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5 Methoden
Appendix D: Optional On-Column DNase Digestion with the RNase-Free DNase Set
eingefügt und das Wasser für die Elution auf 50 °C vorgewärmt.
Zur Bestimmung der Konzentration der gereinigten RNA bzw. DNA wurde eine Messung am
NanoDrop (PeqLab, D) durchgeführt. Für die Messung wurden 1 – 2 µl der gelösten RNA
bzw. DNA unverdünnt eingesetzt. Da die Basen als Nucleosidmonophosphate ihr
Absorptionsmaximum bei 260 nm haben (mit Ausnahme von 5'-CMP bei 280 nm) wurde die
Wellenlänge von 260 nm zur Berechnung der Konzentration verwendet. Die Wellenlängen
230 nm und 280 nm wurden verwendet, um sich ein Bild über die Reinheit der isolierten RNA
zu machen. Liegt der Quotient 260 nm / 280 nm bei 1,8 für DNA oder 2,0 für RNA ist die
gewonnene DNA oder RNA frei von Proteinkontaminationen, liegt der Quotient
260 nm / 230 nm bei 2,0 ist die gewonnene DNA oder RNA frei von
Zuckerverunreinigungen.
5.7.4 Reverse Transkription
Zum Umschreiben von RNA in cDNA wurde das QuantiTect Reverse Transcription Kit
(Qiagen, D) verwendet. Pro Ansatz wurden 500 ng RNA, die in 12 µl RNase freiem Wasser
gelöst war, zu 2 µl gDNA-Wipeout Puffer gegeben. Daraufhin folgte eine 5 min Inkubation
bei 42 °C mit anschließender Abkühlung auf Eis. In diesem Schritt wurde eventuell in der
RNA vorhandene genomische DNA verdaut. Für die Umschreibung der RNA in cDNA
wurden folgende Substanzen zu der RNA gegeben:
1 µl Quantiscript Reverse Transcriptase
4 µl Quantiscript RT Buffer
1 µl RT Primer Mix
Die Reaktion wurde in 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäßen im Mastercycler ep (Eppendorf, D) mit
folgendem Programm durchgeführt:
Step 1: 55 min bei 42 °C
Step 2: 3 min bei 95 °C
Step 3: ∞ bei 4 °C
Die gewonnene cDNA wurde für kurze Lagerung bei 4 °C aufbewahrt, für längere
Lagerzeiten bei -20 °C.
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