Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg

5 Methoden
EBM-2 (+10 %FCS) gegeben wurde. Am 7. Tag erfolgte der eigentliche Versuch. Dazu
wurden 6-Tage alte moDCs oder 1-Tag alte mDCs geerntet und auf eine Konzentration von
2,5 × 10 6 / ml gebracht. Diese wurde entweder 1 : 1 mit EBM-2-Medium (+ 10 % FCS) für
den unstimulierten Ansatz oder mit frisch ausgekeimten, kurzen Keimschläuchen
(2,5 × 10 6 / ml in EBM-2 + 10 % FCS) für den stimulierten Ansatz vermischt. Nach einem
erneuten Umsetzen der Membranen in 600 µl frisches EBM-2-Medium wurden 200 µl der
Zell- / Pilzsuspension in die Membranen gegeben. Nach 0 h, 3 h oder 6 h Inkubation wurden
die Zellen in 1 ml HBSS hinein geerntet. Die HPAEC wurden getrennt von den A-549 +
moDCs / mDCs gesammelt. Es wurden jeweils zwei Ansätze gepoolt, um die Ausbeute zu
erhöhen. Daraufhin wurden die Zellen abzentrifugiert (5 min, 300 × g) und sofort mit
RLT-Puffer (+ 1 % Mercapthoethanol) (Qiagen, D) lysiert. Die RNA konnte direkt im
Anschluss isoliert oder das Zelllysat bei -80 °C eingefroren werden (siehe 47).
5.6 Microarray-Analyse
Die aus 5.5 gewonnene RNA wurde mit einem home-made Microarray analysiert. Es wurden
117 Gene für Zytokinantwort und Rezeptoren, die als immunrelevante Gene ausgewählt
wurden, mittels Sonden (55-70-mere in Antisense-Orientierung) der Firma Operon detektiert.
Frau Dr. Hauser vom Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB) der
Frauenhofer-Gesellschaft in Stuttgart leistete Beratung bei Auswahl und Design der Sonden.
5.6.1 Amplifikation der RNA
Die Qualität der isolierten RNA (5.7.3) wurde am Bioanalyzer mit dem Agilent RNA 6000
Nano Kit (Agilent, D) im Labor von Dr. Susanne Kneitz (Institut für Virologie und
Immunologie, Würzburg) überprüft. Damit die RNA mittels Microarray detektiert und
analysiert werden konnte, musste sie amplifiziert werden. Zuerst wurden 300 ng der isolierten
RNA in cDNA umgeschrieben. Im nächsten Schritt wurde ein zweiter Strang an die cDNA
synthetisiert. Da für die folgende in vitro Transkription durch eine T7-RNA-Polymerase eine
bestimmte Erkennungsstelle an der dsDNA gebraucht wurde, wurde dieser Strang mit T7
Oligo(dT) Primern synthetisiert, die eine Verlängerung aufwiesen, die einen Promoter für die
T7-RNA-Polymerase bildete. Nachdem die dsDNA aufgereinigt wurde, ließ man die T7-
RNA-Polymerase antisense RNA (aRNA) herstellen, welche erneut aufgereinigt wurde. Die
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