Dokument 1.pdf - OPUS - Universität Würzburg

5 Methoden
mit 0,1 mg Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) 15 min bei 37 °C angefärbt. Es folgten
mindestens 5 Waschschritte mit weißem RPMI-Medium (2000 × g, 2 min), bis keine
gelbliche Färbung des Mediums durch FITC mehr erkennbar war. Je 2 × 10 6 gefärbte
Keimschläuche wurden in 50 µl farblosem RPMI-Medium mit RAD (10 nM) bzw. mit EtOH
(10 -4 % ig) als Kontrolle 2 h bei 37 °C inkubiert. Durch Zentrifugation (5 min, 120 rpm) in
einer Zytospinzentrifuge wurden die Keimschläuche auf Objektträger gebracht und sofort mit
3,7 % Formaldehyd 20 - 30 min fixiert. Die Fixierlösung wurde mit 1 × PBS abgewaschen.
Nachdem der Objektträger an der Luft getrocknet war, wurde mit einem Tropfen Fluoprep ein
Deckglas fixiert. Am nächsten Tag folgte die Analyse am Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, D).
Es wurde der Durchlicht- und der GFP-Kanal aufgenommen. Da die anfängliche Länge der
Keimschläuche grün fluoreszierte, der weitergewachsene Teil hingegen nur im Durchlicht
erschien, konnte die Länge des gewachsenen Teils mittels AxioVision Software vermessen
werden. Pro Ansatz wurden 80 - 100 Keimschläuche vermessen. Das Wachstum wurde mit
folgender Formel ermittelt:
Wachstum [%] = Länge (ungefärbter Teil) × 100 / Länge (fluoreszierender Teil)
5.3 Primärzellen
Bei der gesamten Aufreinigung von Zellen wurde immer mit gekühlten Lösungen gearbeitet.
5.3.1 Isolation von PBMCs
Zur Isolation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs, peripheral blood
mononuclear cells) wurden Leukozyten-Reduktions-System Kammern (LRSCs,
leukoreduction system chambers) (Dietz et al., 2006), die ein Leukozytenkonzentrat von
freiwilligen, gesunden, humanen Spendern enthielten, aus der Transfusionsmedizin des
Uniklinikums Würzburg verwendet. Zu dem 10 ml Konzentrat wurden 90 ml HBSS (+ 2 mM
EDTA + 1 % FCS) gegeben und gemischt. Jeweils 25 ml der Lösung wurden langsam auf
20 ml des Kohlenhydrat-Polymer FICOLL ® (ρ = 1,077 g / ml) geschichtet und für 20 min bei
800 × g ohne Bremse zentrifugiert. Diese Dichtegradientenzentrifugation bewirkte, dass sich
die mononukleären Zellen, die sich hauptsächlich aus Lymphozyten und Monozyten
zusammensetzten, in der Interphase sammelten. Die Erythrozyten und die polymorphkernigen
Leukozyten mit ihrer höheren Dichte hingegen setzten sich unten ab. Mit Hilfe einer
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