ΔC T sample – ΔC T h-ALAS) = 2 – ΔΔC T
Das erste Δ entsteht durch die Differenz zwischen der eigentlichen Probe und dem Kalibrator,
das zweite Δ durch die Normalisierung mit dem Housekeeping Gen.
5.7.5.2 Durchführung im StepOnePlus
Im StepOnePlus wurde mit TaqMan ® Gene Expression Assays von Applied Biosystems
(Foster City, USA) gearbeitet. Die Primer- und Sondensequenzen wurden von der Firma nicht
bekannt gegeben. Es handelte sich hierbei um Hydrolyse-Sonden, die ebenso auf FRET
basieren. Am 5'-Ende der Sonde befand sich ein Quencher (TAMRA), am 3'-Ende ein
Reporter-Fluoreszenzfarbstoff. Hybridisierte die Sonde in der Annealing Phase der PCR nun
am komplementären DNA-Strang, hydrolysierte die Taq-Polymerase mittels ihrer 5'-3'-
Exonuclease Aktivität die Sonde am 5'-Ende. Dadurch entfernten sich Quencher und
Fluorophor voneinander, und es konnte eine Fluoreszenz abhängig von der synthetisierten
DNA vermessen werden. Die Durchführung der PCR erfolgte strikt nach Herstellerangaben.
Zur Validierung der Microarrays wurden 25 ng aRNA eingesetzt und folgende
Zyklusbedingungen angewandt:
Denaturierung: 10:00 min bei 95 °C
Hauptamplifikationsschritt: 40 Zyklen mit je
Denaturierung 0:15 min bei 95 °C
Annealing / Elongation 0:09 min bei 60 °C
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