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5 Methoden
Abbildung 5.1: Gitternetz der Neubauer-Zählkammer. (Modifiziert nach: http://elearning.studmed.unibe.ch/hemosurf_demo/Lab-Images/chambre_scheme.jpg)
5.3.4 Isolation von CD14 + -Zellen
Aus den vorher gewonnen PBMCs (5.3.1) können CD14 + -Zellen, die zu 95 % aus Monozyten
bestehen, isoliert werden. Dazu wurde ein System mit magnetischen MicroBeads angewendet,
an die ein α-CD14-Antikörper gekoppelt war. Dieser Antikörper heftet sich an CD14 + -Zellen,
die dann auf eine Säule, die sich in einem magnetischen Feld befand, gebracht wurden. Die
CD14 + -Zellen bleiben in der Säule hängen, während die ungelabelten Zellen – hauptsächlich
Lymphozyten – durchfließen. Nachdem die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt
worden ist, können die CD14 + -Zellen eluiert werden.
Es wurden für die Durchführung der Isolation pro benötigte LS-Säule 2,5 × 10 8 PBMCs in
850 µl kaltem HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) aufgenommen und 15 min mit 150 µl
α-CD14-MicroBeads bei 4 °C inkubiert. Anschließend folgte ein Waschschritt mit 20 ml
HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) und eine Zentrifugation bei 300 × g, 10 min und 4 °C.
Das Zellpellet wurde aufgeschabt, um die Zellen zu vereinzeln, und erneut in 1 ml HBSS
(+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) resuspendiert. Für einen optimalen Durchfluss war es nötig,
eine Einzelzellsuspension herzustellen, da Zellklumpen die Säule verstopfen können. Zuvor
wurden die benötigten LS-Säulen in den Magnethalter gespannt und mit 3 ml HBSS (+ 2 mM
EDTA, + 1 % FCS) befeuchtet. Jetzt konnten die Zellen auf die Säulen gegeben und dreimal
mit je 3 ml HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 % FCS) gewaschen werden, jedes Mal wenn sich das
Reservoir der Säule komplett geleert hatte. Die positiv selektierten Zellen wurden nach
Entfernen der Säule aus dem Magnethalter mit Hilfe von 2 ml HBSS (+ 2 mM EDTA, + 1 %
FCS) und dem mitgelieferten Stempel aus der Säule in ein 15 ml Falcon-Röhrchen gedrückt.
Daraufhin wurde die Zellzahl bestimmt (5.3.3).
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